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方法論記事

組織工学のためのナノフィブリルパターンコラーゲンの作製

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DOI:

10.3791/67165

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2024年9月20日

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Oregon Health & Science University, 2Department of Orthopaedics and Rehabilitation, Oregon Health & Science University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

次のプロトコルは、ナノスケールのパターン化されたフィブリルを用いたコラーゲンハイドロゲルの製造のためのせん断ベースの押出法を示しており、これは幅広い組織工学アプリケーションに適用することができます。

要約

再生バイオマテリアルは、細胞と材料の相互作用を促進し、損傷した組織や臓器の修復を導くように設計されています。これらの材料は、天然組織の生物物理学的特性を模倣するように設計されており、再生組織ニッチの回復に貢献する細胞表現型および形態学的ガイダンスを提供します。一般的な細胞外マトリックスタンパク質であるコラーゲンは、その生体適合性やその他の好ましい特性により、これらの再生生体材料の一般的な成分です。現在の研究では、指向性フィブリルパターニングを備えた人工ナノフィブリルコラーゲンの作製のための新しく簡単な方法について説明しています。せん断応力、温度、pHの操作により、コラーゲンの線維化と整列は、特殊な機器を必要とせずに正確に制御されます。このアプローチにより、異方性または等方性を示す組織の天然構造を模倣するナノフィブリルコラーゲン生体材料の作成が可能になります。コラーゲンナノフィブリルパターニングの柔軟性は、細胞挙動のナノスケールパターニングの研究を容易にするだけでなく、パターン化された組織工学の応用に多様な可能性を提供します。

概要

再生医療の目標は、工学的治療薬の応用を通じて組織の再生と治癒を促進することです。1つのアプローチには、天然組織の組成と構造を密接に模倣する生体材料構築物の作製が含まれます。これらのコンストラクトを設計する際には、細胞の増殖、遊走、分化の指導的な手がかりを提供し、最終的に組織再生を促進する天然の細胞外マトリックス(ECM)が重要な考慮事項となります1,2。天然のECMは、主に繊維状コラーゲン3,4で構成されています。骨格筋や腱などの高度に組織化された組織では、これらのECMは整列したパターンを示し、これは組織全体の力の伝達と運動機能をサポートするための鍵となります5,6。

組織工学用途の生体材料としてのコラーゲンの有用性は、天然組織での広範な普及を超えて、優れた生体適合性、生分解性、および細胞親和性も示しています7,8,9。コラーゲンベースの生体材料の開発における最近の進歩は、特定の組織再生に不可欠な機械的および生化学的手がかりをより良く導くための生物物理学的特性の改良に焦点を当てています。in vitroで繊維構造を持つコラーゲン生体材料を作製することは比較的簡単で、酸可溶性コラーゲン分子は暖かい温度と中性のpH10,11にさらされるとナノフィブリルに自己組織化することができます。しかし、ガイド付きの操作を行わないと、これらのフィブリルはランダムなネットワークを形成し、異方性組織工学アプリケーションには適していません。整列したフィブリルを製造できる技術には、エレクトロスピニングおよびウェットスピニング、他の溶液押出技術12、13、凍結乾燥14、電気化学的または磁気的加工15、16、せん断流堆積17、流動誘起結晶化18、ゲル押出し19、ひずみ誘起アライメント20、および流体の操作による力誘導アライメントが含まれるフロー 21,22.しかし、これらの方法の多くは、コラーゲンとの適合性があまり高くない、マイクロスケールではアライメントを生成するがナノスケールでは生成しない、アライメントと安定性を誘導するために追加の後処理ステップが必要、または高度に専門化された機器や試薬を必要とするため、広く採用することが困難です。

現在の研究では、シリンジポンプやエレクトロスピナーなどの特殊な機器を必要とせずに、整列またはランダムに配向した線維パターニングを備えたナノフィブリルコラーゲンの作製のための簡単なせん断ベースの方法が示されています。この技術は、コラーゲン線維形成のpH依存性を利用しています。中和バッファー内の酸性モノマーコラーゲンにせん断力を加えると、せん断方向に沿った整列した線維化が促進されます。同様に、コラーゲンは、せん断がない場合に線維形成を受けるように誘導することができ、これによりランダムなパターンの線維が生成されます。得られた3Dコラーゲンストリップは、整列したまたはランダムにパターン化されたナノフィブリルコラーゲンで構成されており、ナノスケールのパターニングが細胞の挙動に及ぼす影響を研究するためのツールとして役立ちます。さらに、それらは、異方性および等方性組織工学アプリケーション23,24,25,26,27の両方に対して多様な可能性を提供する。パターニングは、目的の天然組織の構造に一致するようにカスタマイズできます。コラーゲンストリップは、さまざまなサイズの束に組み合わせて、さまざまなサイズや形状の損傷で移植された人工治療薬として機能することもできます。

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プロトコル

1. 透析コラーゲンの調製(図1)

  1. 透析チューブを約3インチの長さにカットします。チューブは、フラット幅32 mm、膨らんだ直径20 mm、細孔サイズ4.8 nmの仕様のチューブを使用してください。
  2. 透析チューブを超純水で水分を補給します。
  3. チューブの一方の端を透析チューブクリップでクリップします。
  4. 18G針を装備した10mLシリンジを使用して、ラットテールコラーゲンI型I型(濃度:0.02N酢酸中9-10mg / mL)を5〜6mLをチューブに移します。.チューブのもう一方の端をクリップで留めて閉じます。
  5. ガラス皿の底に厚さ0.5〜1cmのポリエチレングリコール(PEG)フレークの層を置き、次にコラーゲンを充填した透析チューブをPEG層の上に置きます。
    注:13インチx 9インチx 2インチのガラス皿は、通常、4〜5本のコラーゲン充填チューブの列を収容できます。必要なコラーゲンの量に応じて、お皿のサイズを調整できます。
  6. さらにPEGフレークを追加してチューブを完全に覆い、トレイを4°Cの冷蔵庫に入れます。
  7. 10〜15分ごとに、透析チューブの表面から濡れたPEGフレークを取り除き、新しい乾燥PEGの層でチューブを再度覆います。皿を4°C冷蔵庫に戻します。
  8. 手順1.7をさらに2回繰り返し、30〜35分後、水道水を使用して濡れたPEGフレークを洗い流します。
  9. 超純水でもう一度チューブをすすぎ、ティッシュで軽くたたいて乾かします。
  10. チューブの一端をクリップから外し、透析したコラーゲン(最終濃度:~30 mg/mL)を微量遠心チューブに移します。ミニ遠心分離機(2,000 x g、≤30秒、室温[RT])を使用してコラーゲン中の気泡を短時間スピンダウンし、後で使用するために4°Cで保存します。
  11. 使用の1日前に、コラーゲンをシリンジに入れます。
    1. 16ゲージの針を使用して、透析したコラーゲンを~1mLの注射器に引き込みます。
      注:コラーゲンは粘性物質です。コラーゲンを多く吸い上げる前に、針の先端にコラーゲンをあらかじめ充填しておく必要があるかもしれません。ニードルヘッドを取り外し、必要に応じて大きなエアポケットを排出します
    2. 針を取り外し、シリンジヘッドをパラフィルムで包みます。
    3. コラーゲンを充填したシリンジは、小さな気泡が飛び出すように、4°Cで一晩直立させて保管してください。

2. ガラスチップの調製(図1)

注意:プロトコルのこの部分には目の保護具を使用してください。

注:細胞培養実験には、特別にコーティングされた疎水性スライドガラスが使用されます。スライドは、表面コーティングの除去を防ぐために、エッジで取り扱う必要があります。適切な切断面でガラス切断手順を実行します。

  1. 油性マーカーを使用して、ガラスチップの目的の寸法を測定し、マークします
    1. 8ストリップの足場を作成する場合は、スライドの長辺に沿って約1cm刻みで印を付けます。必要に応じて、目的のスキャフォールドサイズに基づいて寸法を調整します。
  2. ストレートエッジ(つまり、6ウェルプレートエッジ)を使用して、ガラスカッターを最初の測定の長さに沿って滑らせて、ガラスにスコアを付けます。
  3. スライドは、スコアリングされたラインに沿って自動的に壊れるか、スライドを組織にひっくり返し(疎水性の面を下にして)、スコアリングされた領域に手動で圧力を加えます。
  4. エタノールマーカーペンを使用して、疎水性スライドガラスのコーティング面に印を付けます。
  5. ガラスチップを超純水ですすいで、残留ガラス粉を取り除きます。
  6. ガラスチップは、加圧空気用のベンチトップノズルを使用するか、ドラフト内で斜めに積み重ねて乾燥させます。
  7. 必要に応じて、必要なチップ数だけ繰り返します。チップはRTに保管します。最良の細胞培養結果を得るには、7日以内に調製したチップを使用してください。

3. 10xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)の調製

  1. ガラス瓶に500mLの超純水を入れます。
  2. ボトルに10個のPBSタブレットを追加します。
    注:このプロトコルでは、1x PBSの錠剤比が500mLあたり1錠であると仮定しています。異なるタブレットサイズまたはブランドを使用している場合は、必要に応じてタブレットの数を調整します。
  3. ボトルに攪拌棒を追加し、錠剤が溶けるまで攪拌板の上に置きます。
  4. ハイドロゲル製造の日に、必要な量の10x PBSを50 mLコニカルチューブに移します。
  5. コラーゲンを作製する前に、PBSを充填したチューブを37°Cのウォーターバスに少なくとも15分間入れます。

4. 整列したコラーゲンナノフィブリルの作製(図2)

  1. 冷蔵庫からコラーゲンの注射器を取り出し、鈍い22Gの針を取り付けます。
  2. スライドガラスを4ウェルプレートの蓋に置きます。
  3. スライドを十分に温めた37°C 10x PBSで覆い、水没させます(30〜50 mL)。
  4. シリンジを約30〜45°の角度で保持し、~340 mm/sの速度と~3.2 mL/minの流速を使用して、コラーゲンの細いストリップをガラスチップに手動で押し出します。
    注:温めたPBSを追加してから30〜60秒以内にコラーゲンの押し出しを完了し、PBSが過度に冷えないようにします。
  5. コラーゲンが線維化を完了するまで1〜2分待つか、コラーゲンが不透明な白色に変わるまで待ちます。
  6. 鉗子を使ってコラーゲンストリップを長さにカットします。チップの両端の下に3〜5mmを折りたたむことができるように、ストリップが十分に長いことを確認してください。
  7. 一度に1つずつ、コラーゲンのストリップを縦方向(スコアのある領域と平行)に、準備したガラスチップの上にそっとドレープします。端をチップの下に押し込みます。
  8. 目的の寸法に達するまで、コラーゲンストリップを配置し続けます。
  9. 新しく形成したコラーゲンハイドロゲルを12ウェルプレートの2つのウェルにまたがって配置します。これにより、乾燥過程での空気の流れが可能になり、コラーゲンの尾端が望ましくない表面に付着するのを防ぐことができます。
  10. ハイドロゲルをベンチトップに置いて、1〜3時間、またはPBS塩の結晶がハイドロゲル表面の50%〜90%を覆うまで乾燥させます。
    注:乾燥時間は、ハイドロゲルのサイズと過剰な液体の有無によって異なります。
  11. 各ヒドロゲルを1x PBSに約30〜60秒間、または塩の結晶が溶解するまで沈めます。
  12. 余分なPBSをティッシュでやさしく軽くたたきます。
  13. ハイドロゲルをウェルプレートに戻し、ドラフトで一晩乾燥させます。
  14. 乾燥させたヒドロゲルをRTで約1週間保存します。

5. ランダムコラーゲンナノフィブリルの作製(図3)

  1. 冷蔵庫からコラーゲンの注射器を取り出し、鈍い22Gの針を取り付けます。
  2. コラーゲンを~3.2 mL/minで乾燥ガラスチップに押し出します。整列したコラーゲンハイドロゲルと同程度の寸法が得られるように、十分なコラーゲンを押し出します。必要に応じて気泡の蓄積を防ぎます。
  3. 追加のコラーゲンを押し出して、ガラスチップの端に巻き付けます。これにより、偶発的な離脱のリスクが最小限に抑えられます。
  4. 鉗子を使用して、押し出したコラーゲンを温めた10x PBSの50mLチューブに沈めます。
  5. コラーゲンが線維化を完了するまで45〜60秒待つか、コラーゲンが不透明な白色に変わるまで待ちます。
  6. 余分なPBSをティッシュでやさしく軽くたたきます。
  7. 手順4.9-4.14を完了して、ハイドロゲルをすすぎ、乾燥させます

6.滅菌と再水和

注意: バイオセーフティキャビネットで次の手順をすべて完了します

  1. コラーゲンハイドロゲルと周囲のウェルプレートを70%エタノールで15分間滅菌します。
    1. 鉗子を使用して滅菌の途中でヒドロゲルを短時間持ち上げて、ガラスチップの下側とヒドロゲルの両方がエタノールと接触していることを確認します。
  2. エタノールを取り除き、ヒドロゲルを10分間風乾させます。
  3. ヒドロゲルを滅菌した1x PBSでそれぞれ10分間、3回洗浄して、残留エタノールを除去し、ヒドロゲルを再水和します。これで、ハイドロゲルを使用する準備が整いました(細胞培養など)。ハイドロゲルは、すぐに使用できる準備ができていない場合、最終洗浄ステップ後にPBSに短時間放置することがあります。

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結果

このプロトコルは、整列(図2)またはランダム(図3)配向したナノフィブリルで構成されるコラーゲンハイドロゲルを製造するための簡単なせん断ベースの押出技術について説明しています。ナノフィブリルパターニングは、シリンジ速度とコラーゲン押出速度の組み合わせによる調整によって達成されるせん断力の精密な制御に依存しています。フィブリルアライメントを誘導するための最適値は、以前に340 mm / sのシリンジ速度と3.2 mL / minのコラーゲン押出速度であると決定されています28,29。このバランスは、整列したナノフィブリルの形成だけでなく、マクロスケールでのハイドロゲルの機能を確保するためにも重要です。この比率がずれていると、思った通りにパターン化されていないハイドロゲルや、コラーゲンストリップを含むハイドロゲルが薄すぎる(直径<0.5mm)、厚い(直径>1.5mm)、波状になって使用する恐れが...

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ディスカッション

プロトコールの重要なステップは、1)コラーゲン線維化、2)ハイドロゲルのマウント、3)洗浄の3つの主要な部分に蒸留できます。コラーゲン線維形成の過程は、中和条件下で自発的に起こり、個々のコラーゲン分子のより大きな安定化線維構造への自己組織化に依存している10,11。これは、37°Cに温められた10x PBSのような中和緩衝培地を適用することで達成され、コラーゲンのフィブリルへの完全な発達を保証する静電相互作用を導くために重要です。ナノスケールの繊維状直線は、線維形成の発生と同時にせん断力を加えることによって達成されます。せん断の有無、およびせん断速度によって、フィブリルのパターン化が決まります。第二に、ハイドロゲルの取り付けは、コラーゲンの収縮と脱水が起こる乾燥プロセス中に物理的なアンカーを提供することにより、材料の安定性を強化するための重要なステップです。このステップは、意図された使用がin vitro細胞播種である場合、コラーゲンを...

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開示事項

申告すべき利益相反はありません。

謝辞

この研究は、Alliance for Regenerative Rehabilitation Research & Training、MTF Biologics、Oregon Health & Science University Foundation、Collins Medical Trustからの資金提供によって部分的に支援されました。KMHは、全米科学財団大学院研究フェローシップ(DGE-1937961)およびオレゴン学生学習体験研究(OSLER)フェローシップ(5TL1TR2371-8)の支援を受けました。K.H.N.は、NIH/NHLBI(R00HL136701)およびNIH/NIAMS(R01AR080150)からの助成金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
コラーゲンI.、高濃度、ラットテールニングCB354249
エクリプスTE-2000-U顕微鏡コンTE-2000-U 倒立顕微鏡
超厚手顕微鏡スライドフィッシャーサイエンティフィック22-267-005コラーゲン押出面に適しています
FEI Helios G3 NanoLab DualBeamサーモフィッシャーサイエンティフィックN/A走査型電子顕微鏡
ガラスカッターツールセット 2mm-20mm ペンシルスタイル オイルフィード カーバイドチップAmazon/MOARMORB07Y1D243Hガラスカッターのオプション
ハミルトン Kel-F ハブ ブラントポイントニードル (ルアーロック、22 G)Fisher Scientific14-815-574コラーゲン押出し用針
Nexterion スライド H 3-DショットNC0782819疎水性スライド
PBS 錠剤サーモフィッシャーサイエンティフィック18912014
ポリエチレングリコール 8000フィッシャーバイオ試薬BP233-1
シームレスセルロース透析チューブ フィッシャーサイエンティフィックS25645G
スネークスキン透析クリップサーモフィッシャーサイエンティフィックPI68011
シンセグラスグラスカッターシンセウェア31-501-927ガラスカッターのオプション
コーニ

参考文献

  1. Padhi, A., Nain, A. S. ECM in differentiation: A review of matrix structure, composition and mechanical properties. Ann Biomed Eng. 48 (3), 1071-1089 (2020).
  2. Schlie-Wolter, S., Ngezahayo, A., Chichkov, B. N. The selective role of ECM components on cell adhesion, morphology, proliferation and communication in vitro. Exp Cell Res. 319 (10), 1553-1561 (2013).
  3. Ricard-Blum, S. The collagen family. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a004978(2011).
  4. Shoulders, M. D., Raines, R. T. Collagen structure and stability. Annu Rev Biochem. 78, 929-958 (2009).
  5. Gillies, A. R., Lieber, R. L. Structure and function of the skeletal muscle extracellular matrix. Muscle Nerve. 44 (3), 318-331 (2011).
  6. Silver, F. H., Freeman, J. W., Seehra, G. P. Collagen self-assembly and the development of tendon mechanical properties. J Biomech. 36 (10), 1529-1553 (2003).
  7. Friess, W. Collagen-biomaterial for drug delivery. Eur J Pharm Biopharm. 45 (2), 113-136 (1998).
  8. Lee, C. H., Singla, A., Lee, Y. Biomedical applications of collagen. Int J Pharm. 221 (1-2), 1-22 (2001).
  9. Liu, X., Zheng, C., Luo, X., Wang, X., Jiang, H. Recent advances of collagen-based biomaterials: Multi-hierarchical structure, modification and biomedical applications. Mater Sci Eng C. 99, 1509-1522 (2019).
  10. Harris, J. R., Reiber, A. Influence of saline and pH on collagen type I fibrillogenesis in vitro: Fibril polymorphism and colloidal gold labelling. Micron. 38 (5), 513-521 (2007).
  11. Williams, B. R., Gelman, R. A., Poppke, D. C., Piez, K. A. Collagen fibril formation. Optimal in vitro conditions and preliminary kinetic results. J Biol Chem. 253 (18), 6578-6585 (1978).
  12. Zhong, S., et al. An aligned nanofibrous collagen scaffold by electrospinning and its effects on in vitro fibroblast culture. J Biomed Mater Res A. 79A (3), 456-463 (2006).
  13. Malladi, S., et al. Continuous formation of ultrathin, strong collagen sheets with tunable anisotropy and compaction. ACS Biomater Sci Eng. 6 (7), 4236-4246 (2020).
  14. Lowe, C. J., Reucroft, I. M., Grota, M. C., Shreiber, D. I. Production of highly aligned collagen scaffolds by freeze-drying of self-assembled, fibrillar collagen gels. ACS Biomater Sci Eng. 2 (4), 643-651 (2016).
  15. Torbet, J., Ronzière, M. C. Magnetic alignment of collagen during self-assembly. Biochem J. 219 (3), 1057-1059 (1984).
  16. Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Inman, D. R., Keely, P. J. Engineering three-dimensional collagen matrices to provide contact guidance during 3d cell migration. Curr Protoc Cell Biol. Chpater 10 (Unit 10.17), (2010).
  17. Saeidi, N., Sander, E. A., Zareian, R., Ruberti, J. W. Production of highly aligned collagen lamellae by combining shear force and thin film confinement. Acta Biomater. 7 (6), 2437-2447 (2011).
  18. Paten, J. A., et al. Flow-induced crystallization of collagen: A potentially critical mechanism in early tissue formation. ACS Nano. 10 (5), 5027-5040 (2016).
  19. Yunoki, S., Hatayama, H., Ebisawa, M., Kondo, E., Yasuda, K. A novel method for continuous formation of cord-like collagen gels to fabricate durable fibers in which collagen fibrils are longitudinally aligned. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 107 (4), 1011-1023 (2019).
  20. Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L. Strain-induced alignment in collagen gels. PLoS One. 4 (6), e5902(2009).
  21. Ahmed, A., et al. Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3d collagen hydrogels. Biofabrication. 14 (3), (2022).
  22. Su, C. Y., et al. Engineering a 3D collective cancer invasion model with control over collagen fiber alignment. Biomaterials. 275, 120922(2021).
  23. Nakayama, K. H., et al. Bilayered vascular graft derived from human induced pluripotent stem cells with biomimetic structure and function. Regen Med. 10 (6), 745-755 (2015).
  24. Nakayama, K. H., et al. Nanoscale patterning of extracellular matrix alters endothelial function under shear stress. Nano Lett. 16 (1), 410-419 (2016).
  25. Nakayama, K. H., et al. Rehabilitative exercise and spatially patterned nanofibrillar scaffolds enhance vascularization and innervation following volumetric muscle loss. NPJ Regen Med. 3, 16(2018).
  26. Nakayama, K. H., et al. Treatment of volumetric muscle loss in mice using nanofibrillar scaffolds enhances vascular organization and integration. Commun Biol. 2 (1), 170(2019).
  27. Alcazar, C. A., Hu, C., Rando, T. A., Huang, N. F., Nakayama, K. H. Transplantation of insulin-like growth factor-1 laden scaffolds combined with exercise promotes neuroregeneration and angiogenesis in a preclinical muscle injury model. Biomater Sci. 8 (19), 5376-5389 (2020).
  28. Lai, E. S., Huang, N. F., Cooke, J. P., Fuller, G. G. Aligned nanofibrillar collagen regulates endothelial organization and migration. Regen Med. 7 (5), 649-661 (2012).
  29. Huang, N. F., et al. Spatial patterning of endothelium modulates cell morphology, adhesiveness and transcriptional signature. Biomaterials. 34 (12), 2928-2937 (2013).
  30. Weadock, K. S., Miller, E. J., Bellincampi, L. D., Zawadsky, J. P., Dunn, M. G. Physical crosslinking of collagen fibers: Comparison of ultraviolet irradiation and dehydrothermal treatment. J Biomed Mater Res. 29 (11), 1373-1379 (1995).

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