アンサンブルベースのドッキング解析を用いた計算創薬における標的タンパク質構造の柔軟性とダイナミクスの組み込み

サマリー

計算手法は創薬の迅速化に期待されていますが、タンパク質構造の動的な性質を見落としがちです。ここでは、アンサンブルベースのドッキング解析により、タンパク質の柔軟性を間接的に組み込み、創薬活動の精度と信頼性を向上させる可能性について解説します。

要約

創薬プロセスは、厳格で、時間と費用のかかる作業です。創薬における計算アプローチにより、研究者は最も有望な化合物を優先してさらなる試験を行うことができ、必要なリソースが大幅に削減され、創薬パイプラインの全体的な効率が向上します。構造ベースの創薬は、標的タンパク質の構造情報を3次元形式で必要とする一般的なアプローチです。しかし、現在のほとんどのコンピュータ支援創薬戦略の限界は、リガンド-タンパク質ドッキングシミュレーション中に標的タンパク質構造の柔軟性とダイナミクスを導入できないことです。誘導フィットドッキングとアンサンブルベースのドッキングはどちらも、ドッキング手順におけるタンパク質の柔軟性に対処することを目的としていますが、後者はシミュレーション全体に複数のコンフォメーションを組み込むことで、動的なタンパク質の挙動をより包括的に把握することができます。本稿では、分子ドッキングプロセスにおける標的タンパク質構造の柔軟性とダイナミクスを間接的に導入するアンサンブルベースドッキング解析と呼ばれる手法の応用について紹介し、議論する。アンサンブルベースのドッキング研究で選択されたタンパク質とリガンドは、それぞれリゾチームとフロボカワインB(FB)でした。FBは以前にリゾチームとの結合活性を有することが報告されています。水存在下でリゾチームに対して分子動力学(MD)シミュレーションを行い、全エネルギー、二乗平均平方根偏差(RMSD)、二乗平均平方根揺らぎ(RMSF)を調べた。コンフォメーションクラスタリングは、いくつかのクラスタリングカットオフ値に基づいて生成され、FBとの追加のドッキング解析に選択されました。クラスターNo.2は、-29.37 kJ/molと最も低い結合エネルギーを示します。分子ドッキング画像は、結合力の存在を予測するために生成されました。アンサンブルベースのドッキングアプローチは、タンパク質の構造ダイナミクスを組み込むことで、考えられる結合シナリオの範囲をより適切に捉えることができ、結合結果のより信頼性の高い予測につながります。

概要

CDD(Computational Drug Discovery)では、コンピュータサイエンス、化学、生物学、物理学の技術を統合して、広大な化学空間を探索し、薬物と標的の相互作用を予測し、従来の実験方法のみと比較して、より高い効率と低コストで薬剤候補を最適化します。これは、計算手法とアルゴリズムを活用して、新しい治療用化合物の発見と最適化を加速する強力なアプローチです^1,2,3。CDDは創薬に革命をもたらしました。しかし、タンパク質の3次元(3D)構造ダイナミクスには、計算予測の精度と信頼性に影響を与える可能性のある制限があります⁴。タンパク質の3D構造は、CDDのテンプレートとして機能し、標的のタンパク質-薬物相互作用に基づいて医薬品候補を設計または最適化します。タンパク質構造のX線結晶構造解析モデルは、タンパク質に関する貴重な構造情報を提供しますが、タンパク質構造の動的性質と静的モデルの限界を認識することが不可欠です^5,6,7。さらに、クライオ電子顕微鏡(クライオ電子顕微鏡)やAlphaFoldなどの計算予測の最近の進歩により、タンパク質の柔軟性^{とダイナミクス}8,9,10,11,12の全スペクトルを捉える構造データの利用可能性も大幅に拡大しました。

分子動力学(MD)シミュレーションは、原子や分子の動きと相互作用を経時的にシミュレートし、タンパク質の3D構造の動的挙動と柔軟性に関する洞察を提供します^13,14。MDシミュレーションは、さまざまなコンフォメーション状態を表すタンパク質の3D構造を生成するために使用され、アンサンブルベースのドッキング解析の入力として機能します。アンサンブルベースのドッキング解析は、多様なタンパク質コンフォメーションのサンプリングを通じて、生物学的ターゲットの固有の柔軟性とダイナミクスを説明し、リガンドの結合モードと相互作用をより包括的に調査することを可能にします³。

タンパク質の柔軟性を理解することは、薬物が生物学的効果を発揮する方法に影響を与え、結合部位の位置と方向を決定し、結合速度、代謝、および輸送に影響を与えるため、不可欠です^15,16。この動的な性質をキャプチャすることで、ドッキング予測の精度と信頼性を大幅に向上させることができます。1994年、Kearsleyらは、リガンドとタンパク質の両方の柔軟性をモデル化するフレームワークであるフレキシブルドッキング技術を導入しました。このアプローチにより、ドッキング中にタンパク質のコンフォメーションを調整でき、構造的な柔軟性を考慮することでリガンド-受容体相互作用の予測を改善する^{ことができる17}。同様に、1999年にCarlsonらは、HIV-1インテグラーゼの静的モデルと動的モデルの両方に柔軟なファーマコフォアモデリングを適用するアンサンブルドッキングについて報告し、ドッキング研究におけるタンパク質ダイナミクスを考慮することの重要性をさらに強調しました¹⁸。さらに、Cavasottoらは、ノーマルモード解析¹⁹を用いて、ドッキングプロセスに受容体の柔軟性を組み込むことにより、リガンドドッキング精度の向上も報告した。最近では、アンサンブルベースの技術^{20、21、22、23、24、25、26、27}が、潜在的な新しいリガンド結合部位を特定し、遊離リガンド-受容体結合エネルギーのより正確な推定を提供することにより、創薬を拡大しています。これらの進歩は、四重鎖二本鎖^DNA20、血管内皮増殖因子165(VEGF-165)²¹、SARS-CoV-2標的酵素²²、ヒト肝臓シトクロムP450酵素²³、抗がんタンパク質²⁴などの標的に適用されている。

フラボノイドとして分類されるフラボカワインB(FB)は、さまざまな薬理学的特性を示すことが文書化されています28,29,30。実験的および計算的分析に基づいて、FBは、その抗菌活性で広く認識されているタンパク質であるリゾチーム(LYZ)³¹と安定な複合体を形成することが報告されており、リガンドトランスポーターとしても同定されています32,33,34。本報告では、アンサンブルベースのドッキング解析を用いて、FBとLYZとの相互作用の性質をさらに解析し、FB-LYZ複合体形成におけるタンパク質の柔軟性の影響を組み込みます。この方法の目標は、アンサンブルベースのドッキング解析のための段階的な再現性のあるプロセスを研究者に提供することです。また、研究者は、研究対象生物からタンパク質構造を選択することが望ましいです。

プロトコル

1. フラボカワインB配位子構造の調製

1. PubChem の Web サイトを開きます。Flavokawain B.を検索します。[ダウンロード]を選択し、[SDF 2D 構造を Structure2D_COMPOUND_CID_5356121.MDL SDF として保存]を選択します。
2. Avogadroソフトウェアを開きます。SDFファイルをソフトウェアの空きスペースに移動します。[はい] をクリックします。
   注:Avogadroソフトウェアは、3次元(3D)ジオメトリを自動的に構築します。
3. タブで、アイコンをクリックします (図 1 を参照)。左側のメニュータブで、力フィールドをMMFF94^35,36に変更します。更新ごとのステップを 15 に調整します。アルゴリズムを [Steepest Descent (急降下) (Steepest Descent )] に設定し、[開始] をクリックします。
   注:回転の進行中は原子を動かさないでください。終了したら、[ 停止] をクリックします。 MMFF94は、広範囲の低分子配位子(中性配位子と荷電配位子の両方を含む)に適しており、エネルギー最小化および分子モデリング³⁷に広く使用されている。初期エネルギー最小化に「最急降下法」が選択されるのは、単純で計算効率が高く、大きな構造ひずみを除去し、基本最小化状態^38、39、40を達成するのに効果的だからです。
4. メニュータブで、[ ファイル ]に移動し、[ 名前を付けて保存 ]をクリックします。 Save Molecule As フォルダが表示されたら、ファイル名を ligand.pdb と記入し、 Saveをクリックします。

2. リゾチームタンパク質構造の調製

1. RCSBタンパク質データバンクのWebサイトを開きます。リゾチーム、コード: 1LYZを検索します。「 ファイルのダウンロード 」をクリックし、「 PDB形式」を選択します。 1lyz.pdb として保存します。
2. Chimera ソフトウェアを開きます。タブで、[ファイル] と [開く] をクリックします。フォルダで、1lyz.pdbファイルを選択します。
   注:リゾチームの3D構造は、ソフトウェアを使用して構築されます。
3. タブで、「 Select > Residue > HOH」をクリックします。次に、「 アクション 」> 「Atom/Bonds 」> 「Delete」をクリックします。 「選択 」と 「選択解除」をクリックします。
   注:これにより、タンパク質から水分が除去されます。
4. タブで、[チェーン A >選択] をクリックします>。 次に、「ツール」(Tools) >「Structure Editing (構造編集)」>「AddH」の順にクリックします。パラメータボックスが表示され、デフォルトのままにします。[OK] をクリックします。[選択して選択を解除]をクリックします(図2)。
   注:これにより、タンパク質に水素が追加されます。ヒスチジン残基もプロトン化されて中性系を作り出します。このソフトウェアは、PROPKA^41,42を統合することにより、pKa計算を実行できます。
5. タブで、[ ツール]、[ Structure Editing]、 および [Add Charge] をクリックします。パラメータボックスが表示されます。 [Gasteiger] を選択します。 [OK] をクリックします。注:これにより、タンパク質に部分的な電荷が追加されます。
6. ファイルを保存するには、タブで「 ファイル 」>「 PDBの保存 」をクリックします。 protein.pdb として保存します。
   注:この研究では、リゾチームの構造を以前に報告された結果³¹と比較するために選択されました。読者は、関心のある標的生物からタンパク質構造を慎重に選択することをお勧めします。

3. 水中のリゾチームのMDシミュレーション

注: この研究で使用した分子動力学 (MD) シミュレーション用のカスタムビルド コンピューターは、CPU 用の Intel CORE i7 11^th Gen、GPU 用の NVIDIA Geforce RTX 2060、および DDR4 128 GB メモリです。OSシステムはUbuntu22.04.4LTSです。MDシミュレーションはGROMACSソフトウェアを使用しています。GPUサポートはCUDAです。

1. このリンクから必要なすべてのドキュメントをダウンロードします:http://www.mdtutorials.com/gmx/lysozyme/01_pdb2gmx.html(GROMACSチュートリアル、水中のリゾチーム)⁴³。
   注:必要なドキュメントは 、em.mdp、ions.mdp、md.mdp.npt.mdp、nvt.mdp、charmm36 ff 、および protein.pdb (ステップ2.5から)です。システムのセットアップでは、 em.mdp はエネルギー最小化用、 ions.mdp はイオンを追加してシステムを中和するためのものです。平衡化の場合、 nvt.mdp は温度平衡化用で、 npt.mdp は圧力平衡化用です。本番環境の場合、 md.mdp はシミュレーション用です。 Charmm36 ff はトポロジ用です。
2. フォルダ(作業ディレクトリ)の空きスペースを右クリックし、[ターミナルを開く]をクリックします。 gmxと入力してGROMACSソフトウェアを開きます。注:GROMACSにはグラフィカルユーザーインターフェイスはありません。ターミナルに書かれたコマンドから全てです。
3. タンパク質トポロジーを生成するには、「gmx pdb2gmx -f protein.pdb -o protein.gro –ignh」と入力します。力場のリストが示され、CHARMM全原子力場⁴⁴のタイプ1、水モデルのTIP3Pのタイプ1が続きます。
   注: 更新されたバージョンの CHARMM36 も利用可能で、http://mackerell.umaryland.edu/charmm_ff.shtml⁴⁵ からダウンロードできます。
4. タンパク質構造全体を覆う立方体のボックスを定義します。 「gmx editconf -f complex.gro -o newbox.gro -c -d 1.0 -bt cubic」と入力します。注:タンパク質は、ボックスの端から少なくとも1 nmの位置に配置されます。ウォーターボックスのサイズが、タンパク質、溶媒、イオンに十分な大きさであることを確認してください。さらに、ウォーターボックスは、タンパク質の周期的な画像間の相互作用を防ぐのに十分である必要があります。タンパク質とボックスエッジの間の推奨される最小距離は、少なくとも1.0〜1.5nmです。
5. 溶媒構成⁴⁶ の場合は、 gmx solvate -cp newbox.gro -cs spc216.gro -p topol.top -o solv.gro と入力します。
6. gmx solvate -cp newbox.gro -cs spc216.gro -p topol.top -o solv.gro と入力して、ナトリウムや塩化物などのイオンを追加します。
   注:ナトリウムイオンおよび/または塩化物イオンは、システムを中和するために使用されます。
7. gmx genion -s ions.tpr -o solv_ions.gro -p topol.top -pname NA -nname CL -neutral と入力して、システムを中和します。SOL グループで 13 を選択します。
   注:リゾチームの場合、8つの溶質分子が塩化物イオンに置き換えられています(図3)。
8. CHARMM 36 ファイルで、 ions.itp フォルダーを検索します。塩化物イオンの略語は CLAです。
9. topol.top ファイルを開き、図 4 に示すように CLA と番号 8 を追加します。
10. solv_ions.groファイルを開き、すべてのCLをCLAに交換します。
    注: solv_ions.gro ファイルと topol.top ファイルのそれぞれのイオンの略語が同じであることを確認してください。そうしないと、警告が表示されます。イオン名の名前変更は、CHARMM 36 ff ファイルのバージョンに準じます。塩化物の略語はすでに CLであるため、古いバージョンではイオンの名前を変更する必要はありません。それでも、常にイオンの略語を確認してください。
11. 最大50,000ステップの最急降下エネルギー最小化により、タンパク質構造を緩和します。これを行うには、「 gmx grompp -f em.mdp -c solv_ions.gro -p topol.top -o em.tpr 」と入力し、 その後に「gmx mdrun -v -deffnm em」と入力します。
    注:溶媒とイオンは、(i)粒子数(N)、システム容量(V)、温度(T)が一定(NVT)、(ii)粒子数(N)、システム圧力(P)、温度(T)が一定(NPT)の2つの相でタンパク質の周りで平衡化されます。温度カップリング(NVT相)は、改良型Berendsenサーモスタットに基づいて300Kに設定され、圧力カップリング(NPT相)はParrinello-Rahmanに基づいて1バールに設定されています。長距離静電相互作用と最近隣探索は、それぞれ粒子メッシュEwald(PME)法とVerletアルゴリズムを使用して自動的に計算されます。
12. NVT の平衡化を行うには、「 gmx grompp -f nvt.mdp -c em.gro -r em.gro -p topol.top -n index.ndx -o nvt.tpr 」と入力し、その後に 「gmx mdrun -v -deffnm nvt」と入力します。
    注意: 温度平衡化にかかる時間は、CPUとGPUにもよりますが、約5分です。システム平衡の場合、シミュレーション時間は 100ps です。
13. NPT の平衡状態には、「 gmx grompp -f npt.mdp -c nvt.gro -r nvt.gro -t nvt.cpt -p topol.top -o npt.tpr 」と入力し、 その後に「gmx mdrun -v -deffnm npt」と入力します。
    注:圧力平衡化にかかる時間は、CPUとGPUにもよりますが、約5分です。システム平衡の場合、シミュレーション時間は 100ps です。
14. システムに 1 ns の平衡化を実行した後、 関数 mdrun を使用して 100 ns の期間で生成を実行します。 md.mdp ファイルを開きます。n ステップで 50000000; 2 ' 50000000 = 100000 ps (100 ns) に変更します。
15. 分子動力学法を生成するには、 gmx grompp -f md.mdp -c npt.gro -t npt.cpt -p topol.top -o md.tpr と入力し、 その後に gmx mdrun -v -deffnm md と入力します。
    注:この期間は約~2日です。MDシミュレーションから生成された軌跡フレームは、10ps間隔でキャプチャされ、二乗平均平方根偏差(RMSD)ベースのクラスタリング解析に利用されます。

4. RMSDベースのクラスタリング分析

1. MDシミュレーションの後、コマンド解析を続行します。タンパク質は単位細胞を通って拡散し、「壊れた」またはボックスの反対側に「ジャンプ」して見える場合があります。「gmx trjconv -s md.tpr -f md.xtc -o md_center.xtc -center -pbc mol -your compact」と入力します。タイプ1はタンパク質をセンタリングし、0はシステムの出力です。vmd em.groと入力して、タンパク質を可視化します。
2. 全エネルギー解析の場合は、「 gmx energy -f md.edr -o totalenergy.xvg」と入力し、総エネルギーについては「 14 」と入力します。
   注:総エネルギーの監視は、MDシミュレーション^47,48の信頼性と正確性を確保するための基本です。
3. RMSD 解析の場合は、「 gmx rms -s md.tpr -f md_center.xtc -o rmsd.xvg -tu ns 」と入力します。RMSD計算の最小二乗適合のC-αには 3 を、C-αには 3 を続けます(図5)。
4. RMSF 解析の場合は、「 gmx rmsf -s md.tpr -f md_center.xtc -o rmsf.xvg –res」と入力します。タンパク質については 引き続き1 型に進みます。
5. grace を使用するには、次のコマンド xmgrace totalenergy.xvg を入力します。グラフボックスの線をダブルクリックして軸を調整します。 「Grace: Axes 」ボックスが表示されます。 [同意する] をクリックします。
6. タブ メニューで、[ファイルとPrint_setup] をクリックします。 猶予:デバイスのセットアップが表示されます。デバイスをPostScriptからJPEGに変更します。[同意する] をクリックします。 次に、ファイルメニューの[印刷]をクリックします。totalenergy.jpgとして保存します。
7. xmgrace rmsd.xvg と xmgrace rmsfxvg について、ステップ 4.5 と 4.6 を繰り返します。
8. クラスター分析の場合は、「 gmx cluster –s md.tpr –f md_center.xtc –g cluster.log –sz cluster-size.xvg –clid clus-id.xvg –cl cluster.pdb –cutoff 1.0」と入力します。 続けて、最小二乗適合値を計算するにはタイプ 1 (タンパク質グループ) に進み、システム出力の RMSD とタイプ 1 (タンパク質グループ) を計算します。
   注: クラスタリング結果に応じてカットオフ値を調整します。コマンド -cl は、各クラスターの平均の出力を表します。
9. cluster-size.xvg を開きます。
   1. 提供された情報に基づいて、クラスターの数が少ない場合は RMSD カットオフ値を増やし、クラスター数が多い場合は RMSD カットオフ値を小さくします。
10. 異なるカットオフ値で手順4.8を繰り返します。
    注:最適なRMSDカットオフ値が次の基準に基づいて決定されるまで、異なるカットオフ値を持つクラスタリング:(1)クラスターの総数は30未満に制限する必要があります。(2)メンバーが1つだけのクラスターの存在を最小限に抑えることが好ましい。(3)軌道の90%以上が10個未満のクラスターで表されることが望ましい。
11. Chimera ソフトウェアを開き、cluster.pdb を検索します。
    注: cluster.pdb には、各クラスタ グループの平均が含まれています。
12. [プレゼント] と [出版物 1] (シルエット、丸みを帯びたリボン) をクリックします。
13. 次に、[ファイル]>[画像を保存]>[保存]に移動します。
14. 「Select (> Chain > (no ID) > cluster.pdb 」をクリックします。「インバート>選択(すべてのモデル)」をクリックします。「Actions」>「Atoms/Bonds」をクリックして>削除します。
    注: これにより、クラスタ 1 を除くすべてのグループ クラスタが削除されます。
15. 次に、[ファイル]に移動し>PDBを保存し >保存します。cluster1.pdb として保存します。
16. 異なるクラスターについて、手順 4.11 から 4.15 を繰り返します。cluster2.pdb、cluster3.pdb、および cluster4.pdb として保存します。
    注:上位4つのクラスターの総数が全軌跡の90%を超えるため、上位4つのクラスターの各代表を抽出し、Chimeraを使用して分子ドッキング分析を行います( 図6を参照)。

5. アンサンブルベースのドッキング

1. Autodock Tools ソフトウェアをダブルクリックします。
   注:ドッキングについては、この研究ではAutoDockおよびAutoDockツールソフトウェア13,49,50,51を使用しました。
2. cluster1.pdb と ligand.pdb ファイルを新しいフォルダに配置します。
3. メニューで、[ファイル] > [プリファレンス] > [設定] をクリックします。[ユーザー設定の設定]ボックスが表示されます。「新しいフォルダ」のアドレスをテキストとしてコピーします。スタートアップディレクトリのアドレスを[ユーザー設定の設定]ボックスに貼り付けます。[設定] をクリックします。
   注: これは、Windows OS を使用している場合に重要な手順です。
4. 青いフォルダ画像をクリックします。読み込んだ分子フォルダが飛び出します。cluster1.pdb を選択します。
   注:Autodockツールは、タンパク質の分子構造を読み取ります。
5. 「>料金の編集」をクリックして>Kollman 料金を追加します。 次に、[OK]をクリックします。「Edit > Hydrogens」をクリックして>非極性をマージします。
   注:コールマン電荷はタンパク質に追加されます。
6. Grid > Macromoleculesをクリックし>選択します。 「高分子を選択」ボックスが飛び出します。cluster1 を選択し、[Select Molecules] をクリックします。[OK] をクリックします。Modified AutoDock4 Macromoleculeファイルが表示されます。cluster1.pdbqt として保存します。
7. ワークスペースを空にするには、「 編集 」> 「削除 」> 「すべての分子を削除」をクリックします。 「続行」をクリックします。
8. 「Ligand」をクリックし>入力を開いた>。 Autodock4フォルダのLigandファイルが表示されます。[すべてのファイル] を選択し、ligand.pdb を選択して [開く] をクリックします。[OK] をクリックします。
   注:セットアップ配位子には、ガスタイガー電荷の組み込みと非極性水素の合体が含まれます。
9. 「Ligand > Torsion Tree」をクリックし>「Detect root」をクリックします。
10. 「Ligand > Output > Save as PDBQT」をクリックします。 Formatted Autotors Moleculesフォルダが表示されます。ligand.pdbqt として保存します。
11. ワークスペースを空にするには、「 編集 」> 「削除 」> 「すべての分子を削除」をクリックします。 「続行」をクリックします。
    注意: 手順 5.6 で説明したのと同じ手順に従います。
12. Grid > Macromolecules > Open(開く)をクリックします。cluster1.pdbqt を選択し、[開く] をクリックします。 [はい] をクリックします。[OK] をクリックします。
13. [グリッド] をクリックして>マップタイプを [オープンリガンド>設定] をクリックします。ligand.pdbqt を選択し、[開く] をクリックします。
    注:ワークスペースには、タンパク質とリガンドがあります。
14. [グリッド] と [グリッド ボックス] をクリックします。[グリッドオプション]ボックスが表示されます。[X 次元のポイント数] で、パラメーターを 120 に調整し、[Y 次元のポイント数] を 120 に、[Z 次元のポイント数] を 120 に設定します。間隔 (オングストローム) を 0.375 に設定します。「中央グリッドボックス」パラメータはデフォルトのままにします。「ファイル」をクリックし、「現在のデータを保存」を閉じます。
    注:グリッドボックスはタンパク質全体を覆っているため、ブラインドドッキングです。
15. 「グリッド>出力」をクリックし>GPF を保存をクリックします。 グリッドパラメータ出力ファイルが表示されます。ファイル名に「grid.gpf」と入力し、[保存] をクリックします。
16. [実行] と [AutoGrid の実行] をクリックします。[AutoGridの実行]ボックスが表示されます。「パラメータファイル名」タブで、「参照」をクリックします。Autogrid パラメータ ファイルが表示されます。grid.gpf を選択します。 「開く」をクリックします。[プログラムのパス名] > [参照] を選択します。autogrid4 ファイルが表示されます。autogrid4.exeを検索し、[開く] > [起動] をクリックします。
    注: フォルダ名にスペースが含まれていないことを確認してください。スペースが含まれていると、実行中にエラーが発生する場合があります。フォルダ autogrid4.exe は https://autodock.scripps.edu/download-autodock4/ からインストールできます。
17. 「 Docking > Macromolecules 」をクリックして> 硬質ファイル名を設定します。 PDBQT Macromolecules ファイルが表示されます。 cluster1.pdbqt を選択し、[開く] をクリックします 。
18. 「Docking」をクリックし>リガンド>選択します。 [Choose Ligands] ボックスが表示されます。リガンドを選択し、[リガンドの選択]をクリックします。AutoDpf4 リガンド パラメーター ボックスが表示されます。[同意する] をクリックします。
19. 「ドッキング」>「パラメータ」>「遺伝的アルゴリズム」をクリックします。「遺伝的アルゴリズム・パラメータ」ボックスが表示されます。GA Runsの数を100に変更します。 残りのパラメータはデフォルトのままにします。[同意する] をクリックします。
20. [ Docking > Output > Lamarckian GA(4.2))] をクリックします。 Autodock4.2 GALSドッキングパラメータ出力 ファイルが表示されます。ファイル名として 「docking.dpf 」と入力し、[保存] をクリックします 。
21. 「実行」>「AutoDock の実行」をクリックします。[Run Autodock] ボックスが表示されます。「パラメータ・ファイル名」で、「ブラウズ」をクリックします。autodock4 パラメータ・ファイルが表示されます。docking.dpf を選択します。 「開く」をクリックします。「プログラム・パス名」で、「参照」をクリックします。autodock4 ファイルが表示されます。autodock4.exe を検索して [開く] をクリックします。「起動」をクリックします。
    注: フォルダ名にスペースが含まれていないことを確認してください。スペースが含まれていると、実行中にエラーが発生する可能性があるためです。所要時間は~30分です。フォルダ autodock4.exe は、次のリンクを使用してインストールできます:https://autodock.scripps.edu/download-autodock4/。
22. ステップ 5.7 で説明したように、すべての分子を削除します。
23. cluster2.pdb、cluster3.pdb、cluster4.pdb について、5.1 から 5.22 の手順を繰り返します。
    注: 4 つのドッキング グループすべてが解析に使用されます。

6. アンサンブルベースのドッキング解析

1. AutoDockツールソフトウェアを使用して解析を続行します。「解析」をクリックして>ドッキング・>を開きます。 ドッキングログファイルが表示されます。docking.dlg を選択し、[開く] をクリックします。次に、[OK] をクリックします。
2. 「Analyze > Macromolecules」>「Open」をクリックします。
3. 「Analyze > Conformations > Play, ranked by energy」をクリックします。リガンドボックスが表示されます。
4. 新しいフォルダで、メモ帳を使用してdocking.dlgフォルダを開きます。コンフォメーションのクラスター解析を検索します。与えられた情報から、結合エネルギーが最も低いコンフォメーションラン(Runと記載)を検索します。
   注:100のコンフォメーションが実行されているため、リガンドとタンパク質の間に最も強い結合親和性を持つのは1つだけです。最も低い結合エネルギーの用語は、より強い結合親和性52,53,54を有すると定義される。
5. ステップ6.3(リガンド ボックス)から、コンフォメンスラン(ステップ6.4)を入力し、 Enterキーを押します。
   注:リガンドは、それに応じてタンパク質内に位置します。
6. リガンドボックスで、ボタン オープンパネル プレイオプションを変更します。「プレイオプションの設定」ボックスが表示されます。「複合施設を作成」をクリックします。受容体フォルダの書き込み複合体が表示されます。complex.pdb として保存します。
   注: クラスタ グループは 4 つあるため、 complex.pdb ファイルには、クラスタ グループ 1 の complex1.pdb など、適切な名前を付けることができます。
7. Chimera ソフトウェアを開き、 complex.pdb を検索します (手順 6.6 を参照)。
8. [プリセット] > [インタラクティブ 1] (リボン) > [パブリケーション 1] (シルエット、丸みを帯びたリボン) をクリックします。
9. 次に、[ ファイル ]に移動し、[ 画像を保存]をクリックします。
   注:保存されている画像は、FB-LYZコンプレックスのリボン構造です。
10. 「Interactive 3 (疎水性サーフェス)」>「Publication 1 (シルエット、丸みを帯びたリボン)」>「プリセット」をクリックします。
    注:保存されている画像は、FB-LYZコンプレックスのバルーン構造です。
11. Discovery Studioソフトウェアを開きます。
12. complex.pdb をソフトウェアの空きスペースにドラッグします。
13. 「ツール」タブをクリックし、「2D ダイアグラムを表示」を選択します。
    注意: ソフトウェアは、複合施設の2D構造を自動的に生成します (図7)。
14. 「ファイル」および「名前を付けて保存」をクリックします。 ファイル名を入力し、[保存]をクリックします。

結果

最適化後のFBの化学構造と3D構造表現を図8Aに示します。図8Bは、MDシミュレーション前の初期状態でのpdbコード1LYZのリゾチームの3D構造を示しています。リゾチームの3次元構造のダイナミクスと柔軟性を研究するために、100 nsのMDシミュレーションを実施しました。シミュレーション中、タンパク質構造の全エネルギーは安定していました(図9Aを参照)。MDシミュレーションの最初の20nsでは、RMSD値の増加が明らかになり、その後、RMSD値が安定しました(図9B)。RMSF解析の結果、MDシミュレーション期間中に大きな変動が見られた残基は、タンパク質の残基番号40〜50、60〜80、およびタンパク質末端の100であることが明らかになりました(図9C)。MD軌道のコンフォメ...

ディスカッション

コンピュテーショナル創薬におけるアンサンブルベースの応用には、結晶構造に由来する多数のコンフォメーションアンサンブル、核磁気共鳴(NMR)研究、または分子動力学シミュレーションの利用が含まれます²⁶。複数の計算コンフォメーションを活用することで、タンパク質構造のダイナミクスと柔軟性を解析に組み込むことができ、潜在的な薬剤候補を特定する際の精度と信頼性の向上につながります。

アンサンブルベースのドッキング解析を適用するには、いくつかの重要な手順に従う必要があります。まず、実験データから得られた多様なタンパク質の立体配座のセット、またはこの研究では、コンフォメーションのセットが計算シミュレーションから生成されました。これらのコンフォメーションは、標的タンパク質の固有の柔軟性とコンフォメーションの変動性を捉えています。最近の研究では、分子動力学シミュレーションの実装を統合して、コンフォメーションの変化を捉え、アロステリック部位を探索し、新しい結合ポケットと潜在的な薬物標的の...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
AutoDock	スクリップス研究所、米国	バージョン 4.2.6
AutoDock ツール	スクリップス研究所、米国	バージョン 1.5.6
アボガドロ	Geoffrey R Hutchison、ピッツバーグ大学化学部、ピッツバーグ、米国	バージョン 1.95
ディスカバリー スタジオ	ダッソー システムズèmes、マサチューセッツ州、米国	バージョン 2021
GROMACs	ニンゲン大学 王立工科大学 ウプサラ大学、スウェーデン	2023
UCSF Chimera	Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics カリフォルニア大学	バージョン 1.16