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方法論記事

酵母全細胞におけるミトコンドリア呼吸の定量化

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DOI:

10.3791/67186

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2024年11月8日

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1School of Chemistry, Universidad Autónoma de Querétaro, 2Department of Biochemical Engineering, Tecnológico Nacional de México/Instituto Tecnológico de Morelia, 3Department of Biochemical Engineering, Tecnológico Nacional de México/Instituto Tecnológico Superior de Ciudad Hidalgo

この記事について

サマリー

酵母全細胞におけるミトコンドリア呼吸は、細胞の生体エネルギー学の貴重な指標です。ここでは、さまざまな酵母種に適用できるこの表現型を定量化するためのプロトコルを紹介します。

要約

代謝は、主に細胞のエネルギー利用可能性と環境条件によって調整されます。細胞がエネルギー代謝をさまざまな栄養条件や環境条件にどのように適応させるかを知るためのアッセイは、分子メカニズムを解明するための貴重な情報を提供します。酸化的リン酸化は、ほとんどの細胞でATPの主要な供給源であり、ミトコンドリアの呼吸活性は酸化的リン酸化の重要な要素であり、ATP合成のためのミトコンドリア膜電位を維持します。ミトコンドリア呼吸は、細胞の状況が欠落している孤立したミトコンドリアで研究されることがよくあります。ここでは、酵母無傷細胞におけるミトコンドリア呼吸を定量化する方法を紹介します。この方法は、出 芽酵母 細胞に一般的に使用されてきましたが、すべての酵母種に適用されます。 まず、特定の条件下での酵母の増殖がテストされます。次に、細胞を洗浄し、脱イオン水に1:1の比率(w / v)で再懸濁します。次に、細胞を絶えず攪拌しながら酸素濃度計チャンバーに入れ、クラーク電極を使用して酸素消費量を定量化します。いくつかの分子は、チャンバ内に逐次的に配置され、電子伝達鎖またはATP合成に対するこの影響に従って選択される。ATPアーゼ阻害剤オリゴマイシンは、ATP合成と共働した呼吸を測定するために最初に添加されます。その後、アンカプラーを使用して最大呼吸容量を測定します。最後に、電子伝達鎖阻害剤の混合物を添加して、ミトコンドリア呼吸とは無関係の酸素消費を廃棄します。データは線形回帰を使用して分析され、酸素消費率を表す傾きが得られます。この方法の利点は、酵母のミトコンドリア呼吸に特異的であり、細胞の状況を維持することです。ミトコンドリア呼吸の定量化に使用される阻害剤は、酵母種によって異なる可能性があることを強調することが重要です。

概要

ミトコンドリアは、ほとんどの細胞にとってATPの主要な供給源であり、いくつかの経路が収束してミトコンドリア経路の活性に依存するため、細胞の生体エネルギー学において基本的な役割を果たします1。電子輸送鎖を介した電子輸送を組み合わせて酸素とF1F 0-ATPase活性を還元するATP合成には酸化的リン酸化が必要であり、電子フラックス2によって生成されるミトコンドリア膜電位を使用してATPを合成します。したがって、ミトコンドリア呼吸は酸化的リン酸化の一部です3。

ミトコンドリア呼吸鎖は、4つの複合体、または場合によっては、I欠損酵母複合体(例えば、Saccharomyces cerevisiae)、3つの複合体、および3つのデヒドロゲナーゼタンパク質4を含む。呼吸器複合体はミトコンドリア内膜に局在しています。一部の酵母は、複合体I(NADHデヒドロゲナーゼ)または3つのNADHデヒドロゲナーゼ、ユビキノン(Co Q)、複合体II(コハク酸ユビキノン酸化還元酵素)、複合体III(ユビキノンシトクロム酸化還元酵素)、シトクロムc(Cyt c)、および複合体IV(シトクロムcオキシダーゼ)5,6で標準的な電子伝達鎖を示します。.錯体を通る電子輸送により、ミトコンドリアマトリックスから膜間空間へのプロトンのポンピングが可能になり、ミトコンドリア膜電位7が形成される。膜間空間に位置する陽子は、F1F 0-ATPaseによってミトコンドリアマトリックスに向かって逆方向にポンプで送られ、励起された4つの陽子ごとに1つのATP分子を合成します8。

ミトコンドリア呼吸測定は、ミトコンドリアの完全性、細胞の生体エネルギー、およびミトコンドリアの呼吸能力9に関する貴重な洞察を提供します。ミトコンドリアの呼吸機能は、さまざまな手法を使用してin vitroまたはin situで分析できます。 しかし、無傷の細胞におけるミトコンドリア呼吸分析は、全細胞を使用する際に細胞の環境との相互作用および細胞内代謝が考慮されるため、細胞全体の代謝を含むため、一連の利点を提示する可能性がある10。さらに、無傷の細胞を用いることで、種々の実験条件の評価を容易にし、単離されたミトコンドリアでは観察できなかった最小限の変化を検出することができる10,11。無傷の細胞におけるミトコンドリア呼吸の定量化のもう一つの利点は、ミトコンドリアの増殖と局在化の影響が保持されることである12。

哺乳類のミトコンドリアの無傷の細胞での呼吸は、酵母などの他の真核生物の研究を除けば、非常に詳細に説明されています12。ここでは、哺乳類のプロトコルから酵母に適応したミトコンドリア呼吸を定量化する技術を提案します。したがって、ミトコンドリア呼吸の哺乳類の定量化からの概念がこの技術で利用されています。例えば、この技術は哺乳動物のプロトコルとしてさまざまな段階に分けられます:1)基礎呼吸(基質依存性)、2)ATP結合呼吸(ATP合成酵素の阻害による)、3)最大呼吸容量(内ミトコンドリア膜を介して陽子の透過性を可能にするアンカプラーを使用)、4)ミトコンドリア呼吸阻害(呼吸鎖阻害剤の混合物を利用して、他の供給源の酸素消費を廃棄します)。ミトコンドリア呼吸)11,13.したがって、この論文は、酵母のミトコンドリア呼吸を定量化するためのプロトコルを提示することを目的としています。

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プロトコル

1. 培地と接種物の調製

  1. 酵母抽出物1g、カゼインペプトン2g、グルコース2gを95mLの蒸留水に加え、酵母エキス-ペプトン-デキストロース培地(YPD)100mLを調製します。3 mLを10 mLガラス試験管に分配し、121°Cおよび1.5 psiで15分間滅菌します。
    注:培地は4〜8°Cで最大1か月間保存できます。
  2. 3 mLのYPD培地を含む10 mLのガラス試験管に、-20 °Cのグリセロール保存酵母細胞250 μLを接種します。200 rpmおよび30°Cで一定に撹拌しながら一晩インキュベートします。
    注:インキュベーション温度は、一部の酵母種で異なる場合があります(たとえば、 Kluyveromyces marxianus の最適な増殖温度は37°Cです)。
  3. ペトリ皿(60 x 15 mm2)に滅菌2%YPD寒天(酵母抽出物10 g、カゼインペプトン20 g、グルコース20 g、細菌寒天20 gを蒸留水950 mLに加える)を充填し、滅菌ループを使用して10 mLガラス試験管で増殖させた酵母細胞をペトリ皿に縞模様にします。分離されたコロニーが現れるまで、ペトリ皿を30°Cでインキュベートします。
  4. 3 mLのYPD培地を2%グルコースで含んだ滅菌10 mLガラス試験管に、ペトリ皿から2つまたは3つの酵母単離コロニーを接種することにより、前接種物を準備します。30°Cで一定の攪拌を行いながら一晩インキュベートします。

2. 生育条件と実験計画

  1. 100 mL の滅菌合成完全培地 (SC 培地; 0.18 g のアミノ酸を含まない酵母窒素塩基、0.5 g の硫酸アンモニウム、0.2 g のリン酸二カリウム、1 g の酵母合成ドロップアウトサプリメント、およびグルコース (実験デザインに従って、98.02 mL の蒸留水に) を含む 500 mL の三角フラスコに、初期 OD600 ~ 0.1 で酵母培養液を接種します。 これは、一晩の接種前投与量の約 3 mL (OD600 ~ 3) です。環境条件を設定するか、ミトコンドリア呼吸で試験する化学的課題を補足します(例:100 μMレスベラトロールを添加します)。化学的課題のために、別のフラスコに車両制御を準備します。少なくとも 3 つの生物学的複製をテストします。
    注:アッセイでは栄養ノイズを廃棄するために最小限の培地を使用することが推奨され、この時点で提案されている最小培地は 出芽酵母 に使用され、他の酵母種とは異なる可能性があります。最後に、培養培地に補充されるグルコース濃度は、グルコース抑制やミトコンドリア呼吸を阻害するクラブツリー効果を回避するために重要です。0.5%(W / V)未満の濃度は、ミトコンドリア呼吸で良好な反応を示し、 S.cerevisiaeの高成長率を伴いました。Crabtree陰性の酵母では、高グルコース濃度はミトコンドリア呼吸に影響を与えませんでした(例:.、 K.マルキシアナス)。
  2. 空の50 mLコニカルチューブを秤量し、それを使用して、4000 x gで5分間遠心分離することにより、中対数相(OD600~0.5)で細胞を回収します。
    注:ミトコンドリア呼吸の試験には、エネルギー代謝がより活発になる成長期であるため、中間対数期が推奨されます。
  3. 上清を捨て、ペレットを25mLの脱イオン水で3回洗浄します。コニカルチューブをペレットセル(湿重量)で計量し、コニカルチューブの重量を差し引いてセルラーウェットウェイトを求めます。
  4. ペレットを2 mLの脱イオン水に再懸濁します。
  5. 湿重量を2で割って細胞濃度を記録し、mgの細胞数/mLを求めます。この値は、アッセイに50 mgの細胞を添加するためにどれだけの量を追加する必要があるかを決定するために不可欠です。

3. 酸素消費量測定法(ポーラログ法)

  1. クラーク型酸素電極をYSI5300Aモニターとコンピュータに接続してデータ取得を行います。
    1. pH 6に調整したモルホエタノールスルホン酸5 mLを、トリエタノールアミン(MES-TEA緩衝液;10 mM)および細胞50 mg(湿重量)とともにポーラログラフチャンバーに入れます。電極は、気泡が出ないように注意しながら、そっと置きます。
    2. YSI5300Aモニター、データ収集用のコンピューター、および攪拌用のチャンバーの電源を入れます。YSI5300Aモニターを設定するには、AIRで チャンネル1設定ダイヤル を選択します。チャンネル1キャリブレーションダイヤルでチャンネル1を 100% に調整し、信号を100%で5分間安定させます。
    3. コンピューターにデータを記録し、クロノメーターを使用して時間を測定します。
      メモ: YSI5300Aモニタには、データ収集コンピュータやプログラムはありません。これは、ユーザーが外部に実装できます。
    4. 酸素濃度計チャンバー内の電極の横方向のチャネリングを使用して、酸化性基質、オリゴマイシン、アンカプラー、および呼吸鎖阻害剤の混合物を順次追加します。
  2. 酸化性基質(グルコース、グリセロール、L-乳酸、または実験デザインによる別の炭素源)をクロマトグラフィーシリンジで最終濃度10 mMまで添加します。チャンバーは常に閉じたままにし、常に攪拌してください。基礎呼吸を決定するために、2〜3分間の空気消費量を記録します。
    注:グルコース、グリセロール、およびL-乳酸は、呼吸鎖の異なる部位で電子伝達鎖を分析するために使用されます:グルコース代謝はNAD +を減少させてNADHを形成し、呼吸鎖全体の分析に利用されます。グリセロールは電子をユビキノンに伝達し、ユビキノンからの呼吸鎖を評価するために使用されます。最後に、L-乳酸はその電子をシトクロムcに譲り、シトクロムcからの効果を決定するために使用されます14。これらの基質は、酵母種の酵素能力によって異なります。
  3. オリゴマイシンを添加し、クロマトグラフィーシリンジを使用して酸素濃度計チャンバー内の最終濃度0.01 mMを取得し、ATP関連呼吸を評価し、2〜3分間の空気消費量を記録します。
  4. アンカプラーである 3-クロロフェニルヒドラゾン カルボニル シアン化物 (CCCP) を補充して、オキシメータ チャンバー内の最終濃度 0.015 mM をクロマトグラフィー シリンジで取得し、最大呼吸容量を決定し、2 〜 3 分間の空気消費量を記録します。
  5. クロマトグラフィーシリンジを使用して、電子伝達鎖阻害剤を添加します:最初に2-テノイルトリフルオロアセトン(TTFA)を、次にアンチマイシンA(AA)をそれぞれ最終濃度1 mMおよび1 mg / mLで追加します。各阻害剤を2〜3分間測定します。
    注:電子伝達鎖の阻害剤は、酵母種間で異なる可能性があります。この手順では、これを考慮する必要があります。
  6. 各炭素源(グルコース、グリセロール、L-乳酸など)を個別にスクリーニングします。炭素源ごとに手順3.3から3.5を繰り返します。使用後は、チャンバーを70%エタノールで3回、脱イオン水で3回洗浄してください。

4. データ処理

  1. 酸素消費曲線(空気の割合と時間のプロット)を使用して、酸化性基質(基礎呼吸)、オリゴマイシン(ATP結合呼吸)、CCCP(最大呼吸)、AA、TTFA(ミトコンドリア呼吸ではない)の傾きを計算します。 図1)。以下で説明するように、線形回帰を使用して、各補足化合物の個々の傾きを計算します。
    1. 統計ソフトで新しいプロジェクトファイルを作成します。[作成] セクションで [XY ] を選択します。[データテーブル]セクションで[ 新しいテーブルにデータを入力またはインポート ]オプションを選択します。
    2. [オプション]セクションの[X]サブセクションで [数値 ]を選択します。[オプション]セクションの[Y]サブセクションの [並べて並べたサブ列に3つのレプリケート値を入力する ]をクリックします。
      注 : テーブル形式には 1 つの X 列と複数の Y 列があり、それぞれに A: Y1 と A: Y2 という名前の 3 つのサブ列があります。
    3. X列に時間データを入力します(例:0、2、4、6、8秒または0、1、2、3分)。Y列に空気の割合を記入します。
    4. 線形回帰適応度を作成します。メニューバーの 「分析 」をクリックします。「分析」オプションで、「XY分析の 単純線形回帰 」を選択し、「 OK」をクリックします。
    5. 傾きの値は、画面左側の「Results in Data」テーブルから取得します。
  2. データシートに傾き値を記入し、ミトコンドリア呼吸とは異なる源からの酸素消費を廃棄するための酸化性基質、オリゴマイシン、およびCCCPから得られた傾きから、呼吸阻害剤混合物(AAおよびTTFA)から得られた傾き値を差し引きます。
  3. 得られた値に237μMのO2を掛けます。この値は、25°Cで空気(20.9%O2)と平衡化された緩衝ミトコンドリア培地でのO2の溶解度と見なされます。この値は、使用する温度、高度、およびバッファーによって異なります。
  4. 分に変換します。得られた値は、時間のプロット方法に応じて、時間あたりのO2 のμMであり、O2 /分のμMが得られます。
  5. 50、つまり使用した細胞のmgで割ります。細胞Mgは、実験デザインによって異なる場合があります。最後に、酸素消費量は、O2 / mgの細胞のμMx分として表されます

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結果

このミトコンドリア呼吸法は、Scheffersomyces stipitis15 や K. marxianus16 など、S. cerevisiae 以外の酵母種にも使用できます。ただし、代表的な目的で、S.cerevisiaeからの結果のみを提示します。S. cerevisiaeが低グルコース濃度(0.8 mM未満)で主要な呼吸器代謝を示すことはよく知られています17,18。したがって、S. cerevisiaeの呼吸器表現型を裏付けるために、ミトコンドリア呼吸の刺激(0.5%グルコース)と制限(5%グルコース)の2つのグルコース濃度で増殖させた18,19。予想通り、基礎呼吸(酸化性基質)、ATP結合呼...

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ディスカッション

ミトコンドリア呼吸のリン酸化は、ミトコンドリア膜電位に依存し、酸化的リン酸化を通じてATPレベルを維持するいくつかの経路で基本的な役割を果たします。環境条件や栄養条件が酵母のミトコンドリア呼吸にどのように影響するかを理解することは、分子メカニズムを解明するためのツールとして役立ちます。

この方法から信頼性の高い結果を得るには、次の重要な手順を考慮することが不可欠です。>200rpmの攪拌は、ミトコンドリア呼吸をテストするために呼吸成長条件下で十分なバイオマスを得るために重要です。200rpm未満の攪拌条件は、成長不良とバイオマス形成を引き起こし、中丸太成長段階に到達するまでに時間がかかり、細胞は酸素化されていない環境で生存するため、酸素消費率に影響を与える可能性があります。培地中のグルコース濃度は、酵母の表現型(Crabtree陽性または陰性)に従って設定されます。これは、Crabtree陽性酵母の場合、高グルコース濃度がミトコンドリア呼吸を阻害し、データの解釈にバイアスを及ぼす可能性があるため、非常に重要です。例...

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

この研究は、LAMPに授与されたメキシコ国立技術(Grant 20026.24-PD)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2-テノイルトリフルオロアセトン(TTFA)メルクT27006阻害剤複合体II
3-クロロフェニルヒドラゾンカルボニルシアン化物(CCCP)メルクC2759ミトコンドリア呼吸アンカプラー  
アブソリュートエタノールメルク107017ケルセチン溶解用 
寒天メルクA1296YPD 寒天製剤
硫酸アンモニウム粒状 (NH4)2SO4J.T. Baker0792-05SC ブロス製剤
アンチマイシン A (AA)メルクA8674阻害剤複合体
III aYSI5300A--------モニター 
遠心分離機HermleZ 206 A細胞用遠心分離
クラーク型酸素--------電極 
コンピュータ--------データ収集用 
リン酸二カリウム K2HPO4J.T. Baker3252-05SC ブロス製剤
グルコースメルクG7021YPD ブロス製剤
グリセロールメルクG5516基質培地の補充 
乳酸メルクL1250基質培地サプリメント 
Streptomyces diastatochromogenesMerckO4876ミトコンドリアATP合成酵素の阻害
オービタルシェイカーサーモフィッシャーSHKE6000Inoculum インキュベーションガラス管およびフラスコ 
カゼインからのペプトン、酵素消化ク82303YPDブロス調製
ケルセチン メルク337951ミトコンドリア呼吸を減少させるため
ウラシル メルクU0750SCブロス調製
酵母エキスメルクY1625YPDブロス調製
アミノ酸および硫酸アンモニウムを含まない酵母窒素塩基メルクY1251SCブロス調製
酵母合成ドロップアウト培地サプリメント ウラシルなしメルクY1501SCブロス調製
物メル

参考文献

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