Ex Vivoモデルにおける組織石灰化の包括的な特性評価

サマリー

提案されたプロトコルは、マルチモーダル分析を使用して骨再生の文脈で骨形成を評価するためのグローバルなアプローチを伴います。これは、新しい骨形成に関する定性的および定量的な情報を提供し、基本的および前臨床研究の厳密性と妥当性を高めることを目的としています。

要約

骨再生の文脈における組織石灰化の広範な特性評価は、現在分析に利用可能な多数のモダリティを考えると、大きな課題を表しています。ここでは、関連する大型動物骨ex vivo 外植片を用いて、新しい骨形成を包括的に評価するためのワークフローを提案する。骨欠損(直径= 3.75 mm、深さ= 5.0 mm)が外植された羊の大腿骨頭に作成され、骨形成促進性成長因子(骨形態形成タンパク質2-BMP2)をロードしたマクロ多孔質骨代替物が注入されます。その後、外植片を28日間培養中に保持し、細胞のコロニー形成とその後の骨形成を可能にします。新たに石灰化した組織の品質と構造を評価するために、次の連続した方法が設定されます:(i)マイクロCTを使用した外植片全体の特性評価と高解像度3D画像、続いて石灰化組織の識別を強化するための深層学習画像分析。(ii)新たに形成された組織の機械的特性を決定するためのナノインデンテーション。(iii)ヘマトキシリン/エオシン/サフラン(HES)、ゴールドナートリクローム、モバットペンタクロームなどの組織学的検査により、特に骨様バリアの視覚化と骨細胞の存在に関して、石灰化組織の定性的評価を提供します。(iv)石灰化の程度を定量化し、表面形態、鉱物組成、および骨-生体材料界面に関する詳細な洞察を提供するための内部参照を使用した後方散乱走査型電子顕微鏡(SEM)マッピング。(v)ラマン分光法により、鉱化マトリックスの分子組成を特徴付け、ペプチド結合の検出を通じてセメント内のBMP2の持続性に関する洞察を提供します。このマルチモーダル分析は、新しく形成された骨の効果的な評価と、石灰化組織に対する包括的な定性的および定量的洞察を提供します。これらのプロトコルの標準化を通じて、研究間の比較を容易にし、研究成果の妥当性と信頼性を向上させることを目指しています。

概要

骨の欠損は、外傷、腫瘍切除、先天性異常、感染などによって引き起こされるかどうかにかかわらず、再生医療にとって大きな課題となっています。これらの変化は、骨格系の構造的完全性を損ない、不快感、機能障害、および患者の生活の質の低下につながります。

これらの課題を克服するために、骨形成と骨組織再生の強化に焦点を当てた革新的な骨修復戦略が登場しました。これらのアプローチには、埋め込み型、注射用、または3Dプリント可能な骨代替物の使用が含まれ、これらは天然由来(バイオソースの高分子、動物由来のヒドロキシアパタイトなど)または合成(バイオグラス、リン酸^{カルシウムなど)}1です。骨再生を誘導し刺激する骨の生来の低能力を強化するために、骨代替物に骨形成タンパク質(BMP)などの骨誘導因子を充填して、前駆細胞の骨形成分化を促進し、骨形成を促進することができます²。

骨形成は、コラーゲンマトリックスの初期形成に基づいており、その後、ヒドロキシアパタイト結晶によって石灰化され、それによって骨構造³が強化されます。このプロセスにより、骨に特定の剛性と強度が与えられます。石灰化組織の品質は、その微細構造属性と石灰化の程度によって複雑に支配されます⁴。この品質は、骨の治癒と再生された骨⁵の機能において極めて重要な役割を果たします。しかし、骨の石灰化を特徴づけることは、多変量研究^6,7,8における固有のばらつきのために、依然として困難な課題である。

さらに、骨移植代替物の生体適合性、細胞適合性、および分化の可能性の初期評価は、通常、 in vitroで実施されます。しかし、方法論的な格差が、アウトカムのシームレスな比較を妨げています。さらに、これらの in vitro 研究は、骨再生プロセスの調節に不可欠な骨髄細胞を含む細胞集団間の多細胞相互作用と複雑な相互作用を完全には捉えていません⁹。骨微小環境の正確な表現の欠如は、その後の前臨床研究¹⁰の精度を損なう可能性があります。

in vivo評価は、生理学的状況をより正確に表現しますが、倫理的、ロジスティック、および財政的な考慮事項によって制約されます。したがって、ex vivo評価は、in vitro研究とin vivo研究の間のインターフェースとして極めて重要な役割を果たし、生きた被験者11,12,13の実験に進むための必要な中間ステップとして機能します。

これに関連して、再生された骨組織の品質を評価し、前臨床モデルに移行する前に戦略の関連性を確保するためには、包括的な特性評価手法の実装が必要です。そこで、ヒツジの膝関節組織を用いた外植片モデルの解析に基づくプロトコールを提案する。この革新的な方法論では、BMP2を充填したセメントを外植片に埋め込み、28日間の培養後に組織の石灰化を詳細に分析します。

この研究で採用された技術的アプローチは多様で補完的であり、再生された骨組織の品質を評価するための包括的なアプローチをまとめて提供します(図1)。高解像度のマイクロCTイメージングにより、骨構造の詳細な3D視覚化が可能になり、新しく形成された組織のミネラル密度、形態、完全性に関する貴重な洞察が得られます。この手法は、骨再生の有効性を評価し、経時的な石灰化の進行を監視するために重要です。ナノインデンテーションは、組織の硬さや強度など、組織の機械的特性を決定するための正確なアプローチです。この方法では、ナノメートルスケールで加えられた力に対する材料の応答を測定することにより、石灰化組織の堅牢性と品質を評価できます。ヘマトキシリン/エオシン/サフラン(HES)、ゴールドナートリクローム、モバットペンタクロムなどの一般的な染色法を用いた組織学的検査は、組織の構造と組成に関する貴重な洞察を提供します。これらの染色により、細胞、細胞外マトリックス、ミネラル沈着物など、さまざまな組織成分の分化が可能になり、骨再生プロセスの包括的な定性的評価が可能になります。後方散乱走査型電子顕微鏡(SEM)マッピングは、サンプルの表面を高解像度で可視化し、骨基質の石灰化の程度や、埋め込まれた材料と宿主組織との間の界面の詳細な分析を可能にします。最後に、ラマン分光法は、特にタンパク質、脂質、ミネラルなどの特定の成分の同定を通じて、組織の分子組成に関する情報を提供します。このアプローチにより、鉱化マトリックスの特性評価とBMP2などの成長因子の検出が可能になり、再生培地における骨形成促進性刺激の持続性に関する重要な情報が得られます。

私たちの研究は、さまざまな分析技術を統合した学際的なアプローチを使用して、再生された骨組織の品質の徹底的かつ包括的な評価を提供することを目指しており、したがって、骨移植代替物の評価とその潜在的な臨床応用のための強固な基盤を提供します。

プロトコル

この研究は、倫理および動物福祉委員会およびフランス国立獣医食品局によって番号G44171で承認されています。

1. 骨軟骨外植片の調製と培養

1. 無菌環境で安楽死させたばかりの動物から羊の関節標本を収穫します。羊を仰臥位に置き、左後肢を剃ります。膝関節の周りをアルコールで消毒して準備します。外側傍膝蓋骨切開術を使用して、前十字靭帯と後十字靭帯を露出させ、続いて膝蓋骨脱臼を使用して大腿骨滑車を明らかにします。
   1. 組織採取後、骨軟骨自家移植システムを使用して、外側顆に直径 4.75 mm の欠損を作成します。
2. 整形外科用ハンマーを使用して、深さ10mmの欠陥を作成し、顆から外植片を回収します。続いて、骨軟骨自家移植システムを使用して、最初の欠陥を中心に直径8mmの2番目の欠陥を行います。これにより、8 mm x 10 mmの骨軟骨外植片が得られ、4.75 mm x 10.0 mmの中央欠損が含まれます。
3. 物流上の理由から必要な場合は、外植片を1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したハンク平衡塩溶液(hBSS)で輸送し、4°Cで保存します。
4. 外植片をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回すすぎ、4.75 mm x 10.0 mmの欠損部に40 μg/mLのBMP2を添加したリン酸カルシウムセメントを注入します。以下に説明するようにセメントを準備します。
   1. アパティックリン酸三カルシウムロッド(120 MPaの静水圧プレス)を1364°Cで最低12時間熱処理することにより、α-リン酸三カルシウム(α-TCP)を製造し、続いて¹⁴を空冷します。
   2. α-TCPロッドを無水エタノール中で遊星ミルボール2回、500rpmで5分間粉砕し、13.1±1.7μmの微粉末を生成します(前述のように、レーザー回折を使用して測定¹⁴)。
   3. α-TCP粉末を180°Cで45分間乾熱して滅菌します。リン酸カルシウムセメントを、α-TCP粉末を2.5%(w / v)Na₂HPO₄ 0.22μmろ過溶液(液体/粉末比0.35)と1分間混合して調製します。
   4. 18Gの針を使用して注入する前に、セメントペーストを3mLのシリンジに入れます。
5. 室温(RT)で10分後、外植片を25cm²のフラスコに移し、10%のウシ胎児血清と1%ペニシリン-ストレプトマイシンを補給したダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)高グルコースからなる10mLの完全培地を穏やかに加えます。
6. 外植片を5% CO₂ の入った37°Cインキュベーターで最大28日間維持し、層流フードの下で2日ごとに全培地を交換します。
7. 外植片をPBSで3回すすぎます。それらを50 mLチューブに移し、20 mLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)を加え、4°Cで3日間保持します。次に、外植片をPBSですすぎ、70%エタノールで保存してから、その後の分析を行います。

2. マイクロCT解析

1. マイクロCTX線を用いたマイクロトモグラフィー解析を行います。10.7 μmの分解能でX線投影を取得し、露光時間は1200 ms、1 mmのアルミニウムフィルター(80 kVおよび125 μA)を使用します。0.45°の回転増分ごとに3つの画像を平均化して、S/N比を向上させます。
2. リファレンススキャンによるX/Yアライメント後、メーカーの再構築ソフトウェアを使用して3次元(3D)画像を再構築します。これには、スムージング:0、リングアーティファクト:3、ビーム硬化:35%のパラメータがあります。画像処理ソフトウェアで画像スタックをクリーニングし、2次元(2D)および3D視覚化ツールで観察します。

3. ディープラーニングによる画像解析

1. 専用の専用ソフトウェアを使用して画像セグメンテーションを行います。統合セグメンテーション ウィザードを使用して、骨とセメントの識別のための深層学習モデルに学習させます。
2. 再構成されたマイクロCT画像から、骨、セメント、および背景を含む代表的なゾーン(フレーム)を選択します。この最初のフレームは、ソフトウェアが提供する単純なツール(しきい値など)または強力なツール(伝播など)を使用して手動でセグメント化します。
3. [モデル] タブでディープ ラーニング モデルを生成し、ドロップダウン メニューで [3D-Unet ルーチン ] を選択します。生成されたモデルを右クリックして分析する画像を使用して、その実験パラメータをadequationで定義します。ここで、深さ5、パッチサイズ32 x 32、Adadetla アルゴリズム、ストライド比 0.25、データ拡張 x10。
4. セグメント化されたフレームを使用して、深層学習ルーチンを訓練します(「Train Button」をクリック)が、これは、その高速で正確な画像セグメンテーション機能^3,15に関連していると認められています。トレーニングが完了したら、2 番目の作業ゾーン (フレーム) を定義し、predict 関数を使用して自動的にセグメント化します。
   1. 必要に応じて手動修正を適用して、より正確なトレーニング データを生成します。もう一度ルーチンを訓練します。満足のいく結果が得られるまで、このプロセスを繰り返します。データ拡張の数は、トレーニング フレームの数が増えるにつれて徐々に減少します。
      注: モデルのトレーニング中に提供される DICE インデックスは、(入力情報と比較して) モデルの精度を示しますが、十分ではありません。モデルの関連性の確認は、3人の独立した経験豊富な研究者による自動的にセグメント化されたデータの検証によって実行する必要があります。
5. 「Export」ボタンをクリックしてモデルを公開し、「Segment > Exported Model > Segment Full Dataset」をクリックして、マイクロCTデータセット全体に適用します。

4. 埋め込み

1. 骨外植片を、70%アセトンと30%キシレンで構成される25mLの脱水溶液を含む40mLガラスバイアルに入れて脱水します。.ガラスバイアルを回転ホイールに置き、RTで1時間、この手順を3回繰り返します。
2. 脱水溶液を25 mLのキシレンと交換し、ガラスバイアルを回転ホイールにRTで1時間置きます。.
3. キシレン溶液を、10%過酸化ベンゾイル(BPO)および10%フタル酸ジブチル(DBP)を含む25mLのメタクリル酸メチル(MMA)に置き換えます。.RTで1時間回転ホイールに置き、この手順を2回繰り返します。

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結果

外植片のマイクロCT画像を 図2に示します。手動セグメンテーションでは、グローバル閾値を使用して、中央管に存在するセメントから骨を最適に分離することはできません。海綿骨やセメントの認識を向上させるために、深層学習の活用を提案します。ディープラーニングは、生体材料の特性を認識するのに強力であり、骨とセメントの分離を改善するのに役立ち、セメントと骨の相互作用をより適切に評価することを可能にします。これは、セメントとの界面で形成される骨の量を正確に定量化し、この計算に偽のピクセルを組み込まないようにするために最も重要です。

しかし、単に界面の骨を定量化するだけでは、新しく形成された骨を特徴づけるには不十分です。新しい骨の強度と、この新しいマトリックスの形成につながった細胞メカニズムをよりよく理解するには、骨マトリックスの品質と細胞組成に関するより詳細な研究が必要です。骨マトリックスは、qBEIとラマン顕微分光法の2つの補完的なアプローチを使用して特性評価できます。qBEI イメージの例を 図 3 に示します。qBEIでは、グレースケールでエンコードされた各ピクセルがカルシウム濃度に変換されます。これは、海綿骨のカルシウム含有量の分布を評価し、(i)セメントとの界面で新たに形成された骨の石灰化の程度、および(ii)セメントの存在が海綿骨の石灰化を妨害するかどうかを理解するための前提条件です。qBEIの利点は、より長い取得時間を必要とするラマン顕微分光法とは異なり、非常に短時間で高解像度の画像を取得できることです。Ca_平均、Ca_ピーク 、Ca_幅 などのqBEIパラメータは、カルシウム分布から導き出し、2つのセメントまたは生体材料間の応答を比較するために使用できます。

一方、qBEIは、生体材料との界面における骨基質の有機相の品質に関する情報を提供しません。有機相の材料特性に関する追加情報は、ラマン顕微分光法から得られます。ラマン顕微分光法は、導電性炭素層を除去するために、迅速な表面研削と琢磨の後、qBEIに使用されたものと同じ試料に対して行われます。ラマン顕微分光法では、各ピクセル位置でスペクトルが取得されます。未処理の生のラマンスペクトルと処理済みのラマンスペクトルの例を 図4に示します。各スペクトルには、分析されたピクセルの組成に関する情報が含まれており、埋め込み樹脂に関連するピーク、この場合はpMMA、鉱物相、ピークv1PO4およびv1CO3、および有機相、ピークPro、Hyp、CML、Amide III、PG、CH2、Penが含まれます。とアミドI。 図 4 の例では、未処理のスペクトルは、~812 ^cm-1 でのコーティング樹脂の寄与と、近赤外赤色レーザーが使用されていますが、蛍光によるゼロ以外の湾曲したベースラインを示しています。スペクトル処理は、さまざまなラマンパラメータの正確な計算、特にバックグラウンド蛍光の除去を確保するための前提条件です。データを取得する際、ユーザーは正確な位置決めと検出器の飽和の回避の両方を確保して、~960 ^cm-1 に位置する v1PO4 ピークの存在を確認する必要があります。後処理に続いて、特性振動モードの位置に応じてピーク強度比が計算されます。

しかし、材料組成の変化が生体力学的反応の変化につながったかどうかは疑問です。新たに形成された骨の生体力学に関する情報を収集するために、ラマン顕微分光法に使用したのと同じサンプルでナノインデンテーション研究を体系的に実施しています。組織の機械的情報は、荷重対深さ曲線で表されるナノインデンテーション曲線から得られます(図5)。試験の終了時に深さがゼロに戻らないことは注目に値しますが、これは塑性変形と材料に生じる永久的な損傷を表しています。インデンテーションクリープ率は、深さ対時間曲線から導き出されます。

最後に、組織学的染色を使用して、生体材料に対する組織の応答を細胞レベルで評価します(図6)。提案された組織学的染色により、骨様組織の存在だけでなく、細胞(マクロファージ、多核巨細胞、破骨細胞、骨芽細胞)の同定、および生体材料との界面における線維性カプセルの存在の可能性も判断できます。これは、生体材料の生体適合性を理解するために非常に重要ですが、生体材料が劣化したときの新しい骨の持続性も理解するために重要です。

全体として、マルチメソッドアプローチにより、骨形成、新しく形成された骨の品質、および細胞組成の詳細な研究が可能になります。提案された順番に実施すると、すべての調査を同じサンプルで実施できるため、コストと処理時間が削減されます。

図1:グラフィカルアブストラクト。 プロトコルの手順の概要については、こちらを参照してください。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:マイクロCTとディープラーニング解析 (A)マイクロCT画像の3D再構成。(B)骨とセメントのセグメンテーション:手動セグメンテーションとディープラーニングの比較。スケールバー= 5 cm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:カルシウム含有量を決定するための定量的反射電子イメージング。 (A)走査型電子顕微鏡(SEM)で得られたグレーレベルからなる後方散乱画像を、画像解析ソフトウェアによって(B)骨サンプルのホットスポットを示すカルシウムマップに変換します。(C)カルシウム含有量と骨面積の分布をプロットし、3つの主要なqBEIパラメータ(Camean、Capeak、Ca幅)を計算します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:ラマンスペクトルの例。 (A)スペクトル範囲800〜1800cm-1で得られた未処理の生ラマンスペクトル。スペクトルが0から始まらないため、蛍光バックグラウンドははっきりと見えます。樹脂寄与(pMMA)は、~812 ^cm-1ではっきりと見えます。(B)処理されたスペクトル。関心のあるさまざまな振動モードの位置は、スペクトル上に示されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

(A) ナノインデンテーションデバイスは、試料ブロックの表面における関心領域の位置を定義するために使用される光学部品で構成され、その後、ブロックはインデンテーション部品の下に平行移動されます。(B) 荷重対時間および深さ対時間は、インデンテーション試験中にプロットされ、(C) 荷重対深さ曲線。この例では、選択した深さは 400 nm に固定されています。最大荷重(L_m)、荷重終了時の深さ(h_l)、一時停止期間後の深さ(h_m)、除荷セグメントの傾き(S)、および試験の積荷-除荷フェーズ下の面積(W_plast)は、荷重対深さ曲線から導出され、さまざまなナノインデンテーションパラメータの計算に使用されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:培養28日後にセメントで処理した骨軟骨外植片の組織学的分析 (A)Movat染色は、骨と欠陥を埋めるセメントを含む組織構造を示しています。(B)HES染色は、セメント周囲の組織統合と細胞応答を示しています。スケールバー:2.5mm.(C)(B)の強調表示された領域の拡大率は、セメントと周囲の組織との間の界面を詳細に示しており、細胞がセメントに侵入しているのを観察できます。スケールバー:500μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

骨欠損の修復は、罹患者様の可動性を回復し、痛みを軽減し、生活の質を向上させるための再生医療における大きな課題です。外植片モデルの使用は、骨欠損修復の研究のためのin vivo研究と比較して多くの利点を提供します。倫理的な考慮事項に加えて、このモデルでは、実験条件の厳密な制御と生物学的変動性の減少が可能になり、より正確で再現性のある結果の生成が容易になります。さらに、ヒツジの骨の機械的および生物学的特性は、他の動物と比較して、ヒトの骨のそれと密接に一致している^23,24。これにより、ヒツジの外植片モデルは、前臨床試験に特に関連性のある選択肢であり、人間の臨床状態の代表的なモデルになります。

イメージングおよび材料科学の方法論の発展とともに、ここで説明する外植片モデルは、制御された環境で再生医療が骨格組織に及ぼす影響を調査し、実験バイアスを低減するための優れたモデルを表しています。外植片の寸法と形態は、新骨形成と材料特性の詳細な分析に最適であり、包括的な評価と特性評価を可能にします²⁵。これらの知見は、このモデルの臨床応用の可能性を強調しており、骨移植代替物を評価するための強固な枠組みを提供し、骨再生治療における臨床転帰の成功の可能性を高めるものである。さらに、このモデルは、効果的な骨修復戦略を開発するための重要な要素である骨統合と生体材料の性能の正確な評価を容易にします。

研究を成功させるためには、プロトコルの主要な手順を細心の注意を払って従うことが重要です。最も重要な側面の1つは、包埋プロセス中にサンプルが完全に脱水されていることを確認することです。水分が残っていると、適切なレジンの埋め込みが妨げられ、レジンがぼやけて不透明になり、結果の明瞭さと精度が損なわれたり、組織学の切片作成中に穴が開いたりする可能性があります。この細部への細心の注意は、信頼性と再現性のある所見を生み出すために不可欠です。グレーレベルをカルシウム含有量マップに正確に変換するためには、SEM分析にファラデーカップとC、Al、Si標準物質を使用したキャリブレーションを採用することが不可欠です。反射電子検出器の違いが結果のばらつきにつながる可能性があるため、すべてのサンプルで同じSEMを使用する際の一貫性を確保することが重要です。ラマン分光法では、蛍光バックグラウンドを排除し、包埋樹脂とサンプルのピークを区別するために、波数のキャリブレーションと徹底的なベースライン補正が不可欠です。ナノインデンテーションでは、圧子の変位限界を考慮すると、完全に滑らかな表面を実現することが重要であり、信頼性の高い測定を確保するためには、溶融シリカなどの既知の標準によるキャリブレーションが必要です。

これらの技術の変更とトラブルシューティングは、測定の一貫性に影響を与える可能性のある骨材料の異方性に対処することがよくあります。例えば、ラマン分光法では、入射レーザーの偏光が記録される強度に大きな影響を与えることがあります。開口数が小さい20倍対物レンズを使用すると、この問題の軽減に役立ちます。また、データの完全性を維持するためには、すべてのサンプルで一貫したキャリブレーションと測定条件を確保することも最も重要です。骨の固有の異方性は、特にラマン分光法などの手法において、測定の均一性に影響を与える可能性があるため、これらの方法論の限界を表しています。さらに、正確な校正と環境制御の必要性により、これらの側面が細心の注意を払って管理されていない場合、一般的な適用性が制限される可能性があります。

これらのアプローチの潜在的な適用性は、骨修復のための新しい生体材料と治療戦略の評価に大きく及びます。このモデルの能力は、人間の骨の生理機能を厳密に模倣しているため、前臨床試験のための堅牢なプラットフォームとなり、制御された環境での新しい治療法の安全性と有効性を徹底的に評価することができます。このモデルの有用性は、実験室での研究から臨床診療へのトランスレーショナルパスウェイを加速し、骨再生療法の有望な候補を早期に特定することを促進するために特に重要です。この技術は、骨修復材料を評価するための信頼性と再現性のある方法を提供することで、再生医療の進歩と臨床的に実行可能なソリューションの開発をサポートします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.20	フィルターVWR	28145-501
18 G 針 (1,2x40 mm)	ステリカン	4665120
3 mL シリンジ	HENKE-JECT	8300005762
37% 塩酸	VWR	1.00317.1000
酢酸(氷)	シグマ	A6283
アセトン	VWR	20063-365
アルシアンブルー8GX	VWR
水酸化アンモニウム	VWR
アパタイトリン酸三カルシウム	Centre for Biomedical and Healthcare Engineering (Mines Saint Etienne, France)	TV26U
アゾフロキシン	シグマ
過酸化ベンゾイル	Sigma	8.01641.0250
BMP2	メドトロニック	InductOs 1.5 mg/mL
ブリヤントクロセイン	アルドリッチ
CTVox	ブル	カー-DataViewer
	スカイスキャン	-
ダイヤモンドブレード	ストルアス	MOD13
ダイヤモンドソー	ストルアス	アキュトム-50
ダイヤプロ モル B3 ダイヤモンド溶液	ストルアス	40600379
ダイヤプロ ナップ B1 ダイヤモンド溶液	ストルアス	40600373
二塩基性リン酸ナトリウム (Na2HPO4)	シグマ
フタル酸ジブチル	Chimie-Plus Laboratoires	28656
DragonFlyソフトウェア	ORS	2022.1.0.1231.
ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム(DMEM)高グルコース、GlutaMAX(TM)、ピルビン酸	サーモフィッシャーサイエンティフィック	31966-021
オシンY-サージパス	シグマ
エリスロシンB	シグマ
エタノール絶対	VWR
ユーキット	ダッチャー	6.00.01.0003.06.01.01
ファルコン 50 mL	ザルシュテット	62.547.254
塩化第二鉄六水和物 (FeCl3, 6H2O)	メルク	1.03943.0250
ウシ胎児血清(FBS)	ユーロビオ	CVFSVF00
フクシン酸	メルク	1.05231.0025
ハンクス平衡塩溶液(HBSS)	バイオセラ	MS01NG100J
ヘマトキシリン	シグマ	86.118.9
静水圧プレス	Nova Suisse	Pmax 1500 bars
レーザー回折顆粒度計	マルバーン	マスターサイザー 3000
ライトグリーン	プロラボ
炭酸リチウム	Sigma	A13149
MD-Mol研磨布	ストルアス	40500077
メチルシクロヘキサン	VWR	8.06147.1000
メチルシクロヘキサン	VWR	8.06147.1000
メチルシクロヘキサン	VWR	8.06147.1000
メタクリル酸メチル	シグマ	8.00590.2500
マイクロCT、マイクロスキャナー	Bruker	Skyscan 1272
リン酸一塩基性ナトリウム (NAH2PO4)	Sigma	71496
迫撃砲	Fritsch	パルベリセット 6
N,N, ジメチルアニリン	Sigma	803060
ナノインデンテーションステーション	トンパール	NHT2
ND-NAP 研磨布	ストルアス	40500080
OATS 骨軟骨自家移植片転写システムセット、4,75 mm	Arthrex	AR-1981-04S
OATS 骨軟骨自家移植片転写システムセット、8 mm	Arthrex	AR-1981-08S
Orange G	Ral	M15
パラホルムアルデヒド(PFA)	Sigma	P6148
Peel-a-way 使い捨て埋め込み金型	Polysciences, Inc	18646C-1
ペニシリン/ストレプトマイシン (P/S)	ThermoFisher Scientific	15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	10010023
Phosphomolybdic acid	シグマ	221856-100 g
リンタングステン酸	アルドリッチ	12863-5
研磨機	Sturers	Dap V
Poupinel	MEMMERT	TV26U
ラマンマイクロスペクトロメータ	Renishaw	InVia Qontor
Safran du Gâティナイス	ラボノール
走査型電子顕微鏡	Carl Zeiss	Evo LS 10
SEM	Zeiss	Carl Zeiss Evo LS10
SiC 箔/研削紙	Struers	40400008 (#320), 40400011 (#1000), 40400122 (#2000), 40400182 (#4000)
シルバーペイント	電子顕微鏡科学	12686-15
ファラデーカップ、カーボン、アルミニウム、シリコン規格の標準スタブ	Micro-Analysis Consultants Ltd	8602
T25フラスコ	コーニング	430639
キシレン	VWR	28975.325
キシリディンポンソー	アルドリッチ	19.976-1