定量的不可逆テザリングアッセイを用いた共有結合フラグメントのスクリーニング

Summary

定量的不可逆テザリング(qIT)アッセイは、標的タンパク質と選択的に結合する共有結合フラグメントを同定する蛍光ベースの方法です。ここでは、qITアッセイを説明するための詳細なプロトコルの概要と、結果の例を示します。

Abstract

特定の標的タンパク質と共有結合を形成する化合物は、化学プローブや治療薬としてさまざまな利点を提供します。最も一般的には、軽度の反応性で求電子性小分子を使用して、特定のタンパク質の選択されたシステイン側鎖と共有結合を形成します。リガンド探索における求電子ファーストのアプローチは、求電子性低分子のライブラリーをタンパク質ターゲットに対してスクリーニングするもので、時間のかかる求電子性弾頭の下流設置が不要になるため、普及しています。しかし、求電子リガンドはシステインとの自然反応の速度が広範囲に異なるため、このようなスクリーニングは複雑です。定量的-不可逆テザリング(qIT)は、これらの固有の化合物反応性の違いのデータを正規化する、ヒットの同定と開発のための蛍光ベースの方法を提供します。個々の化合物と標的タンパク質との反応速度を決定し、非構造化トリペプチドグルタチオン(これは自発的化合物反応の代理)との化合物反応性と比較することで、目的のタンパク質と優先的に反応する化合物の同定が可能になります。この方法論は、SARS-CoV-2メインプロテアーゼ、サイクリン依存性キナーゼ2、RAP27Aなど、いくつかの薬物標的に対する選択的な共有結合フラグメントの同定にうまく適用されています。ここでは、qITを標的タンパク質に適用して定量的で堅牢なデータセットを生成する方法を示し、将来の開発のためにヒットリガンドの優先順位付けを可能にします。

Introduction

システイン反応性標的共有結合子(特定のタンパク質上の選択されたシステイン残基と反応することにより生物学的効果を発揮する分子)は、ここ数十年で化学ツールや治療薬としてますます人気が高まっています¹。これらは通常、軽度の反応性求電子剤(アクリルアミド、クロロアセトアミド、ビニルスルホンなど)を、タンパク質標的²に対して高い親和性を持つリガンド部分に付加したものです。理想的には、リガンド-タンパク質相互作用は、最初の非共有結合リガンド結合を含む2段階のメカニズムを介して進行し、その後、標的システインと求電子剤³との間に不可逆的な共有結合が形成されます。

Brutonのチロシンキナーゼ阻害剤であるイブルチニブを含むいくつかの初期の標的共有結合リガンドは、以前に同定された可逆的リガンドに求電子ハンドル⁴を提供することによって開発されました。しかし、このアプローチは常に成功するとは限らず、他の試みでは、親電子剤の設置には大幅な最適化が必要であることがわかっています⁵。それどころか、特に求電子フラグメントを用いた求電子ファーストのアプローチが近年人気を集めています。これらは典型的には、求電子試薬のライブラリーをタンパク質とインキュベートし、次いでシステインに対する反応速度が増強された化合物を選択することを含み、これはリガンドと結合ポケット^との間の生産的な非共有結合的相互作用によって誘導されると想定される6。特に、これらの方法は、KRAS(G12C)阻害剤であるソトラシブ¹の開発中に成功裏に適用されました。

求電子剤優先のスクリーニングは、従来の非共有結合性リガンドスクリーニングと比較すると、主に弾頭クラス内および弾頭クラス間の反応性に大きなばらつきがあるため、いくつかのユニークな課題を提起します⁷。ほとんどのシステイン反応性求電子試薬は、標的タンパク質の選択的相互作用に関係なく、時間の経過とともに、溶媒に曝露されたすべてのシステイン残基と反応します。したがって、リガンド占有率は、ほとんどすべての求電子試薬で時間とともに増加し、反応性を制御しないと、ヒット選択は、より迅速にターゲットに関与するより反応性の高いフラグメントに偏ることがよくあります⁸。

さらに、求電子剤ファーストのスクリーニング法では、質量分析を使用してタンパク質-リガンド付加体形成を検出することが多く、スループットには制限があります⁹。さまざまな求電子性を持つ化合物のライブラリーの反応速度を適切に特徴付けるためには、長期間(数時間から数日)にわたる定期的な反応サンプリングが必要です¹⁰。したがって、10 の時点でサンプリングされた 300 個のフラグメントのスクリーニングでは、3000 個の質量スペクトルを実行する必要があり、これはほとんどのタンパク質質量分析システムのスループットを超えています。したがって、タンパク質-リガンド付加体形成をモニタリングするハイスループットな方法が望まれます。

ここで概説したアプローチである定量不可逆テザリング(qIT)アッセイは、内因性反応性を制御し、単純な蛍光読み出しを利用する求電子剤ファーストのスクリーニング法です⁷。タンパク質、またはグルタチオン(内因性反応性のコントロールとして使用される非構造化のチオール含有トリペプチド)を求電子フラグメントのライブラリーとインキュベートし、通常のサンプルをCPM(7-ジエチルアミノ-3-(4'-マレイミジルフェニル)-4-メチルクマリン、蛍光性チオール定量剤)の溶液にクエンチします。システインと求電子フラグメントとの間の付加物形成は、CPMとの反応に利用可能なチオールの量を減少させ、クエンチング時に生じる蛍光を減少させます。したがって、CPM蛍光は未反応のチオールの代理として機能し、各求電子フラグメントとのチオール反応の速度論を決定することができます。グルタチオンよりもタンパク質反応性が著しく高い求電子フラグメントをヒットとして選択し、さらなる開発に優先的に選別します(図1)。

図1:qITの概略図。 qITアッセイの概略図。(BioRenderを使用して作成)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

REF値を用いたヒット選択は、固有の反応性を制御し、タンパク質ターゲットとの生産的な非共有結合的相互作用を形成するフラグメントのみがヒットとして選択されるようにします。また、蛍光の読み出しが簡単なため、qITアッセイは非常にスケーラブルで、質量分析ベースの反応モニタリング方法が不要です。

ここでは、qITアッセイの包括的な手順を概説し、アッセイの性能とヒット選択を示すために結果の例を挙げて説明します。

Protocol

1. フラグメントライブラリの構築

1. 求電子フラグメントのライブラリを設計し、それらを合成または購入します。求電子性フラグメントライブラリは、通常、反応性が軽度の求電子剤(アクリルアミド、クロロアセトアミド、ビニルスルホンアミドなど)にさまざまな化学スキャフォールドが付加されたもので構成されています。求電子フラグメントライブラリは、商用サプライヤーから広く入手可能であり、その設計と構造に関するより詳細なレビューは、他の場所でレビューされています^5,11。
2. 各化合物を DMSO で 50 mM の濃度に溶解し、次に異なる化合物を 384 ウェルリザーバープレート(フラグメントライブラリープレートと呼ばれる)のカラム 3 から 22 の各ウェルに分注します。
   1. カラム1、2、23、および24の各ウェルにDMSOを分注し、ポジティブコントロールとネガティブコントロールを行います。プレートレイアウトは、スクリーニングする化合物の数によって異なります(図2)。ライブラリープレートに追加される容量は、qITスクリーニングごとに各ウェルから約1.8 μLが必要であることを考慮し、実行するスクリーニングの数によって異なります。このフラグメントライブラリープレートをあらかじめ準備し、4°Cで保存してください。

図2:プレートレイアウト。 qIT assay 384ウェルプレートレイアウトの概要。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

2. アッセイのセットアップ(図3)

1. 組換えタンパク質溶液(任意のバッファー中の標的タンパク質)、qITアッセイバッファー(150 mM NaCl、25 mM Hepes(pH 8))、qITアッセイクエンチバッファー(150 mM NaCl、25 mM Hepes(pH 7.5))、および化合物ストック溶液(DMSO中の求電子フラグメント(50 mM))を調製します。
   注:反応バッファーでは、標的システイン残基とフラグメントとの間の反応を加速するためにpH 8が使用されており、非常に反応性の低いフラグメントでも反応速度を測定できます。CPMのマレイミドとシステインチオールとの間に形成されるチオエーテル結合は、より塩基性のpHで加水分解しやすいため、クエンチバッファーではわずかに低いpH7.5が使用されます(たとえば、以前の研究では、システイン-マレイミド結合体はpH 7.3でpH 8¹²よりもはるかに安定していることがわかっています)。
2. DMSOフラグメントストック溶液を保管から取り出し、室温で最低2時間放置して、コンパウンドストックを解凍します。
3. アルゴンガスで約30分間バブリングすることにより、Degas qITアッセイバッファーを調製します。
4. 標的タンパク質溶液を脱気したqITアッセイバッファーに完全交換します。重要なことは、DTTやTCEPなどの還元剤は、チオールの定量を妨げるため、100 nM<濃度まで徹底的に除去する必要があるということです。この手順は、以下で説明するように、一連のバッファ交換を繰り返すことで実行できます。
   1. 脱気したqITアッセイバッファーを超えるタンパク質溶液をスピンフィルターユニットで希釈し、遠心分離(4000 x g、4°C、15分)を使用して濃縮し、繰り返します。通常、1 mLの組換えタンパク質ストック溶液からDTT(1 mM)を十分に除去するには、15分の1の希釈を4ラウンド行う必要がありますが、このステップは元の組換えタンパク質溶液中の還元剤濃度に応じて調整できます。
      注:あるいは、脱気された大量のqITアッセイバッファーに対して標的タンパク質溶液を透析しても、同じ結果を得ることができます。
5. ターゲットタンパク質溶液(ステップ2.1で生成)を、脱気したqITアッセイバッファー中でタンパク質濃度15 μMに希釈します。384ウェルプレートに十分なデッドボリュームを充填するには、約9 mLの標的タンパク質溶液が必要です。
6. 1.5%(v/v)TCEP-アガロースの懸濁液を脱気したqITアッセイバッファーに調製します。スクリーニングプレートごとに約9 mLのTCEPアガロース懸濁液が必要です。
7. 20 μL の TCEP-アガロース溶液を 2 つの 384 ウェルプレートのすべてのウェルに分注します。
8. 15 μM グルタチオンストックを脱気 qIT アッセイバッファーに調製します。これは、グルタチオンが還元剤なしで溶液中で急速に酸化するため、めっきの直前に準備する必要があります。
9. 20 μL の qIT アッセイバッファーを、両方の 384 ウェルプレートのカラム 1 と 2 に分注します。
10. 20 μL の 15 μM タンパク質またはグルタチオン溶液 (目的のプレートに従って) を 384 ウェルプレートのカラム 3-24 に分注します。これらは、タンパク質反応プレートおよびグルタチオン反応プレートと呼ばれます。RTで1時間減らしておきます。
11. 58.2 μLの脱気したqITアッセイバッファーを384ウェルプレートの各ウェルに分注し、フラグメントライブラリープレートの各対応するウェルから1.8 μLを移して化合物希釈プレートを作成し、各化合物をqITアッセイバッファーと3% DMSOで1.5 mMの濃度に希釈します。
    注:このステップは、384ピペッティングステーションを使用すると、1回の操作ですべてのウェルのコンパウンドストックを移送できるため、より簡単になります。
12. タンパク質とグルタチオンをTCEPアガロースと1時間インキュベートした後、化合物希釈プレートの各ウェルから20 μLの化合物溶液をタンパク質とグルタチオンの両方の反応プレートに移し、アッセイを開始します。このステップは、384ピペッティングステーションでも簡単に行うことができます。アッセイのステップを 図3にまとめます。
    注:フラグメント濃度は必要に応じて変化させることができ、必要に応じて、タンパク質親和性が高フラグメント濃度のアーティファクトではないことを確認するために、低濃度でのヒットに対してqITアッセイを繰り返すことができます。比較的高いフラグメント濃度は、k_proおよびk_GSHを上昇させるために使用されます。これにより、軽度の反応性化合物(アッセイ条件下でt_1/2(GSH)>24時間を表示できる)の正確な速度が決定可能になります。また、500μMのフラグメント濃度は高いが、フラグメントスクリーニングでは高μMから低mMの濃度が用いられている(例えば¹³)。
13. タイマーを開始します - アッセイが開始されており、以下のセクションに従って定期的な時点でクエンチを行う必要があります。

図3:qITアッセイの要約。 qITアッセイ反応ウェルセットアップの主要なステップを示す要約。(BioRenderを使用して作成)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

3. CPMクエンチ

注:CPMクエンチは、タンパク質およびグルタチオン反応プレートに残っている未反応のチオールの量を定量するために行われます。これらは、反応速度を監視できるように、離散的な時点(たとえば、通常は7、15、30、60、120、240、360、1220、および1440分)で実行する必要があります。

1. DMSOにCPMストック溶液(500 μM)を調製し、微量遠心チューブ内の111.2 μLアリコートに分注し、-20°Cで保存します。 これらのCPMストックは事前に準備することができ、クエンチタイムポイントごとに1アリコートが必要になります。
2. CPMクエンチ溶液(1.4 μM)を調製するには、凍結したCPMストック溶液(500 μM)を解凍し、40 mLのqITアッセイクエンチバッファーに添加します。
3. 27 μLのCPMクエンチ溶液を2つの384ウェルプレートの各ウェルに分注します。タンパク質とグルタチオンの両方の反応プレートをクエンチするには2つ必要です。これらはCPM-Quenchプレートと呼ばれ、使用前に最大30分準備します。
4. タンパク質反応プレートを200 x g で3分間遠心分離し、TCEPアガロースがペレット化されていることを確認します。
5. あらかじめ決められた時点で、タンパク質反応プレートの各ウェルから3 μLのサンプルを、あらかじめ充填したCPMクエンチプレートに移します。このステップは、384ピペッティングステーションを使用しても簡素化されます。
6. CPM Quench Plateを吸引して3 x 25 μLで分注して混合します。CPMクエンチングを妨げる下部のTCEPアガロースが吸引されないように、ウェルの上部からサンプルを取り外すことが重要です。
7. グルタチオン反応プレートで手順3.4〜3.6を繰り返します。
8. CPMクエンチプレート(3.4-3.6で調製)を室温で1時間インキュベートします。
9. CPMクエンチプレートの蛍光強度を測定します(384 nmでの励起と470 nmでの発光)。

4. データ分析とヒット選択

1. 各クエンチについて、アッセイ品質の尺度としてZ'を計算します。Z' < 0.5 の CPM クエンチは無視する必要があります。
   Z' = 1 - ((3σ_正制御 + 3σ_負制御) / (μ_正制御 - μ_否定制御))
   ここで、σ = 蛍光強度標準偏差、μ = 蛍光強度平均
2. ネガティブコントロールウェルとポジティブコントロールウェルの平均蛍光値を計算します(それぞれ列1と2、列23と24)。
3. 各反応を、ポジティブコントロールとネガティブコントロールの平均蛍光値によく正規化します。
   % 修飾 = 100 x (化合物井戸蛍光 - ネガティブコントロール蛍光) / (ポジティブコントロール蛍光 - ネガティブコントロール蛍光)
4. グルタチオンと反応する各化合物および標的タンパク質と反応する各化合物の時間に対する修飾率を別々にプロットします。
5. 正規化された % modified 対 time データを、次式を使用して、タンパク質とグルタチオンとの反応の両方について、1 相指数関数的崩壊モデルに当てはめます。
   % 修正値 = ae ^{- kt + c}
   ここで、a = % 修正値の範囲、k = 反応速度、t = 時間、c = 無限時間における % 修正値。カーブフィッティングとパラメータ決定は、商用ソフトウェア(Graphpadなど)を使用して実行できます。
6. フラグメントがタンパク質(k_pro)およびグルタチオン(k_GSH)と反応する速度を使用して、各フラグメントのレート増強係数(REF)値を計算します。
   REF = k_pro / k_GSH
7. REF 値を使用して、ヒットフラグメントを選択します。これは、REFしきい値(例:REF > 3)、任意のヒット率(例:top 2%)を設定するか、またはREF 3標準偏差が幾何平均より大きいフラグメントを選択することによって実行できます。

Results

ここでは、qITアッセイを使用して、名前のない単一システインタンパク質の共有結合フラグメントヒットを同定します。標的タンパク質がMg²⁺イオンに結合することが知られているため、MgCl₂(10 mM)を反応バッファーに添加しました。スクリーニングは3回に分けて行い、各フラグメントが標的タンパク質(k_pro)とグルタチオン(k_GSH)の両方と反応する速度を決定しました。Z'値は、すべてのクエンチプレートで0.5より大きく、タンパク質クエンチで平均0.75、グルタチオンクエンチで平均0.79であり、優れたアッセイ性能を示しました。次に、各フラグメントに対して REF 値が計算され、REF が 3 >ヒットが選択されました。

代表的な結果(図4)は、qITアッセイを用いたヒット選択の一例を示しています。化合物 1 は、グルタチオンよりも標的タンパク質上のシステイン残基と6.0倍高い速度で反応し、REF > 3の基準を使用してヒットとして選択されました(図4B)。この速度加速は、テンプレート効果の存在を示しており、それによって、非共有結合的相互作用が標的タンパク質上のシステインが正しい向きで 1 に位置し、クロロアセトアミド弾頭と反応します。対照的に、 2 は、 2 と標的システイン残基との間の反応が 2 とグルタチオンとの間の反応に比べて加速されないため、非ヒットフラグメントの一例である。速度加速の欠如は、 2 を標的システイン残基と反応するための正しい方向に配置する生産的な非共有結合的相互作用がないことを示しています。

図4:代表的な結果。 その結果、(A)高い内因性反応性、偽陽性の可能性のあるヒットフラグメント、および(B)ヒットフラグメントについて、qITによるタンパク質およびグルタチオン反応のモニタリングが示されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

qITアッセイは、標的タンパク質に対するシステイン反応性求電子フラグメントをスクリーニングするための効果的かつ便利なプラットフォームを提供します。しかし、十分に考慮されていないと、アッセイの性能を妨げる可能性のある重要な考慮事項があります。最も注目すべきは、他のシステイン残基がCPMと反応して蛍光測定を妨害するため、標的タンパク質はqITスクリーニングに適した単一の表面露出システインのみを含む必要があるということです。標的タンパク質に複数の表面露出システインが含まれている以前のケース(SARS-CoV-2メインプロテアーゼ、低分子GTPアーゼRAP27A、サイクリン依存性キナーゼ2など)では、干渉残基が除去されたスクリーニングコンストラクトが以前に成功裏に使用されていました。ただし、この戦略の有効性は、タンパク質10,14,15によって異なります。

さらに、qITアッセイは、CPMと反応するために利用可能なチオールの減少を経時的に測定するため、チオールの酸化やタンパク質凝集など、利用可能なチオールの割合を減少させる要因は、アッセイの性能を妨げる可能性があります。バッファーの脱気と固定化還元剤(TCEP-アガロース)の使用により、チオールの酸化が遅くなり、蛍光測定値をポジティブコントロールウェルの測定値に正規化することで、残りの酸化を軽減する必要があります。ただし、ウェル間でのTCEPアガロースの分布が不均一になると、チオールの酸化が不均一になると問題が発生する可能性があります。したがって、一貫したTCEPアガロースめっきはアッセイ性能に不可欠ですが、TCEPアガロース粒子がピペッティングリザーバーに沈むため、困難な場合があります。

また、アッセイ条件(室温で24時間インキュベーション)が比較的厳しいため、タンパク質の凝集も問題となる可能性があります。標的タンパク質を可溶化タグに融合する、反応バッファーを変更する、または低温でアッセイを実行するなどのトラブルシューティング戦略により、凝集を減少させ、タンパク質の安定性の問題を解決できる可能性があります。また、特定のフラグメントはタンパク質の凝集を誘導することがあり、これによりCPMと反応するために利用可能なチオールの割合が再び減少し、偽陽性のヒットが生じます。インタクトタンパク質質量分析を用いた直交的ヒットバリデーションは、これらのケースを検出する効果的な方法であり、偽陽性のヒットは、標的タンパク質とインキュベートすると標識分子種の小さな集団または存在しない集団を生成するためです。

これらの考慮事項が制御されている場合、qITアッセイには、他の共有結合フラグメントスクリーニング法に比べていくつかの明確な利点があります。REFを使用したヒット選択により、ヒットは、標的タンパク質と生産的な非共有結合的相互作用を形成する場合にのみ選択されます。フラグメントの求電子性は、異なる弾頭間および弾頭クラス内の両方で、広い範囲で異なります。例えば、これまでの研究では、アクリルアミド間のグルタチオン反応性の速度に数百倍の変動があることがわかっています¹⁰。この幅広い求電子性により、テンプレート効果によりk_pro値が高いフラグメントと、単に反応性の高いフラグメントを区別することが困難になり、反応性の高いフラグメントが偽陽性ヒットとして選択される可能性があります。例えば、2は1よりも迅速に標的システイン残基と反応し、固有の反応性を考慮せずに、ヒットとして選択され得る。しかし、2はグルタチオンよりも大きな割合で標的システイン残基と反応しないため、1に対して2のk_プロが高いのは、テンプレート効果ではなく、フラグメントの内因子反応性が高いためであることを示しています。

また、qITアッセイが残存チオールを定量するために使用するシンプルな蛍光読み出しも非常に有利です。共有結合フラグメントスクリーニングの他の方法では、インタクトタンパク質質量分析を使用してフラグメントが標的タンパク質と反応する速度を決定し、LC-MSを使用してグルタチオンがフラグメントと反応する速度を決定しますが、どちらも特殊な装置が必要であり^{、スループットが不足し}ています^8,16。便利な蛍光読み出しにより、qITアッセイは非常にスケーラブルになり、一般的に入手可能な実験装置のみが必要になります。

これらのイノベーションを組み合わせることで、コバレントフラグメントスクリーニングの堅牢でスケーラブルな方法が生まれ、質量分析装置の必要性がなくなります。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
アルゴンガス	BOC	I1149
コーニング 384ウェル、ローフランジ、フラットボトムアッセイプレート	コーニング	3575
CPM	Invitrogen	D346
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
固定化TCEP-アガロー	ピアス	77712
マイクロプレートリーダー	CLARIOstar
PCR プレートシール	BioRad	MSA5001
還元型 L-グルタチオン	Sigma-Aldrich	G4251
塩化ナトリウム	Sigma-Aldrich	S9888
Hepes	ナトリウム Sigma-Aldrich	RES6007H-A7