マウス脾臓組織由来エクソソームの単離と特性評価

サマリー

ここでは、コラゲナーゼI型による消化と超遠心分離の組み合わせを使用して、マウス脾臓由来エクソソームを単離するプロトコールを紹介します。

要約

エクソソーム(Exo)は、動物、植物、原核生物など、さまざまな細胞から分泌される脂質二重層構造です。これまでの研究では、体液性バイオマーカーや細胞上清由来のExoが、新規の診断バイオマーカーや予後バイオマーカーの有望な標的であることが明らかになっており、疾患の病因における重要な役割が強調されています。組織由来のExo(Ti-Exo)は、組織の特異性と微小環境を正確に反映する能力により、ますます注目を集めています。Ti-Exoは間質空間に存在し、細胞間コミュニケーションと臓器間シグナル伝達に重要な役割を果たします。Ti-Exoは、疾患メカニズムの解明に価値があると認識されていますが、組織マトリックスの複雑さと抽出方法のばらつきにより、Ti-Exoの単離は依然として困難です。本研究では、マウス脾臓組織からエクソソームを単離するための実用的なプロトコールを開発し、その後の同定解析や機能研究のための再現性の高い手法を提供しました。I型コラゲナーゼ消化と示差超遠心分離を組み合わせて、脾臓由来のExoを分離しました。単離されたExoの特性は、電子顕微鏡、ナノフローサイトメーター、およびウェスタンブロットによって決定されました。単離された脾臓由来のExoは、粒子サイズが30 nmから150 nmの範囲の脂質二重層小胞の典型的な形態を示しました。さらに、エクソソームマーカーの発現プロファイルにより、エクソソームの存在と純度が確認されました。これらを総合して、マウスで脾臓由来のExoを単離するための実用的なプロトコルを確立することに成功しました。

概要

エクソソーム(Exo)は、30nmから150nmの細胞外小胞(EV)のサブグループで、タンパク質、核酸、脂質など、さまざまな生体分子を内包しています¹。これらの生体分子は親細胞に由来し、細胞外空間に放出されます。Exoは、細胞とその周辺微小環境との間の生体分子情報交換を促進し、原核生物系と真核生物系の両方で役割を果たしています²。エクソソームの含有量、サイズ、膜成分、細胞起源などの特性は大きく異なり、起源の細胞タイプ、細胞の状態、環境条件の影響を受けます。

エクソソームは、その供給源に基づいて、細胞培養由来、体液由来、組織由来(Ti-Exo)の3つのカテゴリーに一般的に分類されます。細胞培養由来のエクソソームは、そのアクセス可能性と一貫した収量のために広く研究されてきましたが、長期培養後の細胞特性の潜在的な変化により、その使用は制限され、その生物学的機能を誤って表現する可能性があります^3,4,5。さらに、ほとんどの細胞培養物は、複雑なin vivo細胞間相互作用を模倣しない2次元環境で維持されるため、データの解釈に影響を与える可能性があります⁶。逆に、体液から単離されたエクソソームは、疾患の進行をリアルタイムで監視するための低侵襲オプションを提供する⁷。しかし、これらのサンプルは、しばしば様々な起源からのエキソソームの混合物を含んでおり、それらの主要な供給源⁸の正確な同定を困難にしている。これらの課題を考えると、細胞外間質に存在し、細胞間シグナル伝達の主要なメディエーターであるTi-Exoへの関心が高まっています。

脾臓は、免疫機能と内部の恒常性の維持に重要な役割を果たします。脳、肝臓、腫瘍などの臓器からTi-Exoを単離するための既存のプロトコルにもかかわらず、脾臓由来のエクソソームの実用的な方法は限定的に報告されています^9,10。この研究は、以前の報告11から改変されたマウスの脾臓組織からエクソソームを単離するための実用的なプロトコルを確立することを目的としていました¹¹。コラゲナーゼ消化とそれに続く超遠心分離を含む方法について詳しく説明します。これにより、細胞膜の破壊が最小限に抑えられ、脾臓由来のExoの高純度と収量が確保されます。この確立されたプロトコルを用いた単離されたExoの特性は、電子顕微鏡(TEM)、ナノフローサイトメーター(Nano-FCM)、およびウェスタンブロットによって検証され、さらなる実験的研究のためのプロトコルの有効性が確認されました。

プロトコル

サンプルはマウスから採取し、広東医科大学の倫理委員会から倫理的な承認を得ました。このプロトコルで使用される材料、機器、およびソフトウェアの詳細な説明は、 資料の表に記載されています。抽出前の調製の詳細を 図1に示し、Spleen-Exoの抽出と濃縮のプロセスを 図2に示します。

1. 事前準備

1. 高速遠心分離機と超高速遠心分離機を4°Cに予冷し、卓上シェーカーの温度を37°Cに設定します。
2. 図1A、Bに示すように、細胞培養皿(100 mm)、50 mLの滅菌遠心チューブ、氷、および滅菌細胞ストレーナー(70 μm)を調製します。
3. はさみと鉗子を75%アルコールスプレーで滅菌した後、高温滅菌します。これらのツールを 図 1C に示します。
4. 脾臓組織を氷上の滅菌 100mmシャーレに入れ、1x氷漬け滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で表面の血液を洗い流します。脾臓組織を滅菌ガーゼで乾燥させ、乾燥後に秤量します。
   注:組織が凍結している場合は、先に進む前に、氷の上で皿で15分間解凍します。
5. 滅菌転写ピペットを使用して滅菌PBS1 mLをストレーナーに滴下することにより、セルストレーナー(70μm)に保湿します。
6. Digestive Buffer(0.1% Type Iコラゲナーゼ)を、ボルテックスミキサーで1x PBSを使用して調製します。
   注:脾臓組織100 mgごとに10 mLの消化緩衝液を使用してください。.コラゲナーゼ濃度は、製品の説明書に基づいてこの試験で選択されました。他の組織タイプの場合、研究者は組織の密度と組成に基づいてこれらのパラメータを調整する必要がある場合があります。各組織タイプの最適な条件を決定するために、さまざまな濃度と消化時間での予備実験が推奨されます。

2.組織消化

1. 氷上の培養皿(図3A)でハサミで組織を均一な小片に切り刻み(図3A)、滅菌トランスファーピペットを備えた50 mLの遠心チューブに移します。
2. 上記のように脾臓組織の重量に応じて消化バッファーをチューブに加え(図3B)、次に37°Cの水平シェーカーでチューブを45°の角度で振とうします。 消化の進行状況を監視し、組織の塊が分散し、ほとんどが形を失ったら消化を停止します。消化時間は組織によって異なります。本研究の実験条件下では、消化時間は約30分です。
3. 消化した混合物を室温(RT)でセルストレーナー(Ф70μm)に移し、繊維状およびより大きな組織破片を除去します。
   注:消化後すぐに完全なろ過を行います。
4. 濾液を新しい50 mL遠心分離チューブに集めます。

3. 示差遠心分離法によるエキソソーム単離

1. 濾液を500 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 残存細胞、細胞破片、および核を含むペレットは、 図3Cに示すように、遠心分離後に見ることができます。
2. 上清を新しいチューブに移し、3000 x g で4°Cで20分間遠心分離します。 アポトーシス体とミクロソームを含むペレットは、 図3Dに示すように、遠心分離後に見ることができます。
3. 上清を新しいチューブに移し、10,000 x g で4°Cで30分間遠心分離します。 微小胞と原形質膜を含むペレットは、 図3Eに示すように、遠心分離後に見ることができます。
4. 得られた上清を120,000 x g で4°Cで2時間超遠心分離します。 遠心分離後のチューブの底にペレットが見えます( 図3Fを参照)。
5. 上清を捨て、ペレットをPBSで洗浄し、再度120,000 x g で4°Cで2時間超遠心分離してエクソソームを得ます。遠心分離後のチューブの底にペレットが見えます( 図3Gを参照)。
6. 単離したエキソソームを滅菌PBS(脾臓あたり200μL)で溶解し、単離したエキソソームを新しい2 mL遠心チューブ(-80°C)に保存します。

4. 透過型電子顕微鏡(TEM)によるエクソソーム評価

注:TEMを使用して、抽出されたExoが小胞特性を示したかどうかを判断しました。電子顕微鏡で同定されたExoサンプルは、新鮮なサンプルであるか、4°Cで短時間保存する必要があります。

1. エキソソーム(2-6 μg/μL)を2%電子顕微鏡(EM)グレードのパラホルムアルデヒドで室温で2時間固定します。
2. 10 μLのエキソソーム溶液を銅メッシュに置き、室温で10分間インキュベートし、滅菌蒸留水ですすぎ、余分な液体を吸収紙で拭き取ります。
3. 銅メッシュを2%酢酸ウラニルで1分間染色し、余分な液体を濾紙で拭き取り、白熱灯の下で2分間乾燥させます。
4. 調製した試料を透過型電子顕微鏡で80kVで観察します。

5. エクソソームのサイズ分布と粒子濃度測定

1. 標準ポリスチレンナノ粒子(250 nm)をナノフローサイトメーターにロードします。
2. BCAタンパク質アッセイキットを使用して、Exoサンプルのタンパク質濃度を測定します。BCA Protein Assayの結果に従ってExoサンプルをPBSで希釈し(エキソソームを1-10 ng/μLに希釈)、Exoサンプルをナノフローにロードして側方散乱強度(SSI)を測定します。
3. 標準ポリスチレンナノ粒子中のSSIと粒子濃度の比に従ってExo濃度を計算します。
   注:サイズ測定の場合、グラジエントサイズ(68 nm、91 nm、113 nm、155 nm)の標準シリカナノ粒子をナノフローサイトメーターにロードすることにより、標準曲線が生成されます。Exo サンプルの読み込みは、次のようになります。Exoのサイズ分布は、標準治療法に従って計算されました。

6. エクソソームタンパク質の溶解とイムノブロットの確認

1. タンパク質分析のために、100 μLのRadio Immunoprecipitation Assay(RIPA)溶解バッファーをエキソソームペレットに添加します。
2. 激しく渦を巻き、パラフィルムで覆い、RTで20分間岩を動かし、その後再び渦を巻きます。
3. 1000 x g で30〜60秒間短時間遠心分離してサンプルを採取し、新しい1.5 mL微量遠心チューブに移し、分析まで-20°C〜-80°Cで保存します。
4. イムノブロットでは、サンプルを5倍ローディングバッファーと混合して1倍の濃度を達成し、ゲル電気泳動を調製します。
5. 全組織ホモジネートコントロールが必要な場合は、上記で詳述したように、プロテアーゼ阻害剤を含む強力な溶解バッファーを使用して組織を溶解します。次に、サンプルを10,000 x g で10分間遠心分離し、残りの細胞外マトリックス、全細胞、または無傷の細胞破片を廃棄します。
6. エキソソームまたは組織ホモジネートを含むサンプルバッファーを95°Cで5〜10分間煮沸します。レーンごとに等量のタンパク質を10% SDS-PAGEゲルにロードします。組織ホモジネートの等価タンパク質をコントロールとしてロードします。
7. 従来の電気泳動バッファーを使用して、80 Vの電圧で約2時間ゲル電気泳動を進めます。ウェスタンブロット分析を実施して、精製したライセート中のExoタンパク質の発現を確認し、フラクション中の相対的なExo存在量を比較します。

結果

脾臓由来エクソソームの単離と精製
マウス脾臓組織からエクソソームを単離するために、コラゲナーゼ消化と示差超遠心分離の組み合わせを採用しました(図2)。最初のステップでは、脾臓組織を前処理して表面の血液を除去し、その後、I型コラゲナーゼで消化しました。この酵素処理により、細胞外マトリックス成分の分解が促進され、エクソソームの完全性を維持しながらエクソソームが遊離しました。消化後、一連の遠心分離ステップを使用して、細胞の破片、アポトーシス体、およびより大きな小胞を順次除去し、最終的に上清を120,000 x gで超遠心分離してエキソソームをペレット化しました。その後の単離手順により、図3Gに示すように、脾臓由来のExoが豊富なPBS可溶性ペレットが得られました。

TEM の結果
単離されたエクソソームの形態は、エクソソームの特性評価を研究するためのゴールドスタンダードの方法である透過型電子顕微鏡を用いて調べられました。TEMは、エクソソームの存在の検証、エクソソームの品質の評価、エクソソームの形態の観察によく使用されます。TEM画像(図4A)は、エクソソームの特徴であるカップ状の小胞の存在を明らかにしました。これらの小胞は透明な脂質二重層構造を示し、脾臓組織からのエキソソームの分離が成功したことを確認しました。

Spleen-Exoのサイズ分布
エキソソームのサイズ分布と濃度は、ナノフローサイトメーターを使用して決定しました。結果(図4B)は、単離されたエキソソームの直径が30〜150nmの範囲であり、ピーク濃度が約60nmであることを示しました。単離された粒子の直径は主に50〜80nmで、平均粒子濃度は4.6×10⁹ 粒子/mLでした。このサイズ範囲は、以前に報告されたエクソソームの特性と一致しており、単離プロトコルをさらに検証しています。

ウェスタンブロット解析
エキソソームマーカーの存在を確認するために、ウェスタンブロット分析を行いました。エクソソームマーカーTSG101およびCD9はSpleen-Exoサンプルで検出されましたが、ネガティブコントロールとして使用されたゴルジマトリックスタンパク質であるGM130は検出されませんでした(図4C)。これに対し、これらのマーカーのタンパク質はマウスの脾臓組織で発現していました(Spleen-T)。これは、単離されたエキソソームが細胞汚染物質を含まなかったため、高純度であることを示しています。

図1:供給準備 (A)50 mLの遠心チューブ、培養皿、氷、および手術器具をバイオセーフティキャビネットに入れました。(B)滅菌セルストレーナー(70μm)。(C)滅菌された手術器具。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:脾臓-Exo分離手順。 脾臓組織を調製し、アイスPBSで小片に切断した後、I型コラゲナーゼによる消化と指示通りの遠心分離を行います。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:Spleen-Exo分離の代表的な画像 (A)その後の消化に備えた小さな脾臓ブロック。(B)消化緩衝液を含む脾臓組織ブロック。(C)500 x g 遠心分離後のペレット。(D)3,000 x g 遠心分離後のペレット。(E)10,000 x g 遠心分離後のペレット。(F)120,000 x g 遠心分離後のペレット。(G)120,000 x g 遠心分離後のエキソソームペレット。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:脾臓-Exoの同定 (A)TEMの結果は、孤立した粒子がカップ状の形態を持つ円形または楕円形の膜状小胞であることを示しています。スケールバー = それぞれ 200 nm と 50 nm です。(B)Flow Nano Analyzerによるサイズ分布分析により、Spleen-Exoの直径は主に50 nmから80 nmの範囲であり、平均粒子濃度は4.6 × 10⁹ particles/mLであることが示されました。(C)Spleen-Exoにおけるエキソソーム特異的マーカータンパク質(TSG101およびCD9)の発現を示すウェスタンブロット解析、およびGM130の陰性発現。これらのマーカーは、マウス脾臓から抽出したタンパク質サンプル(Spleen-Tグループ)で検出可能でした。代表的なウェスタンブロット画像を示しました(n = 6組織)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

最近の研究では、脾臓由来エクソソーム(Spleen-Exo)が胃癌の治療に重要な役割を果たすことが報告されています¹²。Spleen-Exoの機能を更に解明するためには、脾臓組織からの再現性のある最適な抽出方法を確立する必要があります。脳および肝臓癌^13,14からエキソソームを単離するためのプロトコルが存在する一方で、他の組織に対する方法は未開発のままであり、さらなる検証が必要である。この研究では、脾臓組織からExoを単離するための実用的な方法を概説しました。

過去数年にわたり、超遠心分離、密度勾配遠心分離、磁気ビーズ免疫吸着、限外ろ過、ポリマー沈殿など、科学研究やアプリケーションでExoを抽出するためのさまざまな方法が使用されてきました¹⁵。超遠心分離は、さまざまなソースからExoを抽出するためのゴールドスタンダードの方法です。これまでの研究では、組織構造を破壊して、Exo¹⁶の細胞内および細胞外供給源からなる高濃度のExoを得ることに焦点を当ててきました。コラゲナーゼは、細胞膜の完全性への影響を最小限に抑え、Ti-Exo³の純度を確保します。コラゲナーゼは、ヒト転移性黒色腫、脂肪、結腸癌、および肝臓癌組織5,10,13,17から細胞外小胞を抽出するために使用されています。ただし、コラゲナーゼの濃度と消化時間は組織によって異なります。

私たちは、I型コラゲナーゼを用いてSpleen-Exoを分離し、消化に続いて示差超遠心分離によるろ過を行い、高品質のSpleen-Exoを得るための特異的なプロトコルを確立しました。超遠心分離は、サンプル¹⁶から残留細胞、大きな小胞、細胞破片、およびアポトーシス体を効果的に除去することができる。Crescitelliらは、コラゲナーゼDとグラジエント超遠心分離法を用いて、平均直径75 nmの小さな細胞外小胞を単離しました⁵。彼らのプロトコールと比較して、私たちのプロトコールでは、I型コラゲナーゼと120,000 x gの追加超遠心ステップを使用して、エキソソームの最適な純度を達成しました。組織懸濁液^14,18を得るために組織の均質化を使用した以前の報告とは対照的に、我々のアプローチは組織中の細胞の膜完全性を維持する。さらに、Vellaらは、密度勾配遠心分離(三重ショ糖勾配)を適用して3つの粒子群を生成したが、これは操作¹⁰に余分な時間を必要とした。このアプローチでは、200 nmを超えるサイズの大きな小胞、50 nmから200 nmの範囲のサイズの小胞の不均一な集団、およびサイズが約20 nmの小さな小胞が生成されました。この研究プロトコルに記載されているプロトコルは、残留細胞、細胞破片、アポトーシス体、およびより大きな小胞を系統的に除去するための一連の超遠心分離ステップを含み、得られたエクソの純度を高めます。上澄み採取の際は、沈殿したペレットの邪魔にならないように、慎重な取り扱いを重視しています。

単離されたSpleen-Exoの形態と純度を、TEMおよびナノ粒子追跡分析を通じて評価します。両方のアッセイは、このプロトコルによって単離された脾臓由来の粒子が、エキソソームの典型的な特性である30nm〜150nmの範囲のサイズの脂質二重層およびカップ状の小胞を示したことを明らかにした¹⁹。CD9およびTSG101はエキソソーム^{マーカー19}であり、ゴルジタンパク質であるGM130はエキソソーム同定のネガティブマーカーとして使用される²⁰。その結果、Spleen-ExoはCD9とTSG101に対して陽性であったのに対し、GM130は検出されなかったことが示され、高品質の組織由来Exoが脾臓から単離されたことが確認されました。

高品質なTi-Exoを実現するためには、適切な酵素の種類、濃度、消化時間の選択、および適切な組織保存が不可欠です。新鮮脾臓組織由来のExoと凍結脾臓組織由来のExoとの間にタンパク質濃度に有意差は認められず(データは示さず)、大量の凍結組織を処理してワークフローを短縮することが可能であることが示された。Ti-Exoの単離には超遠心分離機の運転時間が長いため、新鮮な組織を臨床アプリケーションで使用する場合、適切な期間内にすべてのプロトコルを完了することは現実的ではありません。したがって、エキソソームの単離に凍結組織を使用することは、より良い選択肢となるでしょう。37°Cでの解凍は、組織への凍結保護剤の浸透が不完全であるため、凍結組織には適していません。凍結組織を氷上で融解してエクソソーム単離を行ったところ、エキソソームの収量は新鮮組織と比較して含量に有意性を示さなかったことが報告された²¹。そこで、凍結した脾臓組織を氷上で解凍し、-80°Cで保存試料を使用する際にエキソソーム単離を行いました。

ただし、この研究で説明されているプロトコルにはいくつかの制限があります。抽出と同定に関わる広範なステップには時間がかかります。Exoの研究を臨床疾患治療に応用するという究極の目標を考えると、より迅速で費用対効果の高い方法がますます重要になってきています。さらに、結果はマウス組織サンプルに基づいていますが、ヒト組織への適用性はまだ決定されていません。

結論として、このプロトコルは、詳細なダウンストリーム分析に適した、脾臓組織から高純度のExoを抽出する方法を提供します。組織由来のExoは、その起源の微小環境をより正確に反映し、生体の生理学的および病理学的プロセスを解明するための大きな可能性を秘めています。将来の研究では、このプロトコルをヒト組織に適応させ、診断および治療目的で臨床的に重要なエクソソームの抽出を可能にする可能性があります。この手法は、免疫系における脾臓の重要な機能を考えると、免疫応答におけるエクソソームの役割を研究するのに特に役立つ可能性があります。さらに、このプロトコルは、他の組織からエキソソームを分離するように変更することができ、組織特異的なバイオマーカーや標的療法の開発に役立つ可能性があります。エクソソーム生物学の理解を深めることで、このプロトコールは精密医療の進歩と新しい治療戦略の開発に貢献することができます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
70 & マイクロ;m Cell Strainer	Biologix Group Co., Ltd.USA	15-1070
抗 CD9 抗体	Cell Signaling Technology, Inc, Inc (CST), USA	983275
抗 GM130 抗体	Proteintech Group, Inc.中国	66662-1-LG
抗TSG101抗体	Abcam Plc、英国	125011
細胞培養皿	無錫NESTバイオテクノロジー株式会社、中国	704001
遠心分離管	錫NESTバイオテクノロジー株式会社、中国	788211
コラゲナーゼI型	Sigma-Aldrich株式会社、米国	C2674
デスクトップサーモスタットシェーカー	上海ブルーパードインスツルメンツ株式会社、中国	THZ-100
電気泳動バッファー	武漢Servicebio技術有限公司、中国	G2081-1L
強化型BCAタンパク質アッセイキット	Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China	P0010S
Flow NanoAnalyzer	NanoFCM Inc.、中国	N30E
蛍光/化学発光イメージングシステム	Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., China	GelView 6000Plus
HRP ヤギ抗マウスIgG	Proteintech Group, Inc.China	15014
HRP ヤギ抗ウサギIgGプロ	テインテックグループ、中国	15015
マイクロプレートリーダー	Molecular Devices, USA	CMax Plus
Microscissors	Shanghai 医療 機器(グループ) Co., Ltd.,China	WA1010
Microscopic Tweezers	Shanghai 医療 機器(グループ) Co., Ltd.,China	WA3010
Multifuge X1R Pro centrifuge	Thermo Fisher Scientific, USA	75009750
Ophthalmic scissors	Shanghai 医療 機器(グループ) Co., Ltd.,China	Y00030
Ophthalmic Tweezers	Shanghai 医療 インスツルメンツ(グループ) Co., Ltd., China	JD1060
Optima XPN-100限外ろ過遠心分離機	ベックマン・コールター、米国	A94469
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)	Beijing Solarbio Science &Technology Co.,Ltd., China	P1003
RIPA lysis buffer (strong, without inhibitors)	Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China	P0013K
定規	デリ 製造業 会社名、中国
SDS-PAGEサンプルローディングバッファー、5x	Shanghai Beyotime Biotechnology Co.、Ltd.、中国	P0015
トランスファーピペット	Biologix Group Co., Ltd.USA	30-0238A1
透過型電子顕微鏡	日立製作所	H-7650
超遠心チューブ	ベックマン・コールター アメリカ	355618
Western Transfer Buffer	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., 中国	G2028-1L