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方法論記事

N-メチル-N-ニトロソ尿素誘発ラット網膜損傷のサンプリングと病理学的変化のマルチインデックス評価

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DOI:

10.3791/67159

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2024年9月13日

 ,  ,  ,  , 
1School of Nursing, School of Pharmacy, Key Laboratory of Hui Ethnic Medicine Modernization, Ministry of Education, Ningxia Medical University, 2Department of Critical Care Medicine, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、N-メチル-N-ニトロソウレアの腹腔内注射後の網膜の病理学的変化とアポトーシスを検出するための、ラット網膜サンプリングおよびヘマトキシリン-エオシン染色、TUNELアッセイ、およびウェスタンブロットの利用手順を説明しています。

要約

網膜症は、ほとんどの眼疾患および糖尿病の晩期合併症で観察できます。特定の色素上皮細胞と視神経細胞の損傷と変性が網膜症の主な特徴です。多くの伝統医学は、網膜症の治療において実質的な臨床効果を示しています。網膜を迅速かつ完全に取得する方法は、網膜症の治療のための伝統医学研究における重要なステップです。この研究では、N-メチル-N-ニトロソウレア (MNU) 誘発ラットの網膜損傷のサンプリングと病理学的変化のマルチインデックス評価のための標準化された運動可能な手順を提供することを目指しています。ラットに60 mg/kg MNUを腹腔内注射して網膜損傷を誘発し、7日後に網膜サンプルを採取した。さらに、網膜の病理学的変化を評価するためにヘマトキシリン-エオシン染色を行いました。TUNELおよびウェスタンブロットによるアポトーシス速度およびアポトーシスタンパク質の測定。網膜サンプリングと病理学的変化の評価のためのこれらの標準化されたプロトコルは、網膜症のメカニズムの探求と新規で効果的な伝統的なハーブの発見を促進するのに役立ちます。

概要

網膜色素変性症(RP)は、遺伝性の失明を伴う網膜疾患です1。RPの発生率は1/3500から1/5000の間で、世界の約250万人の視覚機能に影響を及ぼしています。ヒトの視覚障害につながる疾患として最もよく知られており、社会全体に大きな負担を強いています2。この疾患は、網膜色素上皮細胞の機能が徐々に失われ、光受容体の進行性アポトーシスを特徴としています。初期段階では、患者は夜盲症を経験し、それが末梢視野欠損として現れ、最終的には中心視力の喪失につながります3。したがって、網膜光受容体アポトーシスの阻害は、RPの予防と治療のポイントカットです。

網膜細胞のアポトーシスは、ヒトRPおよびモデル動物に共通する特徴です4。ラットに 60 mg/kg N-メチル-N-ニトロソウレア (MNU) を 7 日間腹腔内注射すると、アポトーシスと網膜光受容体細胞の喪失が誘発され、RP 5,6 の一般的に使用される動物モデルです。モデル動物における網膜組織の病理学的構造、特異的細胞アポトーシス、およびアポトーシス関連タンパク質発現の変化を解析することは、ヒトRPおよびスクリーニング薬物の病因を研究する上で効果的な実験データと理論的支持を提供することができる7,8。したがって、網膜標本の品質は実験データの信頼性を決定します。しかし、眼組織の特殊性のために、ラット網膜9を得る方法に関する報告は非常に少ない。

この論文では、上記の欠点を克服するために、ラットの網膜サンプリングのためのシンプルで高速、標準化された、操作可能な手順を提供します。ヘマトキシリン-エオシン染色(HE)、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介デオキシウリジン三リン酸-ジゴキシゲニンニックエンド標識(TUNEL)染色、およびウェスタンブロットを使用して、ラットの網膜組織損傷とアポトーシスの病理学的変化を解析します。すべての方法は、特定の運用プロセスに関する私たちの研究グループの経験から導き出されています。

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プロトコル

すべてのプロトコルと外科的処置は、寧夏医科大学の倫理委員会によって承認されました(倫理番号:NO.2020-Q066)。7〜8週齢、体重200〜220 gのSPF Sprauge-Dawley(SD)雄ラットを、寧夏医科大学から動物免許番号SCXK(Ning)2020-0001で購入しました。すべての動物は寧夏回族自治区医科大学の実験動物センターで飼育されました。温度と湿度は適切で、昼夜の光サイクルは維持され、食料と水は無料で十分でした。

1. 術前準備

  1. 材料の準備
    1. ラットプレート、吸入麻酔器、埋め込みボックス、凍結保存チューブ、使い捨て手術用手袋とマスク、広口ボトル、4%パラホルムアルデヒド、アイスパック、眼科用ハサミ、眼科用ピンセット、手術用刃物とナイフハンドル、1.5mLの微量遠心チューブを準備し、事前に滅菌してください( 材料の表を参照)。
  2. 動物の調理法
    1. 20匹の雄SDラットをモデルグループ(n = 10)とコントロールグループ(n = 10)にランダムに分けます。モデルラットに60 mg / kg MNUを腹腔内に注射し、対照ラットに同量の生理食塩水を腹腔内に注射します。.
    2. 注射の7日後、ラットを絶食させ、サンプリングの前夜に自由に飲ませます。
    3. 翌日、ラットの仰臥位を手術台に置き、マスクを使用して4%イソフルランと2L / min酸素を使用して麻酔を投与します。.足の中心をつまんで麻酔の深さを測定し、ラットの反応を観察します。

2. タンパク質因子検出のためのレチナールサンプリング

  1. 左手でラットの眼窩を固定し、眼科用曲げ鉗子を使用して右手で適度な力で眼球を切除します。眼球を冷たいガラス皿の矢状位置に置きます。
  2. 左手で眼科用ストレートピンセットを持って眼球を固定し、右手で手術用ブレードを保持した状態で、レンズ部位の近くに縦方向に2mmの切開を行います。
  3. 切開部に沿って眼ハサミで角膜を切り取り、水晶体、硝子体をそっと剥がし、アイカップを露出させます。
  4. アイカップの底を1.5mLの微量遠心チューブの先端に置き、アイカップをチューブの上にひっくり返して網膜を露出させます(網膜はうっすらと黄色になります)。
  5. 眼科用曲げピンセットで眼球の強膜壁に沿って網膜全体を切除し、冷凍チューブに入れて液体窒素タンクに保管します(図1)。

3. 病理検査および特異的細胞染色のためのレチナールサンプリング

  1. 左手で、目のピンセットを使用してラットの目の角を持ち上げます。右手で、外科用ブレードを使用して、ラットの目の角に沿って4mmの開口部を切ります。
  2. アイピンセットを使用して、眼球の端を左手の開口部に固定します。眼ハサミを使って、眼球の周辺組織の洗浄に注意しながら、眼球の縁に沿って周囲の組織を切り取ります。
  3. 眼球の後極にある視神経の周りの組織をピンセットで分離し、視神経を切断し、その保存に注意を払います。次に、眼球を取り外します。
  4. 取り除いた眼球を生理食塩水で洗って残った血液を取り除き、濾紙の上で転がして余分な水分を吸収し、冷たい錫箔の上に置きます。
  5. 眼科用ピンセットで目を固定します。角膜と網膜の接合部に沿って、外科用ブレードで縦方向に4mmの切開を行います。
  6. 眼科用ハサミで角膜を切除し、切開部に沿って円形の切り込みを入れ、水晶体と硝子体をやさしく取り除きます。
  7. 視神経を埋め込んだ残りのアイカップを埋め込みボックスに入れ、4%パラホルムアルデヒドで固定します。
  8. パラホルムアルデヒド固定サンプルをパラフィンに包埋し、HE染色およびTUNEL染色7のために4 μmスライスにカットします。

4. ラット網膜のHE染色

  1. 脱ロウと水和:スライスをキシレンに10分間置き、このプロセスをさらに10分間繰り返し、続いて無水エタノールを5分間、エタノール処理をさらに5分間繰り返し、続いて95%アルコールで5分間処理し、次に85%アルコールで5分間、最後に75%アルコールで5分間処理します。
  2. ヘマトキシリン染色:スライスを脱イオン水で5分間すすぎます。100 μLのヘマトキシリン染色溶液を使用し、5分間染色し、脱イオン水で5〜10秒間すすぎます。1%塩酸エタノール100μLを30秒間加え、脱イオン水で20分間すすぎ、0.2%アンモニア水100μLを1分間加えます。脱イオン水で5分間すすいでください。
  3. エオシン染色:100 μLのエオシン染色溶液を使用して5分間染色し、脱イオン水で30秒間すすぎます。
  4. 脱水と密封:スライスを70%アルコールに5分間浸し、次に85%アルコールに5分間浸し、続いて90%アルコールに5分間、無水エタノールに5分間浸します。無水エタノール処理をさらに5分間繰り返し、次にキシレンに5分間浸漬し、さらに5分間このプロセスを繰り返します。最後に、スライスの表面に約100μLの中性樹脂を加えてシールし、カバーガラスで覆います。
  5. スライドのイメージング:染色したスライスを顕微鏡に配置し、画像がはっきりと見えるまで顕微鏡の焦点を調整し、倍率を400倍に設定して、画像をキャプチャします。
  6. 網膜全体の厚さと外側の網膜の厚さを測定する:網膜全体の厚さと外側の網膜の厚さ(外側の核層と視細胞層の厚さ)を測定し、外側の網膜の厚さのパーセンテージを計算します
    外側網膜の厚さ (%) = (外側網膜の厚さ/網膜全体の厚さ) x 100。

5. TUNEL法による網膜視細胞のアポトーシス率の測定

  1. 脱ロウと水和:スライスをキシレンに10分間置き、このプロセスをさらに10分間繰り返し、次に無水エタノールに5分間入れ、この手順をさらに5分間繰り返します。アルコール95%に5分、アルコール90%に5分、アルコール80%に5分、アルコール70%に5分入れて脱水を行い、脱イオン水で5分間すすぎます。
  2. 0.85%塩化ナトリウム溶液で5分間、PBSで5分間すすぎます。4%パラホルムアルデヒドを使用してパラホルムアルデヒドで15分間固定します。PBSで5分間すすぎ、さらに5分間このプロセスを繰り返します。
  3. インキュベーションと平衡化7:20 μg/mL プロテイナーゼ K 溶液とインキュベートして 15 分間消化し、平衡バッファーで 10 分間平衡化し、組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ (rTdT) バッファーと 37 °C で 60 分間インキュベートします。
  4. 反応停止:標準クエン酸溶液(2x SSC溶液)100 μLを15分間加えます。PBSで5分間すすぎ、さらに5分間このプロセスを繰り返します。
  5. 核色素:100 μL 4′, 6-ジアミジン-2-フェニンドル(DAPI)試薬を5分間添加します。脱イオン水で5分間洗浄し、さらに5分間このプロセスを繰り返します。
  6. シール:スライスの周りの余分なキシレンを拭き取り、スライスの表面に約100μLの中性樹脂を加えてシールし、カバーガラスで覆います。
  7. 顕微鏡検査:染色したスライスを顕微鏡に置き、顕微鏡の焦点を調整してはっきりと見えるようにし、倍率を400倍に設定して、画像をキャプチャします。標準的な蛍光フィルターを使用して、520 nm±20 nmの緑色蛍光を観察します。460nmで青色のDAPIを観察します。
  8. アポトーシス率を計算する:外側の網膜核層の緑色の蛍光値と青色の蛍光値を測定します。アポトーシス率を次のように計算します。
    アポトーシス細胞速度=緑色蛍光値/青色蛍光値×100。

6. ウェスタンブロット解析 10

  1. 溶解バッファー処理:凍結した1つの網膜を50 μLの冷溶解バッファー(5 μLのホスファターゼ阻害剤、1 μLのプロテアーゼ阻害剤、および5 μLの100 mM PMSFを含む溶解バッファー1 mL)でミンチしてホモジナイズします。
  2. 氷浴で5秒間28kHzの超音波処理を行います。3回繰り返します。4°Cで10,000 x g で5分間遠心分離し、細胞の破片を除去します。上澄みを保管してください。
  3. em>6.3タンパク質の定量:BCAタンパク質アッセイ試薬キットを使用してタンパク質濃度を測定します。
  4. em>6.4電気泳動:50 μgのタンパク質サンプルをロードし、12%ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)で分離します。
  5. メンブレンへの転写:電気泳動転写システムを使用してPVDFメンブレンに電気泳動で転写します。
  6. メンブレンの細分化:メンブレンを細分化し、目的の各タンパク質、β-アクチンおよびGAPDHを1回の転写で分析します。
  7. ブロッキング:室温で5%の脱脂乳を含むTBSTでメンブレンを1時間ブロックします。
  8. 一次抗体のインキュベート:切断されたカスパーゼ-9(1:200希釈)、切断されたカスパーゼ-3(1:200希釈)、切断されたカスパーゼ-7(1:200希釈)、およびβ-アクチン(1:1000希釈)の一次抗体と4°Cで一晩インキュベートします。 メンブレンをTBSTで5分間洗浄し、3回繰り返します。
  9. 2つ目の抗体をインキュベートする:西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体(1:2000)と室温で2時間インキュベートします。メンブレンをTBSTで5分間洗浄し、3回繰り返します。
  10. 露光:ウェスタンブロット基質を使用して標識タンパク質を可視化し、最後にメンブレンを露光して自動露光モードでタンパク質バンドを可視化します。
  11. タンパク質バンド密度を測定することにより、タンパク質含有量7 を計算する。

7. 統計解析

  1. SPSS 19.0ソフトウェアを使用してデータを分析し、平均±標準偏差として表示します。一元配置分散分析を使用して、観測値の統計分析を実行します。p< 0.05を統計的に有意とみなします。

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結果

HE染色後、対照群のラットのすべての網膜層は、明確な組織構造、整然とした細胞配置、および均一な染色を示しましたが、モデル群のラットの網膜構造は著しく損傷を受け、外側の網膜層はより薄く、外側の核層は内側のコア層とほぼ完全に統合され、層内の細胞の配置は非常に無秩序でした。 細胞層の数が大幅に減少し、感光性細胞層と外側核層の厚さが大幅に薄くなりました。対照群およびモデル群における外側網膜層の厚さは、それぞれ48%および23%であった(p < 0.01; 図 2)。

TUNEL法では、対照群ではアポトーシス細胞は検出されませんでしたが、モデル群ではラットの外核層にアポトーシス細胞が一部存在し(p < 0.01)、TUNEL陽性率は9.6%でした(図3)。

タンパク質のカスパーゼファミリーは、アポトーシスを実行する主要なファミリーの1つです。その中でも、切断されたカスパーゼ3、切断されたカスパーゼ7、および...

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ディスカッション

RPは、診療所でよく見られる網膜疾患です。RPの発症、重症度、および進行は、遺伝子と遺伝的様式に関連しており、環境の影響を受けます8,11。RPには家族性RPと時折のRPが含まれ、そのうち家族性RPは患者の約60%を占めています。家族の遺伝歴をたどることで、これまでにRPに関連する遺伝子が83個同定されていますが、たまにRPが発生する遺伝子は約40%を占めており、家族歴がなく、遺伝的パターンが不規則であることを意味します2。網膜視細胞のアポトーシスは、RP患者の視覚機能の喪失を引き起こす一般的な認識ですが、RPの視細胞死の根本的なメカニズムは不明のままです12,13,14。主に硝子体切除術中に得られるヒト網膜組織へのアクセ...

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

この研究は、寧夏回族自治区高等教育局(NYG2022029)の科学研究プロジェクトの支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アマシャムイメージャーGE680
過硫酸アンモニウム Boster Biological Technology Co.,LtdA8090
分析天びんメトラー・トレドME104E
BCA タンパク質量子化キット ケンゲンバイオテック。Co. LtdKGP902
cleaved caspase-3 antibodyCell Signaling Technology#9664
cleaved caspase-7 antibodyCell Signaling Technology#8438
cleaved caspase-9 antibodyCell Signaling Technology#9507
DeadEnd Fluorometric TUNEL SystemPromegaG3250
Glycine Boster Biological Technology Co.、LtdAR1200
ヤギ抗ウサギIgG H&L (HRP)Bioss 抗体bs-80295G-HRP
ヤギ血清BiosharpBL210A
High speed  クラッシャーThermo Fisher ScientificAG22331
Immobilon-P SQ トランスファーメンブレンMerck Millipore.LtdISEQ00010
IsofluraneRWD Life ScienceR510-22-10
MethanolChengdu Kelong Chemical Co., Ltd20230108
マイクロプレートリーダーThermo Fisher 科学1510
顕微鏡オリンパスIX73
顕微鏡スライドCitotest Labware Manufacturing Co., Ltd7105P-G
ミニプロティアン テトラBIO-RAD1658001
N-メチル-N-ニトロソウレアsigma-AldrichN4766–100G
オーブン上海 Yuejin Medical Equipment Co., LtdDHG-8145
ページ プレソリューション (30%)Doublehelix Biology Science and Technology Co.,LtdL3202A
PageRuler Prestained Protein LadderThermo Fisher Scientific26617
PBS bufferBiosharpG4202
SDS-PAGE Protein loading buffer (5&回;)Beyotime BiotechnologyP0015
Skim 粉乳BioFroxx1172GR500
Sprague Dawley ratsNingxia Medical UniversitySCXK (Ning) 2020-0001
TEMED&nbsp;Boster Biological Technology Co.,LtdAR1165
総タンパク質抽出キット ケンゲンバイオテック。(株)KGP2100
トランスブロットモジュールBIO-RAD1703935
トリスベース Boster Biological Technology Co.,LtdAR1162
セット 常徳BKMAMバイオテクノロジー株式会社130302027
β-actinCell Signaling Technology#4970
ピン

参考文献

  1. Cehajic-Kapetanovic, J., et al. Association of a novel intronic variant in RPGR with hypomorphic phenotype of X-linked retinitis pigmentosa. JAMA Ophthalmol. 138 (11), 1151-1158 (2020).
  2. Pan, M. Y., et al. Mice deficient in UXT exhibit retinitis pigmentosa-like features via aberrant autophagy activation. Autophagy. 17 (8), 1873-1888 (2021).
  3. Xiong, Y. C., et al. 17β-Oestradiol attenuates the photoreceptor apoptosis in mice with retinitis pigmentosa by regulating N-myc downstream regulated gene 2 expression. Neuroscience. 452, 280-294 (2021).
  4. Zhang, S., et al. Müller cell regulated microglial activation and migration in rats with -Methyl--Nitrosourea-Induced retinal degeneration. Front Neurosci. 14, 606486(2020).
  5. Karine, B., et al. Transferrin non-viral gene therapy for treatment of retinal degeneration. Pharmaceutics. 12 (9), 836(2020).
  6. Yan, W. M., et al. Protection of retinal function and morphology in MNU-induced retinitis pigmentosa rats by ALDH2: an in-vivo study. BMC Ophthalmol. 20 (1), 55(2020).
  7. Zhu, Y. F., et al. Lycium barbarum polysaccharides attenuates N-methy-N-nitrosourea-induced photoreceptor cell apoptosis in rats through regulation of poly (ADP-ribose) polymerase and caspase expression. J Ethnopharmacol. 191, 125-134 (2016).
  8. He, S. Q., et al. Effects and mechanisms of water-soluble Semen cassiae polysaccharide on retinitis pigmentosa in rats. Food Sci Technol. 40 (1), 84-88 (2020).
  9. Chen, Q., Cheng, Z. H., Hu, B. J. Current situation of vitreous and retinal related tissue specimens collection and application. Chinese J Ocular Fundus Dis. 36 (5), 396-399 (2020).
  10. Zhang, Y., et al. Salidroside modulates repolarization through stimulating Kv2.1 in rats. Eur J Pharmacol. 977, 176741(2024).
  11. Deng, F. Y., Han, M. Y., Deng, T. T., Jin, M. Research progress of gene therapy for retinitis pigmentosa. Int Eye Sci. 21 (7), 1205-1208 (2021).
  12. Lin, B., Youdim, M. B. H. The protective, rescue and therapeutic potential of multi-target iron-chelators for retinitis pigmentosa. Free Radic Biol Med. 174, 1-11 (2021).
  13. Carullo, G., et al. Retinitis pigmentosa and retinal degenerations: deciphering pathways and targets for drug discovery and development. ACS Chem Neurosci. 11 (15), 2173-2191 (2020).
  14. Zhang, Z. J., et al. Quantification of microvascular change of retinal degeneration in Royal College of Surgeons rats using high-resolution spectral domain optical coherence tomography angiography. J Biomed Opt. 28 (10), 106001(2023).
  15. Loiseau, A., Raîche-Marcoux, G., Maranda, C., Bertrand, N., Boisselier, E. Animal models in eye research: focus on corneal pathologies. Int J Mol Sci. 24 (23), 16661(2023).
  16. Gregory-Evans, K. A review of diseases of the retina for neurologists. Handb Clin Neurol. 178, 1-11 (2021).
  17. Li, X. M., et al. Targeting long noncoding RNA-AQP4-AS1 for the treatment of retinal neurovascular dysfunction in diabetes mellitus. EBioMedicine. 77, 103857(2022).
  18. Lee, D., et al. Retinal degeneration induced in a mouse model of ischemia-reperfusion injury and its management by pemafibrate treatment. FASEB J. 36 (9), e22497(2022).
  19. Zhang, Q. L., Zhao, N., Li, Z. J. Effects of salidroside on retinopathy in diabetic rats based on COX-2/PGE2/VEGF pathway. J China Medical Uni. 52 (8), 731-935 (2023).

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