ショウジョウバエの眼の表現型の定量化:ilastikとFlynotyperを統合した計算アプローチ

サマリー

ショウジョウバエの眼系は、さまざまな生物学的プロセス、特にヒトの神経変性疾患を研究するための有用なツールです。しかし、粗眼の表現型の手動定量化は偏りがあり、信頼性に欠ける可能性があります。ここでは、ilastikとFlynotyperを使用して、偏りのない方法で眼の表現型を定量化する方法について説明します。

要約

ショウジョウバエメラノガスター複眼は、対称的で六角形のパターンを示す、約800のオマチディアのよく構造化された包括的な配列です。この規則性と観察の容易さにより、ショウジョウバエの眼系は、さまざまなヒトの神経変性疾患をモデル化するための強力なツールとなっています。ただし、眼の重症度スコアの手動ランク付けなど、異常な表現型を定量化する方法には、特に眼の形態の弱い変化をランク付けする場合に制限があります。これらの制限を克服するために、Flynotyperなどの計算アプローチが開発されました。リングライトを使用すると、個々のオマチディアの無傷の画像にアクセスする、より高品質の画像が可能になります。ただし、これらの画像は、リングライトによって導入されたommatidiaの影のため、Flynotyperで直接分析することはできません。ここでは、ilastikとFlynotyperの2つのソフトウェアを組み合わせて、ショウジョウバエの疾患モデルで観察される粗眼の表現型を定量化する偏りのない方法について説明します。ilastikで画像を前処理することにより、Flynotyperで粗い目の表現型の定量化を成功させることができます。

概要

Drosophila melanogasterのゲノムには、ヒトの疾患関連遺伝子オルソログが~75%含まれています。さらに、ショウジョウバエの眼の発生中に、ゲノムの遺伝子の約3分の2が発現するため、ショウジョウバエの眼は、さまざまな分子および細胞機能、発生、および疾患モデルを調査するための優れた遺伝システムとなっています^1,2。したがって、ショウジョウバエの眼系は、さまざまな生物学的プロセスを研究するための有用な実験ツールです。

ショウジョウバエの複眼は、対称的で六角形のパターン³を示す~800 ommatidiaのよく構造化された包括的な配列です。この六角形のパターンの規則性は、^眼の形態における突然変異の導入および遺伝子発現変化の影響を推定するために用いることができる4。眼の形態の評価を必要とする以前の研究では、肉眼で検出される眼の表現型の重症度の手動によるランク付けに大きく依存していました。眼の表現型をランク付けするために、外部の眼の形態像を実体顕微鏡^5,6で撮影する。各グループの眼の表現型は、外部眼を4つの領域に分割し、各領域の変性の割合を計算することによって評価されます^5,6。次いで、これらの値を用いて、対照ハエ⁷から得られた値と比較される平均を計算する。スコアリングは、融合の程度、オマチディアの喪失、および剛毛組織^7,8に基づいています。実体顕微鏡で撮影したフライアイ写真は、1人の研究者によって取得され、眼の表現型分析は、トリプル検証セット^7,8を使用して別の研究者によって実行されます。

肉眼で目の形態の弱い変化をランク付けすることになると、制限があります⁴。これらの制限を克服するために、FLEYEやFlynotyperなどの計算アプローチが開発されました^1,9。Flynotyperは、ショウジョウバエの眼系の形態学的変化を定量的に推定するための新しい計算手法^です1。ショウジョウバエの眼と個々の眼球を自動的に検出し、眼の凹凸1に基づいて表現型スコア(P-Scores)を算出^します。Pスコアが高いほど、フライアイがより退化していることを示します。このソフトウェアは、ショウジョウバエの目の異常¹⁰の定量化に成功しました。Flynotyperは自動化されたプロセスを保証しますが、さまざまな光学顕微鏡法で撮影された一部の眼の画像にはまだうまく適用できません。

定性的には、各オマチジウムをより正確に表現できるシングルポイント光源よりもリング光源を好みます。しかし、リングライトを使用すると、オマチジウムの半球形のため、各オマチジウムの上部にリング状の影が生成されます。このリング状の影は、Flynotyperによる正確な眼球検出を阻害し、Pスコアの誤った計算につながります。

これらの問題を克服するために、機械学習に基づくさまざまな分析ツールであるilastikを実装して、ハエの目の画像¹¹のommatidiaを分類しました。次に、ilastikで生成された画像をFlynotyperに入力して、Pスコアを計算しました。これにより、 ショウジョウバエ の目の形態学的欠陥を偏りなく定量化することができます¹。

プロトコル

1. 定量化の準備

1. ilastik¹¹、ImageJ、およびImageJプラグインFlynotyper¹をダウンロードしてインストールします。インストールへのWebサイトリンクについては 、資料の表 を参照してください。コンピューターのオペレーティングシステム(Mac、Windows、Linuxなど)に応じて適切なパッケージをダウンロードします。記載されているとおりに、インストール手順に従ってください。
   注:提供されたリンクに記載されている指示に正確に従うことが不可欠です。使用するコンピューターには 64 ビットのオペレーティング システムが必要です。それ以外の場合、他の必要な仕様はありません。このプロトコルに使用されるシステムのコンピュータ仕様については、 資料表 を参照してください。
2. 標準画像を使用して機械学習モデルをトレーニングします。リングライト付きの光学顕微鏡(w1118 x GMR-GAL4など)を使用して、目の中心を焦点として健康なハエの眼を撮影します。男性と女性を別々に分析します。したがって、男性用と女性用の標準的な画像を取得します。
   注意: 設定は顕微鏡とカメラによって大きく異なります。フライの準備と画像取得に関する一般的な情報については、ディスカッションの 2 番目の段落を参照してください。
3. 実験用のハエの目の画像は、標準的な画像取得に使用したのと同じ設定で撮影します。
   注:正確な定量には、適切な配向が最も重要です。例として、適切な向きの図 4 を参照してください。

2. ilastikを使用してハエの目の画像からommatidiaを検出する

1. 解析を開始する前に、実験条件に関係なく、すべての実験グループが同じファイルフォルダにあることを確認して、次のプロセスを容易にします。実験グループを識別し、男性と女性を区別するために、ファイルに適切な名前が付けられていることを確認してください。
   注:プロトコルを印刷し、コンピューターを使用して図を拡大することをお勧めします。このプロトコルは視覚的に最も簡単に追跡できるためです。
2. ソフトウェアを起動します。
   注:ソフトウェアの実行中は、他のアプリケーションを開かないでください。そうしないと、特に古いシステムや堅牢性の低いシステムでは、コンピューターの動作が非常に遅くなる可能性があります。
3. [ Create New Project (新しいプロジェクトを作成)] |その他のワークフローで、[ Cell Density Counting]を選択し、プロジェクトファイルを保存する場所を選択します(図1A)。
4. 1をクリックします 。入力データ |新規追加 |個別の画像を追加します。標準画像を選択します(図1B)。
5. 2をクリックします 。機能の選択 と使用する機能の選択。 図 1C に示す機能を選択します。感度を上げるには、より多くのシグマ値を選択します(つまり、10、15、20など)。
   注: チェックするボックスが多すぎると、プログラムが長時間実行される可能性があります。
6. 3をクリックします 。カウント して 、フォアグラウンド シグマ値を 5.00 に設定します。標準画像で Foreground ツールを使用して、50個以上の個々のommatidiumをマークします。
   注:通常、50個のマーキングが分析に適切です。ただし、マークされたommatidiaが多いほど、結果はより正確になります(図1D)。
7. 3をクリックします 。カウント し、 背景 ツールを使用してオマチディアの外側をマークします(図1E)。オマティディアの周りに格子状に緑色の線を引きます。
   注:オマティディアのマーキングが多いほど、緑の線が描かれるほど、結果はより正確になります。
8. 4をクリックします 。密度のエクスポート |[Export Image Settings] を選択して 、画像設定を設定します (図 1F)。 [出力ファイル情報] | Flynotyperでさらに分析するために 、Format と tif を選択します。
9. 5をクリックします 。バッチ処理 |[Raw Data Files]を選択し 、解析するすべての実験的なハエの写真を選択します(図1G)。分析するインポートされた画像のリストは 、[生データファイルの選択 ]の下に表示されます(図1H)。5の下部にある[ すべてのファイルを処理 ]をクリックします 。バッチ処理 セクション。
   注:男性と女性の分析は別々に行う必要があります。使用するコンピューターによっては、特にインポートされた画像が多数ある場合は、この手順に10分以上かかる場合があります。
10. ソフトウェアが終了したら、実験用のフライアイ画像を含む同じファイルフォルダを確認します。「YourSampleName_Probabilities」という名前の黒い画像が表示されます(図1I)。

3. ImageJを使用してFlynotyperの写真を準備する

1. ilastik で生成された .tif ファイル (ブラック ボックス) を ImageJ で開きます。
   注:生成された各ilastik.tifファイルは個別に処理する必要があります。
2. 長方形選択ツールを使用して、目だけの周りに長方形を作成します。四角形が描画されたら、Ctrl + X または Ctrl + C を選択して領域を切り抜きます (図 2A)。長方形の輪郭の形をした黒いボックスが表示されるのを待ちます。
   注: コンピュータのオペレーティングシステムは、「Ctrl + X」または「Ctrl + C」のどちらを使用するかを決定します。通常、Windows用は「Ctrl+X」、Mac用は「Ctrl+C」が使われます。
3. ImageJを使用して、カットしたフライアイを開きます。 「ファイル」をクリックします。 |新着 |内部クリップボード (図 2B)。
4. カットされたフライアイをJPEGとして保存するには、[ ファイル]|名前を付けて保存 |jpeg です。カットされた画像は、元の実験画像と同じファイルフォルダにあります。
   注:次のステップを簡単にするために、「cut」という新しいファイルフォルダを作成し、切り取った画像をすべてそのフォルダに入れることをお勧めします。

4. Flynotyperを使用して表現型スコアを計算する

1. FlynotyperをImageJプラグインとして開くには、 Plugins |フライノタイパー。
2. 「遺伝子型の追加」を選択し、カットされたフライアイ画像を含むフォルダー(カットファイルフォルダー)を開きます。フォルダ名は[Genotypes](遺伝子型)の下に表示されます(図2C)。
3. [Light microscope] ボックスと [Vertically] ボックスをオンにしますが、必要に応じて調整します。[Rank Ommatidia by](図2C)の[Stability (安定性)] ボックスと [Distance to the Center (中心までの距離)] チェックボックスをオンにします。
4. [Number of ranked ommatidia considered] に「200」と入力します。
   注:一般的には200が適切な数ですが、好みに応じて調整してください。
5. 「実行」をクリックし、解析結果が表示されるのを待ちます(図2D)。
   メモ: この手順は、使用するコンピューターの処理能力によっては 5 分以上 (またはそれ以下) かかる場合があります。
6. サンプルファイルとPスコアをコピーして統計ソフトウェアに貼り付け、さらに分析します。

結果

以前の研究では、このプロトコルを使用して、筋萎縮性側索硬化症に関連する変異 VCP タンパク質の遺伝的修飾因子を決定しました 前頭側頭型認知症 (ALS-FTD)¹²。さらに、この方法は、古い実体顕微鏡¹³を使用している場合でも、^S59Lを介したALS-FTD CHCHD10毒性を評価するために別の論文でも使用されました。これらの結果をさらに検証するために、Baek et ^al.13 と同じ ALS-FTD 疾患変異で ilastik と Flynotyper を使用しました。しかし、訓練を受けていない研究室の職員が実験を行い、同様の結果を得ました。したがって、ilastikとFlynotyperを組み合わせることは、Drosophila ommatidiaの変性を公平にスコアリングするための堅牢な方法です。

リングライトの使用を好むのは、より定性的な評価を可能にするためです(図3)。ただし、リングライトを使用すると、Flynotyperが直接分析できない影が発生します。これを克服するために、FlynotyperでPスコアを定量化する前に、ilastikで画像を前処理しました。全体として、非変性(GMR-GAL4)フライアイのPスコアは、中等度の変性アイ(2x_S81L)および重度変性アイ(3x_S81L)と比較して有意に低かった(図4A、B、表1)。Flynotyperから生成されたPスコアが高いほど、目の退化が進んでいることを示すため、これは予想される結果です¹。ilastikを使用しなかった場合、変性していない眼と中程度に変性した眼との間には、Pスコアにわずかな差がありました(図4Cおよび表1)。これは、Flynotyperがilastikを使用せずにリング光条件下でommatidiaパターンを正確に識別するのに苦労していることを示唆しています。これは、Flynotyperが、2点ライトで撮影された画像を使用し、グレースケールに変換され、追加の調整が加えられてオマティディアル^{センター1}を識別するように設計されているためです。Ilastikは、各ommatidiumの中心にドットを組み込むことでこのプロセスを再現し、Flynotyper内での定量化を可能にします。

図 1: ilastik ワークフローの例。(A) ilastik で新しいプロジェクトを作成する。 (B) 標準画像を選択します。 (C) Feature Selectionでシグマ値を選択する。 (D) 感度のためにommatidiaの前景をマークします。 (E) 感度のためにommatidiaの背景をマークします。 (F) ソフトウェアが処理されたファイルをエクスポートする方法を選択する。 (G) 分析する実験的なフライアイ画像を選択する。 (H) どの実験的なフライアイ画像が分析されるかを示します。 (I) ソフトウェアを実行した後の完成品。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:Flynotyperワークフローの例。(A) さらなる分析のためにハエの目のみを選択します。 (B) カットアイの画像を新しいウィンドウで開きます。 (C) 解析するカット画像と解析のためにチェックするパラメータを選択します。 (D) 結果の例。表現型スコアは右端に表示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:定性的な ショウジョウバエ の目の画像。 リングライトで撮影した同じフライアイ(左)とデュアルポイントライト(右)で、非縮退状態(上)と縮退状態(下)で撮影したもの。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:Flynotyperの前にilastikを使用して、 ショウジョウバエの粗眼の表現型を正確に定量化します。(A) 非変性眼(GMR-GAL4)、中等度変性眼(2x_S81L)、および重度変性眼(3x_S81L)の代表的な ショウジョウバエ 眼画像。 (B) ilastikを使用した後のFlynotyperからの定量結果。結果の解釈を容易にするために、両側順列 t検定のp値を計算しました（GMR-GAL4対2x_S81L）p=0,GMR-GAL4対3x_S81L）p=0)( C) ilastikを使用せずにFlynotyperから結果を定量化しました。結果の解釈を容易にするために、両側順列 t検定のp値を計算しました(GMR-GAL4対2x_S81L:p = 0.597、GMR-GAL4対3x_S81L:p = 0.687)。各グループに対して N = 3。データポイントは、視覚的に明確にするために、X軸上にジッターまたは積み重ねられます。水平実線は平均を表します。エラーバーは標準偏差を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

GMR-GAL4型		2x_S81L		3x_S81L
ilastikと	ilastikなし	ilastikと	ilastikなし	ilastikと	ilastikなし
26.7	55.7	52.5	51.2	59.9	55.6
17.4	53.5	50	54.9	60.7	52
22.8	55.5	56.8	55.2	60.1	55.1

表1:Flynotyperをilastikと一緒に使用した場合、およびFlynotyperを単独で使用した場合のPスコア。

補足図S1:画像取得用にセットアップされたフライヘッドマウント。 複数枚の用紙を使用した画像取得の設定例です。ただし、頭とフライアイの適切な向きを確保する方法なら何でも使用できます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S2:特徴選択でシグマ値2.5を使用した場合のilastikとFlynotyperの定量的結果。 ilastik で機能選択で 5.0 以外のシグマ値を使用すると、定量化が不正確になる可能性があります。具体的には、シグマ値が 2.5 の場合、感度が低下します。結果の解釈を容易にするために、両側順列 t検定のp値を計算しました(GMR-GAL4対2x_S81L:p = 0.192、GMR-GAL4対3x_S81L:p = 0)。各グループに対して N = 3。データポイントは、視覚的に明確にするために、X軸上にジッターまたは積み重ねられます。水平実線は平均を表します。エラーバーは標準偏差を表します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S3:壊死性パッチによる感度の低下と不正確なPスコア。 白い矢印は壊死性パッチのセグメントを指しています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表S1:特徴選択でシグマ値2.5を使用した場合のPスコア。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

ショウジョウバエの腫瘍は、さまざまな生物学的機能や遺伝性疾患を研究するための有用なシステムです。ommatidiaの規則性は、遺伝子突然変異の影響を調べるのに適した測定値です⁴。手動ランキングなど、オマティディアル規則性を計算する方法がいくつかありますが、これらの方法には大きなバイアスがかかる可能性があります。この偏ったアプローチを克服するために、半自動ツールが開発されました^1,11。

正確な眼の定量のためには、フライの準備とセットアップを最適化する必要があります。各ラボにはそれぞれのセットアップがあることを理解していますが、画像取得のためのハエの準備方法について読者にアイデアを提供するために、ラボでは次のセットアップを提供しています。ハエは冷凍保存され、-80°Cで保存されます。 私たちの経験では、GMR-GAL4をS81L変異と組み合わせると、集団間の変動がほとんどないため、サンプルサイズを3にしました。ただし、帰無仮説の有意性検定を実行するには、サンプルサイズを調整する必要があることに注意してください。画像取得のためにハエを取り付けるために、ハエの頭は枕として機能する非常に小さな紙の上に置かれ、目の中心がほぼ焦点面になるようにします(補足図S1)。私たちの研究室では、Zスタック顕微鏡とカメラ( 材料の表を参照)を使用しており、全体的に鮮明な画像が得られ、フライアイがドーム型であるため、目全体を最適に視覚化できます。ただし、Zスタック機能は、Zスタック機能¹³のない古い実体顕微鏡でこの方法を成功裏に使用したため、このプロトコルの要件ではありません。明るさのためのリングライトダイヤルは、露出オーバーを避けるために1/4以上上に回されません。当社のサンプルの総厚さは300〜450ミクロンの範囲です。

この研究では、ilastikとFlynotyperを使用したハエの目の分析により、偏りのない信頼性の高いommatidia定量結果が得られることを示しました。私たちは、機械学習ベースのバイオ画像解析ツールであるilastikを使用してオマチディアをマークし、次にオマチディアの規則性を測定するために使用される計算方法であるFlynotyperを使用して、ショウジョウバエのommatidiaパターンを分析しました^1,11。私たちは、より定性的な評価のために画像を取得するためにリングライトを使用することを好みます。しかし、このアプローチでは、Flynotyperがこれらの画像を使用して定量的な結果を生成することはできません。したがって、これらの画像を前処理するためにilastikが実装され、これらの処理された画像はFlynotyperで成功裏に使用され、定量的な結果が生成されました。Flynotyperの前に画像がilastikで前処理されていなかった場合、全体的なPスコアは非変性眼と変性眼の間で類似していました。これは、定量的な結果を得るためにリングライトを実装するときに最初にilastikを使用することの重要性を強調しています。

私たちの方法にはいくつかの制限があります。ilastik の設定は大きく異なる場合があり、重要でないデータになる場合があります。たとえば、同じ画像を使用して別の解析セットを実行しましたが、ilastik の前景シグマ値を 5 ではなく 2.5 に調整しました。これにより、中等度の変性表現型で感度が低下しました(補足図S2 および 補足表S1)。もう一つの制限は、変性が大きすぎると目の感度が低下することです。3x_S81L眼と比較して、壊死性斑点のある眼は質的にはるかに退化しています。しかし、3x_S81L眼の平均Pスコアは60.2であったのに対し、壊死性パッチのある眼の平均Pスコアは60.9であった。したがって、壊死性パッチなどの変性が大きすぎる目も、感度の低下につながる可能性があります(補足図S3)。

このプロトコルの重要なステップは、ilastik のトレーニングに使用される適切な標準イメージの選択です。ommatidiaと周囲の色素細胞(赤やオレンジの目など)との間に明確なコントラストを持つ縮退していない標準画像は、Flynotyperでより正確な定量化をもたらします。もう1つの重要なステップは、機械学習ソフトウェアを微調整するために、シグマ値として表される感度が選択されるilastikでの特徴選択です(図1D)。選択が少なすぎると、ilastikの感度が低下し、オマティディアの不正確なマーキングにつながる可能性があります。選択する特徴が多すぎると、結果を生成するために必要な時間と処理能力が長くなり、手順の効率が低下します。あるいは、目の顕著な質的変性があるが、分析結果が統計的に有意でない場合は、選択した特徴のシグマ値を増やすことが潜在的な修正になります。ただし、このプロトコルで提供される機能選択により、定期的に正確な結果が得られます。記載されている重要な手順に従うことで、今後最も一般的な問題とトラブルシューティングを軽減できます。

要約すると、この方法は、より優れた定性的な画像を提供すると同時に、 ショウジョウバエ の眼系の偏りのない信頼性の高い定量化も実現します。したがって、この方法は、将来、変性疾患をモデル化するための強力なツールとして、眼の変性の有用性を高める可能性があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
コンピューターの仕様			Ryzen 5、16 GB RAM、Nvidia RTX 3070 Super、Windows 10
Flynotyper	Iyer、J. et al. (2016)	ソフトウェアのダウンロードはこちら: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html	オープンソースソフトウェア。Flynotyper 2.0は使用しないでください。公開時点では、2.0はかなり新しく、このプロトコルはFlynotyperのオリジナルバージョンに最適化されています。
ilastik	Berg, S. et al. (2019)	ここからソフトウェアをダウンロード: https://www.ilastik.org/download.html	オープンソースソフトウェア.お使いのコンピュータのオペレーティングシステムに対応するレギュラービルドでバージョン1.4.0.post1をダウンロードします。
ImageJ		ここからソフトウェアをダウンロードしてください: https://imagej.net/ij/download.html	オープンソースソフトウェア。バージョン 1.53 と 1.54 が使用されました。1.54 は更新バージョンであり、デフォルトのダウンロードです。
Leica Application Suite (LAS X)	Leica Microsystems	LASX Office 1.4.6 28433	z-stack の取得に使用されるシステムおよびソフトウェア。
ライカ Z16 APO 顕微鏡 DMC2900カメラ付き	ライカ マイクロシステム	10 447 173, 12 730 466	本文中では Z-stack 顕微鏡およびカメラと表記しています。この商品は現在アーカイブされています。