ショウジョウバエの眼系は、さまざまな生物学的プロセス、特にヒトの神経変性疾患を研究するための有用なツールです。しかし、粗眼の表現型の手動定量化は偏りがあり、信頼性に欠ける可能性があります。ここでは、ilastikとFlynotyperを使用して、偏りのない方法で眼の表現型を定量化する方法について説明します。
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方法論記事
ショウジョウバエの眼の表現型の定量化:ilastikとFlynotyperを統合した計算アプローチ
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
ショウジョウバエメラノガスター複眼は、対称的で六角形のパターンを示す、約800のオマチディアのよく構造化された包括的な配列です。この規則性と観察の容易さにより、ショウジョウバエの眼系は、さまざまなヒトの神経変性疾患をモデル化するための強力なツールとなっています。ただし、眼の重症度スコアの手動ランク付けなど、異常な表現型を定量化する方法には、特に眼の形態の弱い変化をランク付けする場合に制限があります。これらの制限を克服するために、Flynotyperなどの計算アプローチが開発されました。リングライトを使用すると、個々のオマチディアの無傷の画像にアクセスする、より高品質の画像が可能になります。ただし、これらの画像は、リングライトによって導入されたommatidiaの影のため、Flynotyperで直接分析することはできません。ここでは、ilastikとFlynotyperの2つのソフトウェアを組み合わせて、ショウジョウバエの疾患モデルで観察される粗眼の表現型を定量化する偏りのない方法について説明します。ilastikで画像を前処理することにより、Flynotyperで粗い目の表現型の定量化を成功させることができます。
概要
Drosophila melanogasterのゲノムには、ヒトの疾患関連遺伝子オルソログが~75%含まれています。さらに、ショウジョウバエの眼の発生中に、ゲノムの遺伝子の約3分の2が発現するため、ショウジョウバエの眼は、さまざまな分子および細胞機能、発生、および疾患モデルを調査するための優れた遺伝システムとなっています1,2。したがって、ショウジョウバエの眼系は、さまざまな生物学的プロセスを研究するための有用な実験ツールです。
ショウジョウバエの複眼は、対称的で六角形のパターン3を示す~800 ommatidiaのよく構造化された包括的な配列です。この六角形のパターンの規則性は、眼の形態における突然変異の導入および遺伝子発現変化の影響を推定するために用いることができる4。眼の形態の評価を必要とする以前の研究では、肉眼で検出される眼の表現型の重症度の手動によるランク付けに大きく依存していました。眼の表現型をランク付けするために、外部の眼の形態像を実体顕微鏡5,6で撮影する。各グループの眼の表現型は、外部眼を4つの領域に分割し、各領域の変性の割合を計算することによって評価されます5,6。次いで、これらの値を用いて、対照ハエ7から得られた値と比較される平均を計算する。スコアリングは、融合の程度、オマチディアの喪失、および剛毛組織7,8に基づいています。実体顕微鏡で撮影したフライアイ写真は、1人の研究者によって取得され、眼の表現型分析は、トリプル検証セット7,8を使用して別の研究者によって実行されます。
肉眼で目の形態の弱い変化をランク付けすることになると、制限があります4。これらの制限を克服するために、FLEYEやFlynotyperなどの計算アプローチが開発されました1,9。Flynotyperは、ショウジョウバエの眼系の形態学的変化を定量的に推定するための新しい計算手法です1。ショウジョウバエの眼と個々の眼球を自動的に検出し、眼の凹凸1に基づいて表現型スコア(P-Scores)を算出します。Pスコアが高いほど、フライアイがより退化していることを示します。このソフトウェアは、ショウジョウバエの目の異常10の定量化に成功しました。Flynotyperは自動化されたプロセスを保証しますが、さまざまな光学顕微鏡法で撮影された一部の眼の画像にはまだうまく適用できません。
定性的には、各オマチジウムをより正確に表現できるシングルポイント光源よりもリング光源を好みます。しかし、リングライトを使用すると、オマチジウムの半球形のため、各オマチジウムの上部にリング状の影が生成されます。このリング状の影は、Flynotyperによる正確な眼球検出を阻害し、Pスコアの誤った計算につながります。
これらの問題を克服するために、機械学習に基づくさまざまな分析ツールであるilastikを実装して、ハエの目の画像11のommatidiaを分類しました。次に、ilastikで生成された画像をFlynotyperに入力して、Pスコアを計算しました。これにより、 ショウジョウバエ の目の形態学的欠陥を偏りなく定量化することができます1。
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プロトコル
1. 定量化の準備
- ilastik11、ImageJ、およびImageJプラグインFlynotyper1をダウンロードしてインストールします。インストールへのWebサイトリンクについては 、資料の表 を参照してください。コンピューターのオペレーティングシステム(Mac、Windows、Linuxなど)に応じて適切なパッケージをダウンロードします。記載されているとおりに、インストール手順に従ってください。
注:提供されたリンクに記載されている指示に正確に従うことが不可欠です。使用するコンピューターには 64 ビットのオペレーティング システムが必要です。それ以外の場合、他の必要な仕様はありません。このプロトコルに使用されるシステムのコンピュータ仕様については、 資料表 を参照してください。 - 標準画像を使用して機械学習モデルをトレーニングします。リングライト付きの光学顕微鏡(w1118 x GMR-GAL4など)を使用して、目の中心を焦点として健康なハエの眼を撮影します。男性と女性を別々に分析します。したがって、男性用と女性用の標準的な画像を取得します。
注意: 設定は顕微鏡とカメラによって大きく異なります。フライの準備と画像取得に関する一般的な情報については、ディスカッションの 2 番目の段落を参照してください。 - 実験用のハエの目の画像は、標準的な画像取得に使用したのと同じ設定で撮影します。
注:正確な定量には、適切な配向が最も重要です。例として、適切な向きの図 4 を参照してください。
2. ilastikを使用してハエの目の画像からommatidiaを検出する
- 解析を開始する前に、実験条件に関係なく、すべての実験グループが同じファイルフォルダにあることを確認して、次のプロセスを容易にします。実験グループを識別し、男性と女性を区別するために、ファイルに適切な名前が付けられていることを確認してください。
注:プロトコルを印刷し、コンピューターを使用して図を拡大することをお勧めします。このプロトコルは視覚的に最も簡単に追跡できるためです。 - ソフトウェアを起動します。
注:ソフトウェアの実行中は、他のアプリケーションを開かないでください。そうしないと、特に古いシステムや堅牢性の低いシステムでは、コンピューターの動作が非常に遅くなる可能性があります。 - [ Create New Project (新しいプロジェクトを作成)] |その他のワークフローで、[ Cell Density Counting]を選択し、プロジェクトファイルを保存する場所を選択します(図1A)。
- 1をクリックします 。入力データ |新規追加 |個別の画像を追加します。標準画像を選択します(図1B)。
- 2をクリックします 。機能の選択 と使用する機能の選択。 図 1C に示す機能を選択します。感度を上げるには、より多くのシグマ値を選択します(つまり、10、15、20など)。
注: チェックするボックスが多すぎると、プログラムが長時間実行される可能性があります。 - 3をクリックします 。カウント して 、フォアグラウンド シグマ値を 5.00 に設定します。標準画像で Foreground ツールを使用して、50個以上の個々のommatidiumをマークします。
注:通常、50個のマーキングが分析に適切です。ただし、マークされたommatidiaが多いほど、結果はより正確になります(図1D)。 - 3をクリックします 。カウント し、 背景 ツールを使用してオマチディアの外側をマークします(図1E)。オマティディアの周りに格子状に緑色の線を引きます。
注:オマティディアのマーキングが多いほど、緑の線が描かれるほど、結果はより正確になります。 - 4をクリックします 。密度のエクスポート |[Export Image Settings] を選択して 、画像設定を設定します (図 1F)。 [出力ファイル情報] | Flynotyperでさらに分析するために 、Format と tif を選択します。
- 5をクリックします 。バッチ処理 |[Raw Data Files]を選択し 、解析するすべての実験的なハエの写真を選択します(図1G)。分析するインポートされた画像のリストは 、[生データファイルの選択 ]の下に表示されます(図1H)。5の下部にある[ すべてのファイルを処理 ]をクリックします 。バッチ処理 セクション。
注:男性と女性の分析は別々に行う必要があります。使用するコンピューターによっては、特にインポートされた画像が多数ある場合は、この手順に10分以上かかる場合があります。 - ソフトウェアが終了したら、実験用のフライアイ画像を含む同じファイルフォルダを確認します。「YourSampleName_Probabilities」という名前の黒い画像が表示されます(図1I)。
3. ImageJを使用してFlynotyperの写真を準備する
- ilastik で生成された .tif ファイル (ブラック ボックス) を ImageJ で開きます。
注:生成された各ilastik.tifファイルは個別に処理する必要があります。 - 長方形選択ツールを使用して、目だけの周りに長方形を作成します。四角形が描画されたら、Ctrl + X または Ctrl + C を選択して領域を切り抜きます (図 2A)。長方形の輪郭の形をした黒いボックスが表示されるのを待ちます。
注: コンピュータのオペレーティングシステムは、「Ctrl + X」または「Ctrl + C」のどちらを使用するかを決定します。通常、Windows用は「Ctrl+X」、Mac用は「Ctrl+C」が使われます。 - ImageJを使用して、カットしたフライアイを開きます。 「ファイル」をクリックします。 |新着 |内部クリップボード (図 2B)。
- カットされたフライアイをJPEGとして保存するには、[ ファイル]|名前を付けて保存 |jpeg です。カットされた画像は、元の実験画像と同じファイルフォルダにあります。
注:次のステップを簡単にするために、「cut」という新しいファイルフォルダを作成し、切り取った画像をすべてそのフォルダに入れることをお勧めします。
4. Flynotyperを使用して表現型スコアを計算する
- FlynotyperをImageJプラグインとして開くには、 Plugins |フライノタイパー。
- 「遺伝子型の追加」を選択し、カットされたフライアイ画像を含むフォルダー(カットファイルフォルダー)を開きます。フォルダ名は[Genotypes](遺伝子型)の下に表示されます(図2C)。
- [Light microscope] ボックスと [Vertically] ボックスをオンにしますが、必要に応じて調整します。[Rank Ommatidia by](図2C)の[Stability (安定性)] ボックスと [Distance to the Center (中心までの距離)] チェックボックスをオンにします。
- [Number of ranked ommatidia considered] に「200」と入力します。
注:一般的には200が適切な数ですが、好みに応じて調整してください。 - 「実行」をクリックし、解析結果が表示されるのを待ちます(図2D)。
メモ: この手順は、使用するコンピューターの処理能力によっては 5 分以上 (またはそれ以下) かかる場合があります。 - サンプルファイルとPスコアをコピーして統計ソフトウェアに貼り付け、さらに分析します。
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結果
以前の研究では、このプロトコルを使用して、筋萎縮性側索硬化症に関連する変異 VCP タンパク質の遺伝的修飾因子を決定しました 前頭側頭型認知症 (ALS-FTD)12。さらに、この方法は、古い実体顕微鏡13を使用している場合でも、S59Lを介したALS-FTD CHCHD10毒性を評価するために別の論文でも使用されました。これらの結果をさらに検証するために、Baek et al.13 と同じ ALS-FTD 疾患変異で ilastik と Flynotyper を使用しました。しかし、訓練を受けていない研究室の職員が実験を行い、同様の結果を得ました。したがって、ilastikとFlynotyperを組み合わせることは、Drosophila ommatidiaの変性を公平にスコアリングするための堅牢な方法です。
リングライトの使用を好むのは、より定性的な評価を可能にするためです(
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ディスカッション
ショウジョウバエの腫瘍は、さまざまな生物学的機能や遺伝性疾患を研究するための有用なシステムです。ommatidiaの規則性は、遺伝子突然変異の影響を調べるのに適した測定値です4。手動ランキングなど、オマティディアル規則性を計算する方法がいくつかありますが、これらの方法には大きなバイアスがかかる可能性があります。この偏ったアプローチを克服するために、半自動ツールが開発されました1,11。
正確な眼の定量のためには、フライの準備とセットアップを最適化する必要があります。各ラボにはそれぞれのセットアップがあることを理解していますが、画像取得のためのハエの準備方法について読者にアイデアを提供するために、ラボでは次のセットアップを提供しています。ハエは冷凍保存され、-80°Cで保存されます。 私たちの経験では、GMR-GAL4をS81L変異と組...
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開示事項
著者には、開示すべき利益相反はありません。
謝辞
このプロトコルで使用された顕微鏡とカメラを使用してくださったPedro Fernandez-Funezに感謝します。また、プロトコルの明確さについてフィードバックを提供してくださったAva Schapman氏にも感謝します。財政的支援は、ウォリン神経科学発見基金からキム・ナム・チョルに提供されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| コンピューターの仕様 | Ryzen 5、16 GB RAM、Nvidia RTX 3070 Super、Windows 10 | ||
| Flynotyper | Iyer、J. et al. (2016) | ソフトウェアのダウンロードはこちら: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html | オープンソースソフトウェア。Flynotyper 2.0は使用しないでください。公開時点では、2.0はかなり新しく、このプロトコルはFlynotyperのオリジナルバージョンに最適化されています。 |
| ilastik | Berg, S. et al. (2019) | ここからソフトウェアをダウンロード: https://www.ilastik.org/download.html | オープンソースソフトウェア.お使いのコンピュータのオペレーティングシステムに対応するレギュラービルドでバージョン1.4.0.post1をダウンロードします。 |
| ImageJ | ここからソフトウェアをダウンロードしてください: https://imagej.net/ij/download.html | オープンソースソフトウェア。バージョン 1.53 と 1.54 が使用されました。1.54 は更新バージョンであり、デフォルトのダウンロードです。 | |
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica Microsystems | LASX Office 1.4.6 28433 | z-stack の取得に使用されるシステムおよびソフトウェア。 |
| ライカ Z16 APO 顕微鏡 DMC2900カメラ付き | ライカ マイクロシステム | 10 447 173, 12 730 466 | 本文中では Z-stack 顕微鏡およびカメラと表記しています。この商品は現在アーカイブされています。 |
参考文献
- Iyer, J., et al. Quantitative assessment of eye phenotypes for functional genetic studies using Drosophila melanogaster. G3. 6 (5), 1427-1437 (2016).
- Thomas, B. J., Wassarman, D. A. A fly's eye view of biology. Trends Genet. 15 (5), 184-190 (1999).
- Roignant, J. -Y., Treisman, J. E. Pattern formation in the Drosophila eye disc. Int J Dev Biol. 53 (5-6), 795-804 (2009).
- Diez-Hermano, S., Ganfornina, M. D., Vegas, E., Sanchez, D. Machine learning representation of loss of eye regularity in a Drosophila neurodegenerative model. Front Neurosci. 14 (1), 1-14 (2020).
- Appocher, C., Klima, R., Feiguin, F. Functional screening in Drosophila reveals the conserved role of REEP1 in promoting stress resistance and preventing the formation of Tau aggregates. Hum Mol Genet. 23 (25), 6762-6772 (2014).
- Pandey, U. B., et al. HDAC6 rescues neurodegeneration and provides an essential link between autophagy and the UPS. Nature. 447 (7146), 860-864 (2007).
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- Baek, M., et al. TDP-43 and PINK1 mediate CHCHD10S59L mutation-induced defects in Drosophila and in vitro. Nat Commun. 12 (1), 1-20 (2021).
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