マウス肝臓の研究のための精密カット肝臓スライス(PCLS)の生産と培養のためのプロトコル。この記事では、ビブラトームにアクセスできる標準的な実験装置のみを必要とし、PCLSを最低4日間生存させることができるという、プロトコルの主要な側面に焦点を当てています。
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この記事について
サマリー
要約
このプロトコルは、精密カット肝臓スライス(PCLS)の作成と培養のための簡単なシステムを提供します。PCLSは、すべての細胞を無傷の環境に含まれているため、臓器全体のミニモデルに似ています。彼らは、複雑な表現型を再現しながら、生きた組織の研究を可能にします。このプロトコルでは、ビブラトームと標準的な実験装置を使用してマウス肝臓からスライスを調製することができます。PCLSの作製と培養のためのプロトコルは標準化されておらず、目的の組織、使用するビブラトームの種類、酸素の必要性によって大きく異なります。これらは、基本的なビブラトームと一般的な組織培養施設しか利用できない一部の研究室では再現が難しい場合があります。私たちは、すでに利用可能なさまざまなプロトコル内のいくつかの重要なステップの重要性に焦点を当てたプロトコルをまとめました。したがって、このプロトコルは、埋め込み方法、切断方向、動的システムと静的システム、および最小量の培養の関連性の重要性を強調しています。このプロトコールは、基本的な組織スライサーを利用できるほとんどの研究室で簡単な方法で確立および再現できます。このプロトコルに従えば、PCLSは最低4日間生存することができます。PCLSは、肝臓などの臓器の病態生理学的および治療的スクリーニングを研究するための、シンプルで経済的、かつ再現性の高いモデルです。
概要
精密切開組織切片(PCTS)は、臓器の薄い切片です。それらは、隣接する細胞と細胞外マトリックスの3次元側面を維持しながら、ミニ臓器を複製する器官の構造の保存を可能にします。これは、組織のアーキテクチャを維持しながら、アクセスが容易で、コストを節約し、労働集約的でない特性により、魅力的なモデルです。
PCTSは、in vitro細胞研究とin vivo動物研究の間のギャップを埋め、両モデルのほとんどの欠点を克服します。PCTSは、肝臓1、腸2、3、結腸2、脳4,5、肺6,7,8、腎臓9,10、脾臓11,12
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プロトコル
野生型CD57Bl/6JマウスはCharles River Laboratoriesから購入しました。マウスは、温度と湿度の条件が制御され、12時間の光サイクルで個別に換気されたケージに収容され、餌と水に自由にアクセスできました。生後3週間の動物を屠殺し、肝臓を灌流せずに速やかに収穫しました。すべての動物作業は、ユニバーシティ・カレッジ・ロンドンの動物福祉・倫理審査委員会による現地の倫理審査を経て承認され、内務省のプロジェクトライセンスPP9223137に基づき、内務省(動物)科学手続法(1986年)およびARRIVEガイドラインに従って実施されました。ユニバーシティ・カレッジ・ロンドンのバイオロジカル・サービス・ユニットの標準的な慣行に従って、動物への危害を制限するためにあらゆる努力が払われました。
1. 実験の準備をする
- 収穫の前日に、次の手順を実行してください。
- クレブス粉末のバイアル1本を1Lの滅菌水に溶解して、クレブス・ヘンセライト緩衝液(KREBS)1Lを調製します。4°Cまで冷まし、濡れた氷の上に置いてください。
- トレイを70%エタノールで消毒し、滅菌PBSですすいでください。トレイを錫ホイルで包んで冷蔵庫に一晩置いておけば、切断中に寒い環境を保つことができます。
- 他のすべて....
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結果
収穫時には、臓器の迅速な処理を確保し、臓器の損傷を防ぐために、動物の灌流は意図的に省略されます。肝臓は切開後すぐに抽出され、すぐに氷のように冷たい臓器保護緩衝液、例えば、クレブス緩衝液24,29に入れられます。埋め込まずに新鮮な肝臓組織をスライスすることは以前に説明されていますが1、低融点のアガロース30(図1)に肝臓を埋め込み、臓器保護バッファーと組み合わせることで、ビブラトーム上での最適な切断条件が可能になり、組織の損傷が軽減され、切片の厚さの再現性が向上します。薄い切片は、より多くの細胞層が栄養素と酸素31にアクセスし、細胞死を減らすことを可能にするため、組織の厚さは重要です。しかし、薄すぎる切片は均一に切断するのが難しくなります。逆に、400μmより厚いスライスは、栄養素の浸透率が低くなります。切片をインサート(.......
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ディスカッション
PCLSの作製と培養は、少なくとも4日間の半減期を確保しながら簡単に達成できることを実証しています。このプロトコルは、このタイプのビブラートを使用する場合の埋め込み方法、切断の向き、動的な培養システム、最小限の培養量、およびインサートの使用という5つの重要なステップを要約しています。
PCLSの生産と培養のためのプロトコルは一般的に利用可能です。ただし、標準化が欠けています。それらは、プロトコルの類似した特定のポイントに焦点を当てているかもしれませんが、簡単な方法で再現したり、基本的なビブラトームにアクセスできるほとんどのラボで再現するのは難しい場合があります。ビブラトームやティッシュスライサーの種類は多岐にわたります。それらは、統合された冷却システムを持っているかどうかなど、コストと技術的な特異性が異なりますが、共通の特徴は、振動するカミソリの刃を使用した切断システムです。組織のスライスに関する主な違いは、埋め込みの要件です。明らかな理由と、埋め込みが生存率に与える影響を考えると、理想的には避けるべきです。埋め込.......
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開示事項
開示すべき競合する利益はありません。
謝辞
著者は、ミラベラ・バンドール、サマンサ・リチャーズ、ルイーズ・フィッシャー、レベッカ・タウンズ、およびUCLバイオロジカルサービスのスタッフに、動物のコロニーの繁殖と維持を支援してくれたことに感謝します。この研究は、英国医学研究評議会の臨床医科学者フェローシップMR/T008024/1(JB)およびNIHRグレートオーモンドストリート病院生物医学研究センター(JB)からの資金提供によって支援されました。表明された見解は著者のものであり、必ずしもNHSまたはNIHRの見解ではありません。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 3cmシャーレ | 培養に適 | したもの | |
| 6、12、24ウェル培養プレート | 培養に適したもの | ||
| シアノアクリレート瞬間接着剤 | |||
| -グルコース | Gibco | A24940 | |
| エオシン | メルク | HT110316 | |
| エタノール | |||
| ウシ胎児血清 | ThermoFisher | 26400044 | |
| ゲンタマイシン | Gibco | 15750060 | |
| ヘマトキシリン | Merck | 51275 | |
| HEPES | Gibco | H0887 | |
| インサート 8um、12 ウェルプレート用 | Strastedt | 83.3931.800 | |
| インサート 8um、24 ウェルプレート用 | Strastedt | 83.3932.800 | |
| インサート 8um、6 ウェルプレート用 | Strastedt | 83.3930.800 | |
| KREBS | Merck | K3753 | |
| 層流フード | Hepa 空気ろ過 | ||
| 低融点アガロース | ThermoFisher | 16520050 | |
| MTS テトラゾリウム試薬 | Abcam | ab197010 | |
| マルチウェルプレートリーダー | 任意の | ||
| PBS錠 | ThermoFisher | P4417 | |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | Gibco | 15140-122 | |
| メスの刃 | |||
| 任意の外科用鉗子 | らな四角い先端を備えた | もの。 | |
| 手術用ハサミ | Any | ||
| Vibratome | Leica | VT1000 S | |
| William's ミディアム E (GlutaMAX (WME)を含む | モフィッシャー | W4125 |
参考文献
- Pearen, M. A., et al. Murine precision-cut liver slices as an ex vivo model of liver biology. J Vis Exp. (157), e60992(2020).
- De Kanter, R., et al. Prediction of whole-body metabolic clearance of dru....
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再版と許可
