方法論記事

メカノトランスダクション駆動型ヒト様肥厚性瘢痕のマウスモデル

DOI：

10.3791/67156

⸱

2024年11月29日

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1Department of Surgery, University of Arizona, 2Department of Biomedical Engineering, University of Arizona

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルでは、ヒト様の瘢痕化をシミュレートするための機械伝達シグナル伝達を増加させる肥大性瘢痕マウスモデルを確立する方法について説明します。この方法では、マウスの治癒切開部全体の機械的張力を高め、特殊なデバイスを使用して再現性のある過剰な瘢痕組織を作成し、詳細な組織学的およびバイオインフォマティクス分析を行います。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肥厚性瘢痕化(HTS)は、過剰な瘢痕組織の形成をもたらす創傷治癒の異常なプロセスです。過去10年間で、私たちはメカノトランスダクション(機械的刺激を細胞応答に変換すること)が過剰な線維性瘢痕治癒を促進することを実証してきました。ヒト様肥厚性瘢痕を評価するマウスモデルは、さまざまな治療法とその瘢痕化を軽減し、治癒を改善する能力を調べるための不可欠なツールとなるでしょう。具体的には、当研究室では、ヒト様HTSを促進するために機械的負担を増加させるマウス創傷モデルを開発しました。このプロトコルは、修正された 13 mm 口蓋拡張器から作られた生体力学的負荷装置を利用しており、その腕は切開部の両側に配置され、治癒中に創傷床全体に連続的な張力を加えるために徐々に気を散らします。約20年の使用を通じて、このモデルは有効性と再現性を向上させるために大幅に進歩してきました。マウスHTSモデルを使用すると、顕著な真皮線維性瘢痕を組織学的にヒトの肥厚性瘢痕に匹敵するように誘導できます。このマウスモデルは、HTSの治療に関与する生物製剤や、異物反応などのメカノトランスダクション関連疾患を開発するための環境を提供します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

創傷治癒は、体が損傷した組織を修復し、皮膚バリアを再構築しようとするプロセスであり、止血、炎症、増殖、およびリモデリングのプロセスが不規則である場合、非定型治癒をもたらす可能性があります1。肥厚性瘢痕化(HTS)は、不規則な創傷治癒の一例であり、損傷部位での細胞外マトリックスおよび結合組織の過剰な沈着を特徴とする結果、拡大した瘢痕組織領域1,2,3が形成される。関節の周りや顔など、機械的なストレッチ刺激を繰り返し受ける体の領域は、HTSや線維症を発症する傾向があります4,5,6,7,8,9,10。私たちと他の人々は、創傷床を横切る機械的伸張が、機械的刺激の細胞応答への変換である機械伝達経路の活性化を通じてHTS形成を促進することを示しました9,11。

HTSは、複雑な生物学的プロセスを伴うだけでなく、影響を受ける人々にとって重大な社会的、医学的、経済的課題ももたらします。影響を受けた個人は、特に傷跡が顔や手1,9,10,12のような目に見える領域にある場合、自尊心とうつ病に苦しむことができます。科学的なレビュー記事によると、HTSの有病率は米国で32%から72%の間で変動しています10,13。これらの審美的な懸念の深刻さは、特に顔面領域に深刻な火傷を負った場合、外観を改善するための完全な顔面移植の症例数の増加によって強調されています10。これらの瘢痕は、動きを制限することによって機能障害を引き起こすこともあり6,14、瘢痕を切除し可動性を回復するためには外科的介入がしばしば必要となる10。HTS治療の費用は、手術、治療、理学療法、さらには長期介護の費用など、かなりの額になる可能性があります1,10。米国だけでも、HTSの治療にかかる年間費用は40億ドルを超えています10。

HTSの蔓延性とその合併症に対処するために取られた極端な措置を考慮すると、従来の治療法(例えば、外科的切除、コルチコステロイド注射、およびレーザー治療)は依然として非常に変動しやすいままです1,2,15,16,17。これらの治療法は場合によっては緩和を提供できますが、瘢痕病理の複雑な性質のために不十分な場合があります。個人間の遺伝的差異やHTSを引き起こすメカニズムの不完全な理解などの要因により、治療戦略は臨床的に不十分なままである18,19,20。HTS療法の未来は、HTSの細胞機構ドライバーを標的とする新しい革新的なアプローチにあるようです。例えば、メカノトランスダクション11,21は、過剰な線維性瘢痕治癒を促進することが広く実証されています5,6,7,8,11,21,22,23,24。25.具体的には、創傷の機械的負担を増加させてヒト様HTSを促進するマウスモデルを以前に開発しました9。しかし、20年近く使用した後、モデルは有効性と再現性を向上させるために大幅に進歩しました。このプロトコルにより、研究者は更新および最適化されたHTSマウスモデルを最大限に活用して、過度の瘢痕化の背後にある細胞集団とドライバーを探索できます。この方法の全体的な目標は、マウスにヒトのような肥大性瘢痕を作り出すように設計されたプロトコルを研究者に提供することです。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

すべての実験について、アリゾナ大学動物管理委員会(IACUC)の承認を得ました(管理番号:2021-0828)。このプロトコルは、15週齢のC57BL/6J雄マウスを使用しますが、他の年齢や系統にも適用できます9,26。

1. HTSバイオメカニカルローディングデバイスの作成

注:口蓋エキスパンダーのHTSデバイスへの変更は、実験の前の任意の時点で行うことができます。

  1. 未変更の口蓋エキスパンダーを取り、 図1A、Bに準拠した仕様でメイカースペースコアまたは製造コアに提示します。
    注: メイカースペースまたは製造用コアがない場合は、次の手順に進みます。
  2. ミニユニバーサルベンダー(MUB)ワイヤー曲げツールを使用して、 図1A、Bの仕様に準拠するように口蓋エキスパンダーを変更します。
  3. 図1Aに示すように、デバイスを表面に平らに置きます1。
  4. 図1Aに示すように、デバイスがMUBと平らになったら、アームを上腕で90°上に曲げ、下腕を2°下に曲げます。アームがデバイスの本体と完全に平行になった表面に平らに置いたときのデバイスの外観については、図1A3を参照してください。
  5. 図1Aに示すように、各アームを点線の軸に沿って90°ページに戻します。曲げた後のデバイスについては、図1A5を参照してください。

2. 術後0日目の脱毛と初期切開(POD 0)

注:手術前にいくつかの手術器具のセットを清掃し、オートクレーブ処理します(例:解剖はさみ、メス、アドソン鉗子、ニードルドライバー)。滅菌済みの5-0縫合糸を使用できるように準備し、サージカルマーカーを手元に用意します。

  1. 70%エタノールスプレーで手術スペースを清掃します。
  2. 35°Cにセットしたヒーティングパッドを術前準備テーブルの上に置きます。加熱パッドの上に吸収パッドをテープで留めます。前のパッドの上に別の吸収パッドを置きます(剃った髪を集めるため)。麻酔コーン(またはコーン)を吸収パッドにテープで固定します。
    注意: [オプション]ベンチトップヒューム抽出器が利用可能な場合は、コーンをワークスペースの近くに置き、吸引をオンにします。
  3. マウスが静かに呼吸するまで(2〜3分)、1〜3%イソフルランと2L / minの酸素流でマウスを麻酔導入チャンバーに入れます。
  4. 各マウスの鼻をノーズコーンの開口部に挿入し、1〜3%イソフルランと2 L /分の酸素で構成される麻酔を吸入できるようにします。つま先をつまんでも反応しないことで、適切な麻酔を確認します。マウスの目に眼科用潤滑軟膏を塗布します。
  5. 図1Cに示すように、電気カミソリを使用して、その領域の背側の毛を剃ります。
  6. 脱毛ペーストを手袋をはめた指または綿棒で皮膚に塗り、剃った部分を覆います。45秒後、ペーストをガーゼで拭き取り、次にアルコール綿棒で拭き取ります。別のアルコール綿棒で背側を拭いて脱毛ペーストを取り除き、無毛のパッチを残します(図1C)。
    注意: 適度な量のペーストを使用し、ペーストをすぐに取り除き、ペーストを取り除いた後にマウスを拭いて、脱毛ペーストによる皮膚の火傷を防ぐことが重要です。マウスの皮膚は薄いため、急速な化学火傷を負いやすく、マウスの健康と実験の質の両方に悪影響を与える可能性があります。
  7. 識別のためにマウスに耳標を付けます。
  8. 毛を取り除いたら、マウスをケージに戻して、イソフルランへの過度の曝露を防ぎます。マウスを監視します。
  9. 髪の毛で覆われた上部の吸収パッドを取り外して、手術前の叱咤激励作業面をきれいにします。
  10. 独立した外科作業エリアを設置します。35°Cにセットした加熱パッドを手術台の上に置きます。加熱パッドの上に吸収パッドをテープで留めます。麻酔コーン(またはコーン)を吸収パッドにテープで固定します。
  11. マウスが静かに呼吸するまで(2〜3分)、2〜4%のイソフルランと2L / minの酸素流でマウスを麻酔導入チャンバーに入れます。
  12. マウスを誘導チャンバーから取り出し、操作面に置きます。各マウスの鼻をノーズコーンの開口部に挿入し、1〜3%イソフルランと2 L /分の酸素で構成される麻酔を吸入できるようにします。つま先をつまんでも反応しないことで、適切な麻酔を確認します。マウスの目に眼科用潤滑軟膏を塗布します。
  13. 術後の痛みの治療のために、21 G針を使用して0.05 mg / kg徐放性ブプレノルフィンを肩に皮下注射します。.
  14. マウスの背部を、ヨウ素/クロルヘキシジンベースのスクラブとアルコールスワブを交互に3回繰り返して消毒します。手術用マーキングペンと定規を使用して、 図1Dに示すように、全層切開が行われる背側正中線に2cmの線をマークします。
  15. メスまたは解剖はさみ(外科的好み)を使用して、マークされた領域全体に全層の背側正中線を切開します。
    注意: 図1Dに示すように、下にある組織(筋肉など)を切断しないように注意してください。
  16. 単純な中断パターンで5-0縫合糸を使用し、 図1Dに示すように創傷を二等分して切開を閉じます。少なくとも5つの等間隔の縫合糸を使用してください。
  17. テルファのガーゼは3cm×1cmにカットします。それを発泡スチロール接着剤の包帯の中央に置き、 図1Dに示すように、ガーゼが切開部を覆うようにマウスの背に粘着性包帯を置きます。腹部に半分にした包帯を敷き、背側包帯と出会うまで円周方向に包みます。
  18. 包帯が完了したら、マウスを別の滅菌ケージに入れ、麻酔薬から完全に回復するまでマウスを監視します。
  19. 実験グループに関係なく、すべてのマウスでこの手順を繰り返します。次のステップの前に、次の4日間で切開を治します。

3. HTSバイオメカニカルローディングデバイス(POD 4)の配置

注:手術前に、HTSデバイスといくつかの手術器具のセット(解剖はさみ、メス、アドソン鉗子、ニードルドライバー、スキンステープラー、スキンステープルなど)を清掃してオートクレーブします。滅菌済みの5-0縫合糸を調製して使用します。[オプション]ベンチトップヒューム抽出器が利用可能な場合は、コーンをワークスペースの近くに置き、吸引をオンにします。

  1. ステップ 2.1 と 2.2 で説明したように、手術領域を準備します。
  2. マウスに麻酔をかけ、手順2.11-2.13に従って鎮痛剤を提供します。
  3. 鉗子またはニードルドライバーを使用して、ツールを腹側に対して左右に動かして、ドレッシングをマウスの腹部から分離します。ツールをラップと皮膚の間に残してドレッシングを皮膚から持ち上げ、はさみを使用してドレッシングを切り取ります。
    注意: マウスの皮膚を切ったり、ドレッシングをはがしたり、治癒切開を妨げたりしないように注意してください。
  4. アルコール綿棒で背部を清掃します。切開部に創傷の裂開や感染の兆候がないか調べます。
  5. 図1Bに示すように、HTSデバイスが拡張/拡張されておらず、最も縮小された形式になっていることを確認します。デバイスのアームを医療用接着剤で軽くコーティングします。
  6. 片手で、マウスの背側の皮膚を横方向にわずかにピンと張らせます。一方、切開部がHTSデバイスの各アームから等距離になるようにHTSデバイスをマウス背部に置き、それによってデバイスを切開部の中央に配置します。HTSデバイスのアーム間の皮膚が均一にぴんと張っていることを確認してください。 図2Aに示すように、接着剤が乾くまで(~30秒)、デバイスを所定の位置に保持します。
    注意: 皮膚を均一に張り詰めておくことは、デバイスで切開部に均等な張力がかかるようにするために重要です。このプロセス中に縫合糸をそのままにしておくと、デバイスを配置するプロセスによって皮膚に機械的な張力が加わり、治癒切開が再び開く可能性があります。縫合糸は、傷口が閉じたままであることを確認するために、ストレッチの初日まで所定の位置に留まります。
  7. 図2Bに示すように、各腕の周りと皮膚を通して4つの縫合糸を固定します。縫合中は、針が切開部に向かって皮膚から出ていることを確認してください。
    注意: デバイスの切開側から針を挿入すると、皮膚に穴を開けるために必要な力のために、切開部が裂けて開くことがあります。
  8. 次に、 図2Bに示すように、腕の周りと皮膚を通して3つの皮膚ステープルを配置し、HTSデバイスを皮膚に固定します。
  9. 手順2.17および2.18に従ってマウスに包帯を巻きます。
  10. 実験グループに関係なく、すべてのマウスでこの手順を繰り返します。
    注:すべてのマウスは同じ準備を受けます。ただし、実験計画におけるマウスの不偏分布を確保するために、各実験グループ(コントロール、ストレッチなど)にランダムに割り当てられます。具体的には、コントロールマウスとストレッチマウスの両方に、デバイスを背部に取り付けます。コントロールマウスのデバイスは手つかずのままですが、ストレッチマウスは次のステップを経ます。

4. HTSバイオメカニカルローディングデバイス(POD 5)の初期ストレッチ

注:手術前に、いくつかの手術器具のセット(解剖はさみ、メス、Adson鉗子、ニードルドライバーなど)を清掃してオートクレーブします。[オプション]ベンチトップヒューム抽出器が利用可能な場合は、コーンをワークスペースの近くに置き、吸引をオンにします。

  1. 耳タグを介して各マウスを目的のグループにランダムに割り当てます。対照マウスの場合は、切開部の縫合糸を取り外し、創傷の包帯を交換するだけです(ステップ1〜6、次に8〜9)。必要に応じて、ストレッチ時にデバイスを取り外し、傷跡のサイズを追跡するためのスケール用の測定器具で写真を撮ります。
  2. 手術部位を準備し、マウスに麻酔をかけ、手順3.1〜3.4を実行してドレッシングを取り外します。
    注意: ドレッシングをはがしたり、治癒切開を妨げたりしないように注意してください。HTSデバイスのアームが皮膚から外れた場合は、軽く接着して元の位置に戻し、剥離のサイズに応じて皮膚ステープルまたは縫合糸を追加します。
  3. 解剖ハサミまたは他の選択した方法で傷口から縫合糸を取り除きます。
  4. 図2Cに示すように、HTSデバイスキーをデバイスに挿入し、皮膚がぴんと張っているが皮膚が裂けるリスクがなくなるまで、回してデバイスを拡張します。
    注:この最初の気晴らしは、デバイスのアーム間の皮膚が緩んでいる可能性があるため、キーを約4〜8回回す必要があります。
  5. 手順2.17と2.18を実行してマウスに包帯を巻きます。

5. HTS生体力学的ローディングデバイス(POD 7、9、11、13、15、17)のその後のストレッチ

注:手術前に、いくつかの手術器具のセット(解剖はさみ、メス、Adson鉗子、ニードルドライバーなど)を清掃してオートクレーブします。[オプション]ベンチトップヒュームエクストラクターが利用可能な場合は、コーンをワークスペースの近くに置き、吸引をオンにします。

  1. 対照マウスの場合は、単に創傷の包帯を交換するだけです(ステップ1〜5、次にステップ13〜14)。必要に応じて、ストレッチ時にデバイスを取り外し、瘢痕のサイズを追跡するためのスケール用の測定器具で瘢痕の写真を撮ります。
  2. 手術部位を準備し、マウスに麻酔をかけ、手順3.1〜3.4に従ってドレッシングを取り外します。
    注意: HTSデバイスのアームが皮膚から外れた場合は、アームを所定の位置に接着し、剥離のサイズに応じて皮膚ステープルまたは縫合糸を追加します。
  3. HTSデバイスキーをデバイスに挿入し、皮膚がぴんと張っているが皮膚を引き裂くリスクがなくなるまで、デバイスを回して拡張します。
    注:これには約4回転、または~2mmの気を散らす必要があります。デバイスが最大延長に達し、これ以上延長できない場合は、手順 5.4 から 5.7 を実行して離陸し、新しいデバイスを再接続します。それ以外の場合は、手順2.17と2.18を実行してマウスに包帯を巻きます。
  4. デバイスが最大延長に達した場合は、ステープルリムーバーでステープルを取り外すか、ステープルの突起をこじ開けてハサミでマウスの背部からデバイスを取り外します。次に、縫合糸を取り外し、デバイスを慎重に取り外します。
  5. メス、アルコール綿棒、ペーパータオルでデバイスを清掃します。デバイスを70%エタノールに~20分間浸して、クリーニングを助けます。次に、キーを使用してデバイスを最も薄い形に収縮させます。
  6. 手順3.5〜3.8に従ってHTSデバイスを再接続します。
  7. 手順2.17および2.18に従ってマウスに包帯を巻きます。

6. HTS組織の採取(POD 19)

注:組織の採取は、プロセスのどの時点でも行うことができます。私たちは、初期の時点を調べるために、わずか4日間のストレッチ後に組織を採取しました。しかし、組織を最も一貫して採取するのはPOD 19(菌株開始から2週間後)です。手術前に、いくつかの手術器具のセット(解剖はさみ、メス、アドソン鉗子など)を清掃してオートクレーブします。経時的に傷跡の写真を撮るには、各ストレッチステップの前にデバイスを取り外して、デバイスを再度適用して機械的負担を再開する前に傷跡の写真を撮ることができます。[オプション]ベンチトップヒューム抽出器が利用可能な場合は、コーンをワークスペースの近くに置き、吸引をオンにします。ベンチトップヒューム抽出器は、イソフルランガスが使用されなくなったときにオフにすることができます。

  1. 手術部位を準備し、マウスに麻酔をかけ、手順3.1〜3.4に従ってドレッシングを取り外します。
  2. 頸部脱臼を介してマウスを犠牲にします。
    注意: 皮膚を引っ張ったり、マウスの背部を引き裂いたりしないように注意してください。
  3. 解剖ハサミまたは皮膚ステープルリムーバーを使用して、皮膚ステープルを取り除きます。縫合糸を切断します。皮膚を引き裂かないように注意しながら、HTSデバイスをそっと取り外します。
  4. メスまたはハサミを使用して、HTSの傷跡の周囲の皮膚を切ります。組織学的分析のために、希望の方法で皮膚を保存します。
    注:皮膚をトランスクリプトームまたはタンパク質分析(qPCR、ウェスタンブロット、シングルセル分析など)に使用する場合は、周囲の健康な組織の量を最小限に抑えるために、HTS瘢痕組織のみを切除してください。これにより、分析が瘢痕組織のみを捕捉することが保証されます。
  5. HTSデバイスをメスできれいにこすり落とします。70%エタノールを入れたビーカーにデバイスを置き、残っている接着剤や組織を柔らかくします。
    注:70%エタノールに浸した後、オートクレーブする前に、デバイスをさらに拭き取り、こすり落とし、クリーニングする必要がある場合があります。

7.平均瘢痕幅の測定

注:これは画像解析ソフトウェアImageJを使用して実現され、情報はスプレッドシートに記録されました。

  1. ImageJで画像を開きます。 ポリゴン ツールで傷跡のエッジをトレースします。 [分析] | [測定 ] をクリックして、この領域を測定します。
    注:瘢痕は、その変色と毛包の欠如によって識別できます。
  2. セグメントツールを使用して、傷跡の端から端までの長さを測定します。この長さを測定するには、[分析] | [測定] をクリックします。
  3. セグメントツールを使用して、写真内の1cmまたはその他の標準化された長さの単位の長さを測定します。この長さを測定するには、[分析] | [測定] をクリックします。
  4. スプレッドシートを使用して、 傷跡の面積 (ピクセル単位; px) を取得し、それを 傷跡の長さ (px の長さ) で割ります。その結果、平均傷跡の幅がピクセル単位で得られます。
  5. その結果を 、測定された長さの標準単位 (px length)で割ります。結果は、実験に使用された標準の長さ単位(cmなど)の単位での平均瘢痕幅になります。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HTSプロトコルの効果的な使用を明確に示し、成功した「肯定的な」結果を特定するために、図3Aに示すようにモデルが確立されました。代表的な研究では、図3B、Cに示すように、図3B、Cに示すように、切開部全体に人間のようなレベルの機械的ひずみが誘発されるNo Stretch Control(n = 6)とMechanical Stretch HTSグループ(n = 6)の2つのグループがありました。図3A-Cに示されている実験計画内で、POD5、9、15、および19の傷跡のグロス写真を撮影しました。瘢痕をImageJで追跡し、異なる時点における瘢痕の平均幅を分析しました(図3D)。平均瘢痕幅は、図3Eの時間およびグループ間でグラフ化されました。POD 5 で機械的ひずみを適用した後、Stretch Group は Stretch と Control の間で傷跡に大きな差がなかったため、Stretch Group は Control よりも有意に広い瘢痕を示し、POD 9 でピーク幅は 0.99 mm に達しました (p = 0.045)。この有意に大きい瘢痕幅は、対照群と比較して、POD 15 (p = 0.043) および 19 (p = 0.045) で継続しました。グロス撮影は、HTSデバイスを取り外す必要がある日(つまり、HTSデバイスが最大拡張に達し、再度取り付ける必要がある日、または摘出中に)にのみ撮影することをお勧めします。このプロトコルでは、複数の時点にわたる画像と瘢痕幅の分析により、モデルの創傷の進行を読者がより明確に把握できます。

HTS組織の分析は、線維性マーカーのIHC染色、組織学的瘢痕領域を調べるためのH&Eおよびトリクローム染色、瘢痕のコラーゲン構造を評価するためのピクロシリウス赤色染色、および創傷分析のための他の方法など、さまざまな方法で行うことができます。 8,21,24,25,27,28(図4)。図4は、隆起した瘢痕組織(図4A)、付属器構造と毛包の喪失(図4B)、機械的負荷の方向へのコラーゲン繊維の整列(図4C)、コラーゲンの渦巻き(図4F)など、HTS組織の組織学的特徴を示しています。図4は、マウスHTSの肥満細胞密度と血管系の免疫組織化学的染色も示し、それをヒトHTS組織と比較しています(図4D、E、G、H)。さらに、HTS瘢痕の解析は、切除直後に組織を採取し、調製し、バイオインフォマティクスコアに持ち込むことで、シングルセル解析で行うことができます。

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図1:HTSデバイスとマウスの背部の準備。(A) HTSデバイスを作成するための13mm口蓋エキスパンダーの改造プロセス、(1)初期エキスパンダー構造を示す、(2)デバイスが平らになったときにアームが上腕で90°上、下腕が下が曲がる、(3)アームがデバイス本体と完全に平行になった初期曲げの結果、 (4)測定で最終的なデバイスを形成するためのアームの曲げ。アームは、(5)最終デバイスに示すように、それぞれページに対して90°曲げる必要があります。 (B) 拡張されていない状態と拡張された状態の両方で、さまざまな角度から完全に組み立てられたHTSデバイス。 (C) マウスの背部を準備するための一連のステップ:(1)毛皮のある初期状態、(2)髭剃り後、および(3)脱毛ペーストの塗布後。 (D) 背側切開の作成手順:(1)切開部位に2cmのガイドラインで印を付け、(2)切開を行い、(3)傷を縫合し、(4)テルファガーゼを塗布し、(5)接着包帯で固定します。 (E) (1) 切開部、および (2) 切開部を縫合した後の閉じ方を総写真で撮影します。略語:HTS =肥厚性瘢痕。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:HTSデバイスの位置決めとストレッチ。(A) 切開部位との適切な位置合わせを確保するための、マウスの背部へのHTSデバイスの正しい配置の図。左の画像は、後方の位置から見たデバイスの配置を示しています。右の画像は、横向きに見たデバイスの配置を示しています。 (B) HTSデバイスの取り付けの図:(1)初期配置、(2)縫合糸の位置、(3)皮膚ステープルの位置。 (C) ラベル付きのHTSデバイスキーを使用してHTSデバイスを伸ばすデモンストレーション:(1)開始構成、(2)張力の適用、(3)肥大性瘢痕形成を促進するために治癒切開全体に一貫した機械的ひずみを加えるように設計された最終的な拡張状態、2mmの拡張が適用されます。 (D) HTSデバイスキーにラベルが付けられた、HTSデバイスに張力をかけたグロス写真。 (E) 完全に包帯を巻いたマウスの総写真。略語:HTS =肥厚性瘢痕。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:瘢痕を発症するための機械的ひずみの適用。(A) 切開(POD 0)の作成から機械的ひずみの適用(POD 4)、および伸張期間(POD 5からPOD 19)を経て、組織摘出(POD 19)に至るまでの実験手順のタイムライン。(B) 2つのグループの図:ストレッチコントロールなしとメカニカルストレッチHTSグループ。 (C) No Stretch Control群とStretch HTS群との間の組織応答の違いを示す断面図。 (D) 術後日 (POD 5、9、15、および 19) における No Stretch Control および Stretch HTS グループの瘢痕の代表的なグロス画像で、肥厚性瘢痕を黄色の点線でトレースしています。 (E) 経時的な平均瘢痕幅の定量的分析、ストレッチなし群とストレッチ群の間の瘢痕発達の有意差を示し、エラーバーは標準偏差を表しています。大きな違いがある場合は、アスタリスク (*) でマークされます。統計分析は、二元配置分散分析(ANOVA)を使用して実行されました。*p < 0.05 の値は統計的に有意であると考えられました。略語:HTS =肥厚性瘢痕;POD = 術後の日。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:瘢痕の組織学。 このマウス瘢痕の組織型は、以前に発表された研究9,26で2週間の機械的ストレスの後に採取されました。(A) 大きい方の画像は、瘢痕断面のH&E組織学的画像画像を示しており、右下は瘢痕断面のトリクローム組織学的画像で、瘢痕領域がどのように隆起しているかを示しています。(B)大きい方の画像は、瘢痕断面のH&E組織学的画像診断を示し、右下は瘢痕断面のトリクローム組織学的画像であり、瘢痕領域が付属器構造と毛包の喪失をどのように示しているかを示しています。(C)大きい方の画像は、瘢痕断面のピクロシリウス赤色の画像を示し、右下は瘢痕断面のトリクローム組織学的画像で、機械的負荷の方向に整列したコラーゲン繊維を示しています。(D)大きい方の画像は、マウスHTS組織におけるCD117免疫組織化学のイメージングを示し、右下はヒト組織におけるCD117免疫組織化学のイメージングを示しており、ヒトHTS組織に匹敵する肥満細胞密度を示しています。(E)大きい画像は、マウスHTS組織における血管系のCD31免疫組織化学のイメージングを示し、右下はヒト組織におけるCD117免疫組織化学のイメージングであり、ヒトHTS組織に匹敵する肥満細胞密度を示しています。(F)右下の画像で成熟したヒト肥厚性瘢痕に見られるコラーゲンの渦巻きは、マウスH&Eイメージングの丸で囲まれた領域に24週間後に負荷をかけられたマウスの瘢痕にも見られます。(G)対照群(切開+ストレッチなし)、ストレッチコントロールグループ(切開なし+ストレッチ)、およびストレッチHTSグループの傷跡の代表的なグロス画像。(H)対照群(切開+ストレッチなし)とストレッチHTS群を比較した免疫組織化学反応を示す。線維性マーカーpEPF、aSMA、およびYAPをDAPIと共染色すると、HTSグループの線維性マーカーが増加します。A-Fは、Aarabi, S. et al.9から採用されています。G,HはMascharak, S. et al.FASEB26の許可を得て転載。略語:HTS =肥厚性瘢痕;H&E = ヘマトキシリンとエオシン;pEPF = エングレイル陽性線維芽細胞;aSMA = α-平滑筋アクチン;YAP = Yes-associated protein;DAPI=4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HTSマウスモデルは、メカノトランスダクションを介してHTSを誘導し、潜在的な治療法を開発するための費用対効果が高く再現性の高い方法です。モデルを効果的に使用するための初期学習曲線がありますが、プロトコルは、練習すれば、外科的トレーニングを受けなくても誰でも実行できます。このモデルを使用することで、研究者はHTSの形成と創傷治癒におけるメカノトランスダクションの役割をよりよく理解することができ、患者の創傷ケアに具体的な改善をもたらす可能性があります。このプロトコルに付随するビデオデモンストレーションは、理想的には研究者の学習曲線を短縮し、このモデルを将来の研究にスムーズに実装することを促進します。ただし、プロトコルには、ユーザーにとって明確さを高めるためにさらに説明することで恩恵を受ける可能性のある重要なステップがいくつかあります。

プロトコルの最初から時系列で進行する最初の重要なステップは、術後 0 日目 (POD 0) で外科的切開を閉じることです。切開部は、皮膚層が完全な位置にある状態で完全に閉じられることが不可欠です29。これは、切開部が適切に治癒し、デバイスを配置して傷全体に張力が誘発されると開かないようにするためです。創傷が開いた場合(裂開)、動物をさらなる実験に使用しないでください。

HTSデバイスをPOD 4に配置するときは、マウスの背側に均等に張力をかけることが重要です。デバイスを適切に配置すると、切開部全体にわたって加えられる張力が均一になり、実験結果が最適でない (不均一な瘢痕化) 可能性のある可変的な力が加えられるリスクが軽減されます。デバイスが正しく取り付けられていないと、切開部の一部は、HTSを誘発するために1日おきに平均2mmの気晴らしを均等に受け取らないことになります。デバイスの拡張により、皮膚のたるみが解消され、張り詰めた状態になるはずです。同時に、傷口が裂開する原因となる可能性のあるデバイスの過度の伸展を避けるように注意する必要があります。装置を数回の実験に使用すると、キーを伸縮するために置かれている回転ギアが緩む可能性があります。これが発生した場合は、新しいデバイスを作成し、古いデバイスを破棄する必要があります。

POD 5でひずみが開始されると、瘢痕予防を目的とした治療が開始されます。局所軟膏などの治療法は通常、切開部位に広がることによって緊張が開始されるときに1日おきに投与されます。ヒドロゲルも同様に切開部位の上に配置されます。全身療法は、尾静脈または眼窩後のいずれかで血流に注入できます。

POD 19の傷跡の周りのマウスの背部に剃るか、軽く脱毛ペーストを塗ることをお勧めします。これにより、ImageJによる瘢痕サイズの可視性とその後の分析が向上します。さらに、脱毛ペーストを使用する場合は、ペーストが少なく、時間が短い方で過ごしてください。マウスの背部がペーストに過度にさらされると、化学火傷を引き起こし、創傷治癒過程を妨げる可能性があります。マウスの皮膚は人間の皮膚よりも薄く、化学火傷を負いやすい30。

HTSマウスモデルは、ヒトの皮膚を利用していないため、ヒトのHTSを完全に再現できないため、本質的に制限されています。ただし、他の動物モデルに比べて物流上の利点がかなりあります。適切に実行されると、このマウスHTSモデルは信頼性が高く、安価で、簡単に実行できます。生物学的には、HTSは機械的シグナル伝達の物理的な増加によって誘導されます。ウサギのHTSの他のモデルは、熱的および化学的損傷30,31,32を使用して耳または背部にHTSを誘発します。ウサギの耳の腹側の皮膚は、軟骨細胞1,30のように、治癒中に皮膚細胞以外の多くの細胞を関与させません。別の方法は、ブタの皮に火傷HTSモデル33ですが、コストと取り扱いの点でロジスティック的に困難な場合があります。ブタモデルは、ヒトHTSの再現に最も似ていると思われます。ただし、初期結果を収集するにはコストのかかる方法です。最終的なHTSモデルは、切除されたヒトHTS皮膚をマウスに異種移植しているが、これは免疫応答を引き起こす可能性があり、新たな瘢痕の形成を探求していない34。

動物モデルでHTSを誘導する上記の方法は、ヒトのHTS瘢痕が形成されるのと同じように、体の自然治癒反応を適切に引き起こすものではありません。対照的に、メカノトランスダクションベースのマウスHTSモデルは、肥厚性瘢痕化を開始するために機械的なひずみを採用しており、ヒトのHTS1,9,21を密接に反映しています。この方法は、メカノトランスダクションシグナル伝達の生理学的プロセスに依存して、線維化の背後にある組織の生体力学と細胞集団ドライバーを捕捉します。このモデルは、メカノトランスダクション経路を阻害または誘導する生物学的標的の研究に最適であり、新しいトランスレーショナルセラピーの発見につながる可能性があります。

開示事項

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著者は、この記事の内容に関連する競合する利益やその他の対立はありません。

謝辞

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この研究は、国立歯科・頭蓋顔面研究所(U24 DE026914)(G.C.G)およびPlastic Surgery Foundation Translational Research Grant(837107)(K.C.)が支援するCenter for Dental, Oral, and Craniofacial Tissue and Organ Regeneration Interdisciplinary Translational Project Awardsの支援を受けました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
100 mL PYREX Griffin beakerMilipore SignmaCLS1000100
Aesculap Exacta mini trimmerAesculap
AutoClip SystemFine Surgical Instruments12020-00
BDブランド イソプロピルアルコールスワブFisher Scientific13-680-63
Buprenorphine SR (0.5 mg/mL)Buprenex, Indivior Inc.12496-0757-1
C57/BL6 メス (6–生後8週間)ジャクソン研究所000664
Covidien 滅菌ガーゼフィッシャーサイエンティフィック2187
Covidien TelfaTM 非粘着性パッドフィッシャーサイエンティフィック、コヴィディエン1961
歯科外科定規ダウェル デンタルプロダクツS1070
脱毛クリーム (ナイール ヘアリムーバー ローション)教会&ドワイト、CVS339823
エタノール70%溶液フィッシャーサイエンティフィック64-17-5
Excelマイクロソフト協力Microsoft.comソフトウェアプログラム 
ImageJImageJ, Wayne Rasbandimagej.netソフトウェアプログラム 
吸入麻酔システムVetEquip922130
虹彩はさみ 4½ ステンレス製McKesson43-2-104
イソフルラン、USPDechra 獣医製品17033-094-25
カカ インダストリアル MUB-1カカ インダストリアル 173207メイカースペースや製作所がない場合にのみ必要です 
レオーネ急速口蓋エキスパンダー - 13ミリメートル大湖歯科技術125-004デバイスを拡張し、cotnractするために必要なキーは、箱の液体
撥水ドレープ75 x 90センチメートルと接着穴6 x 9センチメートルオムニアS.p.A.12.T4362
Medequip Depot Silk Black Braided Sutr 6-0 RxMedequip Depot D707N, Fisher ScientificNCO835822
Needle holder 5 in. with serated jawsMcKesson43-2-842
Prism 9GraphPad Holdings, LLCgraphpad.comsoftware program 
Puralube点眼軟膏Dechra、NDC17033-211-38
RスタジオデスクトップRStudio PBCrstudio.comソフトウェアプログラム 
外科用皮膚マーカーMcKesson19-1451_BX
Tegaderm, 3 MVWR56222-191foam adhesive dressing 
サーモピープ加熱パッドK&H、アマゾン
ティッシュ鉗子4¾インチステンレス1 x 2歯ケソン43-2-775
トボンド(3メートル)セントポール、ミネソタ州1469SB
五マッベ

参考文献

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