方法論記事

健康と疾患における組織および血漿特異的プロテオミクス変化の解明

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DOI：

10.3791/67240

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2025年9月23日

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1NRC Fellow, 2Medical Readiness Systems Biology, Walter Reed Army Institute of Research, 3ORISE Fellow, 4The Geneva Foundation, 5AEOP Fellow, 6Culmen International, LLC

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

プロテオミクスは、タンパク質の相互作用、機能、組成、構造、およびそれらの細胞活性のハイスループット評価です。ここでは、血漿や組織を含むさまざまなバイオサンプルにおける総プロテオミクス変化を評価するためのプロトコルを提示します。本明細書で報告された方法論は、タンパク質を含むすべてのバイオサンプルに適用できます。

要約

プロテオミクスは、発現タンパク質の構造、機能、相互作用、存在量、および生物学的システム内の翻訳後修飾に焦点を当てた、発現タンパク質の大規模な研究です。たとえば、トータルプロテオミクスの重要なサブセットであるホスホプロテオミクスは、タンパク質のリン酸化パターンと変化の研究です。本明細書に記載されている方法論は、研究動物モデル(すなわち、フェレットおよびマウス)から収集された血漿、脳、肺、脾臓、および肝臓組織におけるリン酸化パターンを含む全体的なタンパク質発現プロファイルの変化を解明するためのトータルプロテオミクスアプローチを示しています。この手法は、他の組織タイプだけでなく、タンパク質を含むほぼすべてのバイオサンプル(培養細胞など)にも適用できます。解剖後、目的の組織を急速凍結し、-80°Cで保存しました。 次に、乳鉢と乳棒を使用して液体窒素で組織を均質化し、タンパク質の完全性とリン酸化変化を維持しました。総タンパク質は、ユニバーサルヌクレアーゼおよびプロテアーゼ/ホスファターゼ阻害剤を含む溶解バッファーを使用して、組織ホモジネートから抽出されました。組織および同等の血漿から抽出したタンパク質は、市販の質量分析計サンプル前処理キットを使用して制御されたプロテアーゼ消化により、総ペプチドに変換されました。ペプチドは、超高速液体クロマトグラフィー/Orbitrap-tribridタンデム質量分析法を使用して直接分析されました。構成タンパク質の同一性は、プロテオミクスバイオインフォマティクスソフトウェアを使用して、種特異的なアミノ酸配列ライブラリーと照合されたペプチド質量スペクトルデータから再構築されました。これに続いて、分析には厳密なカットオフ基準が含まれ、特に信頼度の高いタンパク質同定のみを使用する必要があります。統計的に有意なプロテオミクスの違い (>2 倍の変化、p < 0.05) は、対照群と実験群の間で決定できます。

概要

プロテオミクスは、プロテオーム実験とデータ分析の組み合わせとして、タンパク質の同定と定量化に焦点を当て、組成、相互作用、翻訳前および翻訳後修飾(リン酸化など)、細胞内局在、および生理学的条件下での構造に基づいてタンパク質を特徴付けます1。発現プロテオミクスは、変化する生物学的条件下で異なるタンパク質の定量的比較を扱います2。また、細胞の増殖、分化、老化、細胞死メカニズムなどの主要な生物学的機能を直接制御する、複雑で相互接続された経路、ネットワーク、および分子システムのマップをプロファイリングする上でも非常に重要です。近年の実験技術の大幅な進歩に伴い、プロテオミクス法は、免疫組織化学や酵素結合免疫吸着アッセイなどの従来のアプローチから、液体クロマトグラフィーなどのハイスループット技術へと進化しました3,4。プロテオミクスに基づくアプローチは、固有の疾患表現型とサブタイプの決定、および治療薬の新しい標的相互作用の特定(ファーマコプロテオミクス)において勢いを増しています。たとえば、患者の層別化は、同種のグループを定義し、治療計画を導くためのゲノムアプローチに主に焦点を当ててきました。ただし、転写状態だけでは、その後の翻訳されたタンパク質の運命(安定性や修飾など)を予測することはできません。したがって、非ゲノムメカニズムは、疾患の発症、進行、重症度、および治療薬に対する耐性に大きく寄与します5,6,7。

タンパク質の発現と活性の定量的比較から大きな恩恵を受けている研究分野の 1 つは、神経変性疾患と外傷性脳損傷 (TBI) の分野におけるバイオマーカーの発見です。バイオマーカー発見の基礎は、早期発見と介入の潜在的な標的を促進する診断技術を開発することです。バイオインフォマティクスと組み合わせたLC/MS-MSベースの定量的プロテオミクスは、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)やユビキチンカルボキシル末端加水分解酵素アイソザイムL1(UCH-L1)などの主要なタンパク質バイオマーカーの発見に役立ち、重度の衝撃または浸透性TBIを伴います8,9。たとえば、軍人は、爆弾の爆発 (つまり、爆風性脳損傷) にさらされたために、任務中に外傷性脳損傷事故に頻繁に見舞われます。しかし、芽球誘発性軽度外傷性脳損傷によって引き起こされる神経学的欠損の根底にある病態生物学は不明のままです。したがって、芽球誘発性脳損傷の分子的および超微細構造のメカニズムを理解するには、特定のバイオマーカー代理物をより適切に同定する必要があります。プロテオミクスの変化を観察することで、研究では、核分裂融合ダイナミクスの障害、酸化的リン酸化の減少、呼吸関連酵素活性の補償など、脳内の芽球誘発性酸化ストレスのメカニズムがミトコンドリア機能障害に関連している可能性があることが実証されています10。アセチル化、ニトロシル化、脱アミノ化、リン酸化などの翻訳後修飾の芽球誘発性調節不全の初期病因に関する洞察は、軸索損傷、炎症、血液脳関門の破壊に関与するタンパク質機能に対するその影響のさらなる特徴付けを提供することもできます11,12.システム生物学のアプローチの進歩に伴い、げっ歯類やフェレットなどのさまざまな動物種の脳および末梢組織からの総プロテオーム情報をマッピングすることが、爆風損傷研究における重要な手順となっています。

この記事では、発現プロテオミクスの定量的側面を評価するための方法論ワークフローと、生理学的現象と病理学的状態の両方をモニタリングするために広く使用されている組織または血漿から始まるその翻訳後修飾に焦点を当てます。以下の方法論を利用することで、サンプル前処理とデータ取得の一貫性と信頼性が可能になります。この標準化された方法論を使用することにより、比較を行い、組織タイプ全体で保存されたプロテオミクスパターンと特定の組織に固有のリン酸化パターンを決定することができます。これに加えて、いくつかの前臨床動物モデルとヒト臨床サンプルにわたる分析を行い、バイオマーカーとして役立つ可能性のある保存されたリン酸化パターンを取得し、薬物治療レジメンを調整することができます。

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プロトコル

研究は、IACUCが承認した動物使用プロトコルに基づいて、公衆衛生サービス動物福祉保証を受けたAAALACインターナショナル認定施設で、動物福祉法および実験動物に関連するその他の連邦法令および規制に準拠して実施されました。この手順に必要なすべての消耗品は、 材料表 に記載されています。手順は 7 つのコンポーネントに細分されます。

注意。液体窒素を使用して組織を均質化する場合は、適切な安全プロトコルに従っていることを確認してください。研究室の職員は、凍結組織の均質化中に、冷凍手袋、冷凍エプロン、サージカルフェイスマスク、フェイスシールドを着用しました。この均質化技術は、乳鉢と乳棒のサイズを適宜調整するだけで、骨のような非常に硬い物質を含むあらゆる種類の組織に利用できます。ワークベンチの初期セットアップについては 、図 1A を参照してください。マウスとフェレットの組織を均質化するときに使用されるサイズについては、 材料表 を参照してください。

1.乳鉢と乳棒による組織の極低温粉砕

  1. 空の収集チューブの重さを取り、記録します。収集チューブに入っている間、分析天びんを使用して組織の重量を量り、実験ノートに重量を記録します。空のチューブの重量を組織から差し引いたものとチューブの重量を差し引いて、使用する組織のmgを取得します。
    注:プロテオミクス研究のために評価された組織には、脳、肺、肝臓、脾臓が含まれます。組織全体を乳鉢と乳棒を使用して極低温で粉砕して粉末状にしました。
  2. 液体窒素をクライオポッドに注ぎますが、半分未満で満たされていることを確認してください。
  3. サンプルと空のオートクレーブ滅菌済みの1.5 mLマイクロ遠心チューブが入ったチューブを、クライオポッドにあるチューブラックに移します。これにより、モルタルと乳棒を冷却しながらサンプルが凍結したままになり、均質化された組織を空の 1.5 mL 微量遠心チューブに移すときにサンプルが解凍されるのを防ぎます。
  4. 使用前に、乳鉢と乳棒に液体窒素を注ぎ、これらの器具を冷却します。乳鉢と乳棒はクライオポッドの外側にあります(図1A、B)。
  5. 液体窒素を含む冷却されたモルタルに組織を移します(図1B)。
  6. 乳棒を使用して凍結組織に繰り返し圧力をかけ、組織が微粉末に粉砕されるまで、乳棒を組織に対して回転させて粉砕する動作を行います(図1C)。
    1. モルタルからサンプルがこぼれる危険性がある過度の力が加えられないようにしてください。乳棒をしっかりとコントロールしてください。
    2. 大きな組織を均質化しながらモルタルに液体窒素を追加し、粉砕中にサンプルが解凍される可能性を減らします。
    3. ティッシュを粉砕するときは、解凍していないか確認してください。解凍する場合は、モルタルに追加の液体窒素を入れます。
  7. 金属ヘラの端を液体窒素に浸して冷やします。これにより、均質化された組織を 1.5 mL チューブに簡単に移すことができます。これにより、移送中に組織が解凍してへらにくっつくのを防ぎます。
  8. 組織を微粉末に均質化し、金属スパチュラを冷却したら、均質化された組織粉末を新しい1.5 mLチューブに慎重に移します。
    1. 完了するアッセイの数に応じて、サンプルをアリコートに分割します。
      注:たとえば、この研究のサンプルに対して4つのアッセイを完了する予定であったため、均質化された組織を4本の1.5 mLチューブに均等に等分しました。
    2. 余分に均質化された組織は、オートクレーブ滅菌された5 mLスナップトップコレクションチューブに保管します。
  9. 分注された組織は、将来の分析まで-80°Cの冷凍庫に保管し、空気とタンパク質の軽い酸化を最小限に抑えるために1年以内に現実的に使用してください。
  10. 空の収集チューブの重量を量ります。
  11. 最初の測定値(収集チューブとサンプル)から空の収集チューブの重量を差し引いて、組織サンプルの重量を求めます。

2. タンパク質単離のための組織溶解

  1. ドライアイスをアイスパンの容器にすくい取ります。
  2. ドライアイスにチューブラックを置き、冷まします。
  3. 均質化された組織サンプルを-80°Cの冷凍庫から取り出し、冷やしたチューブラックに入れます。これにより、計量プロセス中にタンパク質の分解やリン酸化の変化を引き起こす可能性のあるサンプルの解凍が防止されます。
    1. サンプルの入った1.5 mLチューブがドライアイスでチューブラック上で凍結したままであることを確認します。
  4. 新しい50 mLの標準チューブをドライアイスに入れます。
  5. 50 mLの標準チューブからキャップを取り外し、使い捨てのプラスチックスパチュラを50 mLの標準チューブに入れて冷たく保ちます。これにより、均質化チューブへの移送中にサンプルがスパチュラに付着するのを防ぎます。
  6. 組織溶解およびタンパク質単離には、5つの2.8 mmセラミックビーズ(このプロトコルでは均質化チューブと呼ばれる)を含む2 mLチューブを使用します。
  7. キャップと均質化チューブの側面に、永久インクマーキングペンを使用してサンプルIDでラベルを付けます。
  8. ラベルを貼った均質化チューブをドライアイスの中にあるチューブラックに置き、チューブを冷たく保ち、サンプルの解凍を防ぎます。
  9. 1本の均質化チューブを分析スケールに置き、スケールを風袋引きします。
  10. 均質化チューブをドライアイスの上のチューブラックに戻します。
  11. ビーズが入っている均質化チューブから蓋を外し、冷却されたプラスチックヘラの1つを使用して、5 mgから10 mgの粉末組織サンプルをそれぞれの均質化チューブに移します。
  12. 蓋を均質化チューブに戻します。
  13. 分析天びんで均質化チューブの重量を量り、均質化チューブ内のサンプル量を記録します。
    1. この重量を使用して、効果的な全タンパク質抽出に必要な溶解バッファーの量を決定します。
  14. 重量が記録されたら、サンプルの入った均質化チューブをドライアイスの上のチューブラックに戻して冷たく保ちます。
  15. 使用済みのプラスチックヘラは廃棄してください。
  16. 相互汚染を防ぐために、移送および計量するサンプルごとに、新しい清潔なプラスチック製スパチュラを使用してください。すべてのサンプルについて、手順2.9から2.15を繰り返します。
  17. すべてのサンプルを個々のホモジナイジングチューブに移した後、必要なタンパク質溶解マスターミックスの量を計算します。
    1. 処理する必要があるサンプルの数と各粉末サンプルの重量に基づいて計算される、必要な量のタンパク質溶解マスターミックスを調製します。各チューブに組織5mgあたり100 μLのタンパク質溶解マスターミックスを加えます。
    2. タンパク質溶解マスターミックスを製造するための試薬量については、会社のガイドラインを参照してください( 材料表を参照)。
  18. 均質化された粉末サンプルを含む均質化チューブを4°Cのコールドブロックに入れます。均質化チューブはドライアイスの上にとどまることができなくなります。均質化チューブをコールドブロックに置くと、溶解液の凍結を防ぐことができます。
  19. ホモジナイジングチューブから蓋を外し、適切な容量のピペットを使用して、必要なプロテイン溶解マスターミックスの計算量をそれぞれのホモジナイジングチューブに移します。
    1. 蓋を均質化チューブに戻し、蓋がしっかりと閉まるまで回転させます。
  20. サンプルチューブをホモジナイザーに入れ、ホモジナイズのために4°Cで軟部組織プログラム(速度4500 RPM、サイクルあたり2 x 30秒、30秒の一時停止)にセットします。
  21. 均質化サイクルが完了したら、チューブを装置から取り外し、4°Cのコールドブロックに戻します。
    1. サンプルチューブを目視検査します。粉末サンプルがまだ見えていないことを確認してください。タンパク質溶解マスターミックス全体でサンプルがまだ視覚化されている場合は、装置で再度組織溶解を完了します。
    2. 使用する組織の種類に合わせて設定を最適化します。たとえば、線維性臓器(心臓など)に由来する粉末組織には、追加のサイクルまたはより高いRPMが必要になる場合があります。
  22. 均質化チューブを遠心分離機に移します。遠心分離機で次の設定を入力します:4°Cで10分間16,000 g 、遠心分離機の [開始 ]を押します。
  23. 遠心分離が完了したら、ホモジナイジングチューブを4°Cのコールドブロックに慎重に移します。
  24. 新しい1.5 mLチューブの蓋と側面にサンプルIDおよびその他の関連情報を記載してラベルを付けます。標識したら、これらの1.5 mLチューブを4°Cのコールドブロックに入れます。
    注:チューブには、少なくとも次のものがラベル付けされていました:動物ID、研究時点、動物タイプ、および組織タイプ。
  25. 対応するタンパク質ライセートを均質化チューブから、4°Cのコールドブロックに保持されたそれぞれの標識付き1.5 mLチューブに移します。
  26. さらなる分析のためにサンプルを-80°Cで保存します。ここは安全な停止点です。

3. 総タンパク質の定量

  1. -80°Cの冷凍庫からサンプルを取り出し、アイスバケツの湿った氷の上でサンプルを解凍します。
  2. 解凍したら、タンパク質定量キットからすべてのサンプルと標準物質を少なくとも3秒間ボルテックスします。
  3. 標準、サンプル、および適切なブランクの各反復を、概略図レイアウトに基づいて96ウェルマイクロタイタープレートに10 μLを追加します(図2A)。
    注:各組織サンプルについて、タンパク質ライセートを好ましくはリン酸緩衝生理食塩水に1:100希釈して、タンパク質アッセイ分析で使用します。回路図のレイアウトは、タンパク質アッセイで使用されるサンプルの数に応じて変更できます。サンプル、標準、および適切なブランクは、タンパク質濃度の精度を評価するために 3 回ずつ 96 ウェルのマイクロタイタープレートにロードされますが、多くのサンプルをプレートに収める必要がある場合は、重複しても許容されます。
    1. 開始組織の量が少ない(つまり、5 mg未満)サンプルの場合、タンパク質アッセイに1回の複製または複製のみを使用して、その後のタンパク質消化に利用できるタンパク質ライセートの量を最大化します。
    2. 正確なピペッティングと校正済みのピペットが使用されていることを確認してください。
  4. プロテインアッセイ試薬ボトルを数回反転させてよく混合し、10 mLの試薬リザーバーに注ぎます。
  5. 最大容量200 μLのマルチチャンネルピペットを使用して、150 μLのタンパク質アッセイ試薬をカラム1に加えます。
  6. 数回上下にピペットで移動して、タンパク質アッセイ試薬をウェルにすでに入っている10 μLの内容物と混合し、ウェル内の沈殿物を減らします。
  7. ピペットチップを廃棄し、最大容量200 μLのマルチチャンネルピペットに新しいチップを置きます。
  8. タンパク質アッセイ試薬が96ウェルプレート全体に添加されるまで、ステップ3.5〜3.7を繰り返します。
    1. 相互汚染を防ぐために、ウェルの各カラムに新しいピペットチップを使用してください。
    2. 少なくとも1つのウェルが空のままにして、タンパク質定量のブランク吸光度値として使用する試薬やサンプルを追加していないことを確認してください。
  9. タンパク質アッセイ試薬が必要なすべてのウェルに添加されたら、96ウェルプレートをアルミホイルプレートシールで覆います。
  10. 96ウェルプレートをボルテックス装置上で中速で1分間ボルテックスし、室温(RT)で5分間インキュベートしてからプレートを読み取ります。
  11. 96ウェルプレートとアルミホイルシールを点検します。試薬がアルミホイルシールに付着したままの場合は、適切な天秤で遠心分離機内に置いてください。
    1. クイックスピンを約 200gになるまで押し続けます。
    2. 96ウェルプレートを取り出し、アルミホイルシールを目視検査して、ホイルに液体が残っていないことを確認します。
  12. アルミホイルシールをゆっくりと取り外し、透明な蓋を96ウェルプレートに戻します(図2B)。
  13. 比色反応を5分間発生させた後、660 nmの分光光度計で96ウェルプレートを読み取ります。
    注:UV/可視分光光度計を使用した吸光度測定値は、室温で測定されます。660 nm タンパク質アッセイは、酸性条件下での独自の色素金属複合体とタンパク質の結合に基づいており、660 nm で測定される色素の吸収最大値にシフトを引き起こします。
  14. 既知の標準物質の吸光度測定値を使用して、グラフ作成ソフトウェア(図2C-E)を使用して標準曲線を作成し、さらにすべてのサンプルのタンパク質濃度を計算するために適用します。

4.タンパク質の消化

注意。以下のプロトコルで使用される有害化学物質を扱う場合は、適切な安全プロトコルに従っていることを確認してください。実験室の職員は個人用保護具 (PPE) を着用し、化学ヒューム フードでこれらの手順を完了しました。これらの化学物質を使用する前に、すべての安全データシートを確認してください。

  1. 新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブのセットに、チューブの蓋と側面にサンプルIDを永久インクでラベル付けします。その他の関連情報を含めます。
    1. 標準曲線式、サンプル吸光度測定値、および希釈係数に基づいて、各サンプルのタンパク質濃度をマイクログラム/マイクロリットル (μg/μL) で計算します。この値を使用して、100 μgのタンパク質を含むサンプルライセートの必要量を計算します(図2C-E)。この計算された量のサンプルライセートを1.5 mLの微量遠心チューブに移します。
  2. 溶解バッファーで最終容量を100 μLに構成します。これは、消化プロトコルに必要な開始量です。
    注:タンパク質サンプルと溶解バッファーの最終容量は100 μLに等しい必要があります。
  3. 以前に発表された文献によると、消化には1.5μLの血漿を使用し、これは約100μgのタンパク質に相当します。
  4. 50 μLの還元液(10 mMジチオスレイトール)を各1.5 mL微量遠心チューブに加え、上部を閉じて、3秒間短時間ボルテックスします。次に、50 μLのアルキル化溶液(30 mMヨードアセトアミド)を各サンプルに加え、上部を閉じて3秒間ボルテックスします。
  5. ヒートブロックを使用してサンプルを95°Cで11分間インキュベートし、タンパク質サンプルをそれぞれ還元およびアルキル化します。これにより、すべてのジスルフィド架橋が切断され、アセトアミド基で覆われ、それらの再形成が防止され、タンパク質が完全に折りたたまれていない状態に変性し、ペプチド消化部位の露出が最大化されます。
  6. インキュベーション後、ヒートブロックからサンプルを取り出し、RTまで冷却します。
  7. サンプルが冷えるのを待っている間に、凍結乾燥したトリプシン/Lys-Cプロテアーゼミックス(1:1の比率、各50 μg)を酵素再構成溶液で再構成し、515 μLの液体を固体試薬1バイアル、つまりそれぞれ0.1 μg/μLに加えます。トリプシンは重度の刺激物およびアレルゲンになる可能性があるため、プロテアーゼ溶液との直接の皮膚接触およびその後のすべてのステップを避けてください。
  8. サンプルをRTまで冷却したら、50 μLの再構成トリプシン/Lys-Cプロテアーゼミックス(各2.5 μg)を還元およびアルキル化タンパク質サンプル溶液に加え、短時間ボルテックスします。
  9. サーモミキサーで37°Cでインキュベートし、1000rpmに3時間設定してタンパク質サンプルを消化します。
    注:Lys-Cプロテアーゼは、折り畳みまたはアミノ酸配列(Lys-Pro結合など)により、トリプシンによる消化に抵抗性のある部位の切断を助けるために含まれています。これにより、各タンパク質が適度に小さいサイズと総電荷を持つ多数の既知のペプチドに還元されるだけでなく、同じ消化条件に厳密に従うと再現性も高くなります。消化中の3時間のインキュベーション時間は、すべてのタンパク質の完全な切断を確実にするために推奨される最小時間です。
  10. 3時間のインキュベーション後、指の火傷を避けるために、鉗子を使用してサーモミキサーから取り出します。
  11. 50 μLの消化停止溶液(6%トリフルオロ酢酸またはギ酸水溶液)をサンプルに加え、短時間ボルテックスします。
    注:2つのプロテアーゼは中性pH 7〜8で最大の活性を有するため、これは反応を阻害します。
  12. サンプルは-80°Cの冷凍庫に保管すると、残留プロテアーゼ活性も停止します。ここは安全な停止点です。

5. ペプチドのクリーンアップ、乾燥、および再懸濁

注:この手順は主に、LC/MS-MS装置に容易に損傷を与える可能性のある消化試薬、特に不揮発性塩を除去し、生成されたペプチドを単離して濃縮するのに役立ちます。ペプチドのクリーンアップは、キット付属の脱塩スピンカラムを使用して行われ、サイズ排除(ゲルろ過)樹脂があらかじめ充填されており、最初にペプチドを捕捉し、その後、特に塩を洗い流すことができます。キット試薬は、有毒な有機溶媒を含むため、化学ヒュームフード内のスピンカラムに完全に移します。

注意。以下のプロトコルの有害化学物質を扱う際には、PPEの着用や有害廃棄物封じ込め規制などの適切な安全手順が守られていることを確認してください。これらの化学物質を扱う前に、化学ヒュームフードでこれらの手順を完了し、すべての安全データシートを確認してください。

  1. -80°Cの冷凍庫からサンプルを取り出し、サンプルをRTにかけます。
  2. ペプチドクリーンアップカラムの下部にある白いキャップを取り外し、緑色のトップキャップを緩めて、2 mLのコレクションチューブに入れます。
  3. これらを遠心分離機に入れ、蓋を閉めてスタートを押し、3000 g で2分間遠心分離して、出荷前のコンディショニング液をすべて除去します。
  4. フロースルーを有害廃棄物容器に廃棄し、ペプチドクリーンアップカラムを新しい2 mL収集チューブに入れます。
  5. ペプチドクリーンアップカラムの緑色の蓋に、透過性インクマーキングペンを使用してサンプルIDでラベルを付けます。
  6. 200 μLピペット(例えば、150 μLを2回)を使用して、容量約300 μLのタンパク質消化調製物を乾燥ペプチドクリーンアップカラムに静かに移します。
    1. スピンカラムの樹脂の上部に気泡が観察されないことを確認します。気泡が観察された場合は、カラムを軽くたたくか、清潔な10 μLピペットチップを使用して気泡を分散させて気泡を取り除きます。
      注:閉じ込められた気泡は、サンプルの樹脂へのスムーズな移行を妨げる可能性があり、したがって、ペプチドのクリーンアップと収率の効率に悪影響を及ぼします。
  7. これらを遠心分離機に入れ、蓋を閉め、 開始 を押して1,500 g で2分間遠心分離します。
  8. フロースルーを有害廃棄物容器に廃棄し、ペプチドクリーンアップカラムを新しい2 mL収集チューブに入れます。
  9. 再び200 μLピペットを使用して、300 μLの洗浄液A(水、0.1%トリフルオロ酢酸/ TFA)をカラム樹脂の上に加えます。
    1. スピンカラムの樹脂の上部に気泡が観察されないことを確認します。気泡が観察された場合は、カラムを軽くたたいて気泡を取り除くか、清潔な10 μLピペットチップを使用して気泡を分散させます。
  10. これらを遠心分離機に入れ、蓋を閉めて スタートを押し、1,500 g で2分間遠心分離します。
  11. フロースルーを有害廃棄物容器に廃棄し、ペプチドクリーンアップカラムを新しい2 mL収集チューブに入れます。
  12. カラム樹脂の上に 300 μL の洗浄液 B(5% メタノール、0.1% TFA)を、再び 200 μL ピペットを使用して加えます。
    1. スピンカラムの樹脂の上部に気泡が観察されないことを確認します。気泡が観察された場合は、カラムを軽くたたいて気泡を取り除くか、清潔な10 μLピペットチップを使用して気泡を分散させます。
  13. これらを遠心分離機に入れ、蓋を閉め、 開始 を押して1,500 g で2分間遠心分離します。
  14. フロースルーを有害廃棄物容器に廃棄し、ペプチドクリーンアップカラムを新しい2 mL収集チューブに入れます。
  15. 手順5.12〜5.14をもう一度繰り返して、カラムを洗浄液Bで2回洗浄します。
  16. ペプチドクリーンアップカラムを新しい2 mLマイクロ遠心チューブに移します。
    1. このステップで使用する2 mLマイクロ遠心チューブが、キット付属の低タンパク質結合コレクションチューブであることを確認してください。
    2. 低タンパク質結合の収集チューブの利用可能な量を節約するには、前の洗浄ステップに標準的な実験室のものを使用してください。
  17. カラム樹脂の上に300 μLの溶出液(50%アセトニトリル、0.1%TFA)を、再び200 μLピペットを使用して加えます。
    1. スピンカラムの樹脂の上部に気泡が観察されないことを確認します。気泡が観察された場合は、カラムを軽くたたいて気泡を取り除くか、清潔な10 μLピペットチップを使用して気泡を分散させます。
  18. これらを遠心分離機に入れ、蓋を閉めて [スタート]を押し、1,500 g で3分間遠心分離して、新しい低タンパク質結合2 mL収集チューブにきれいなペプチドサンプルを収集します。
    1. 必要に応じて、200 μLピペットを使用して、溶出したクリーンペプチド溶液125 μL(約半分)を1 mLガラスバイアルに移し、-80°Cで保存します。
      注:このアリコートは、市販のキットで行われるペプチドのタンデム質量タグ(TMT)標識などの追加分析に後で使用でき、サンプル、特に独立して調製されたセット全体でより正確な定量を行うことができます。
  19. 残りのサンプル(約175 μL)を、乾燥と再構成を進める準備ができるまで、低タンパク質結合2 mLチューブに-30°Cで保存します。ここは安全な停止点です。
  20. サンプルを乾燥させるには、ペプチドサンプルを-30°CからRTまで解凍します。ペプチドのクリーンアップ直後に乾燥と再構成を進める場合は、このステップを無視してください。
  21. 2 mLの微量遠心チューブを開き、真空遠心濃縮器に入れます。
    1. 不均一な数のサンプルが同時に実行されている場合は、真空遠心分離機濃縮器のバランスをとってください。
    2. 真空遠心分離機濃縮機の蓋を閉め、 スタートを押します。
    3. 加熱せずに、真空遠心分離機濃縮器でサンプルを3時間実行させます。
    4. チューブを定期的に検査して、LC/MS-MS装置の分離カラムへのペプチドの結合を妨げる可能性があるため、内部に液体が残っていないことを確認してください。
    5. それでも液体が観察される場合は、さらに時間サンプルを回転させ続けます。
    6. 30分から1時間かけて、チューブ内に液体が残っているかどうかを確認します。
      注:ペプチドは真空条件下にあるため、このプロセス中は非常に安定しており、真空遠心分離機濃縮器の操作のみによって発生する短期間の乾燥または適度な暖かさによって劣化することはありません。
  22. 乾燥したら、すぐにサンプルを50 μLの0.1%ギ酸のMSグレードの水中に再懸濁します(たとえば、5 mLの水に5 μLの100%ギ酸)。
    1. 200 μLピペットを使用して、乾燥ペプチドサンプルを含む2 mL低タンパク質結合チューブの底に50 μLの0.1%ギ酸を加えます。
  23. キャップを閉じてから、15秒間渦巻きます。
  24. 200 μLピペットを使用して、再構成したサンプルをそれぞれの1 mLガラスバイアルに移します。
  25. 再構成したサンプルの入ったガラスバイアルを-30°Cで保管し、できるだけ早くLC-MS/MSベースのアプローチで分析してください。
    注:凍結ペプチドサンプルは、短期保存の場合は-30°C、長期保存の場合は-80°Cで安定しています。

6. UHPLC/MS-MS装置によるペプチドサンプルのデータ取得

注意。超高速液体クロマトグラフィー/Orbitrap tribrid タンデム質量分析計システムを使用する場合は、適切な安全プロトコルに従っていることを確認してください。実験室の職員はPPEを着用し、UHPLC / MS-MSメーカーが提供する正式な実践的な機器トレーニングを受けました。主な注意点は、UHPLC の酸性および有機溶媒移動相と MS の高電圧イオン化源の適切な取り扱いです。

  1. 超高速液体クロマトグラフィー(UHPLC)システムを使用してペプチド分離を実行します。LCカラムは、エレクトロスプレー可能なC18逆相急速分離(RSLC)設計で、寸法は2 μm、100 Å、50 μm x 15 cmで、同じ材料のガードプレカラムの後にインラインで配置されます。
  2. 次の UHPLC 移動相を使用します: 0.1% ギ酸水溶液(溶媒 A)、0.1% ギ酸水溶液(溶媒 B)、および 0.1% ギ酸 90% 水溶液および 10% メタノール溶液 (溶媒 C)。
    注:移動相の調製に使用されるすべての溶媒およびギ酸は、LC/MSグレードの認定を受けており、必要な場合にのみ製造されています。UHPLCは、ポンプの前にろ過および脱気装置を備えているため、移動相を手動でろ過して空気をパージすることはありません。
  3. 血漿および組織サンプル用に調製された総ペプチドのプログラム注入を、最初に3 μLに設定し、これは使用タンパク質の開始量によって決定される~3 μgのペプチド材料に相当します。
    注:これにより、タンパク質を最大限同定するための理想的なMSシグナル強度が得られるはずです。注入量は、信号出力をさらに高めるために最大15 μLまで増やしたり、過負荷が明らかな場合は1 μLまで減らすことができます。
  4. カラムとオートサンプラーをそれぞれ 40 °C と 10 °C に維持します。
  5. プロテオミクス取り込みの溶媒流量を、UHPLC ナノポンプを使用して一定の 0.3 μL/min に設定し、水(A)からアセトニトリル(B)の移動相を線形分離勾配で設定します。
  6. UHPLC ローディングポンプを最初に 5 μL/分に設定し、水とメタノールの移動相(C)を使用して、注入シリンジとサンプルループ(容量 20 μL)の洗浄を実行します。
  7. 合計 80 分以上のサンプル分離中に、LC グラジエント(線形曲線)を次のように設定します。初期 - 5% B;0-60分-32%B;60-61分-95%B;61-65分-95%B;65-66分-2%B;66-80分-2%B。同様に、ローディングポンプを一定の100%のAで運転しますが、流量を次のように直線的に調整します:初期-5μL /分;0-5分 - 1 μL/分;5-61分 - 5 μL/分;および61〜80分〜5μL/分(図3A)。
  8. 未知のペプチドサンプルを連続重複実行として注入します。
  9. キャリーオーバーを防ぐために、次のように、切り捨てられたLC勾配(線形曲線)を使用して、サンプル間で水中の0.1%ギ酸を少なくとも2回連続して注入します。初期 - 5%B;0-23分-32%B;23-24分-95%B;24-30分-95%B;30-31分-2%B;31〜35分-2%B(図3B)。
    1. ローディングポンプのLC勾配の設定が変更されていないことを確認します。
    2. 肝臓(胆汁酸など)などの高レベルの内因性汚染物質を含むペプチドサンプルの場合は、3〜5サンプルごとに、および実行の最後に3番目のブランクを含めて、LCカラムの洗浄に役立てます。これは、アセトニトリル、イソプロパノール、メタノール、および水をそれぞれ25%含む1〜2μLの溶液を注入することで構成されます。
    3. あるいは、または上記のステップと組み合わせて、次のようにシステムウォッシュアウトとして合計35分間にわたって変化率の拡張LCグラジエント(すなわち、シーソー)を実行します。初期 - 2%B;0-3分-2%B;3〜4分-95%B;4-10分-95%B;10-11分-2%B;11〜15分-2%B;15-16分-95%B;16-20分-95%B;20-21分-2%B;21-25分-2%B;25-26分-95%B;26-30分-95%B;30-31分-2%B;および31〜35分-2%B(図3C)。
  10. Orbitrap とイオントラップの組み合わせタンデム四重極質量分析計(MS-MS)システムを使用して、ペプチド、つまり対応する分子量を LC カラムで分離し、LC カラムから溶出させるときに検出します。
    1. サンプルランを実行する前に、LC カラムを、デバイスの左上前隅にある MS 装置の交換可能なナノスプレーイオン化(NSI)ソースの面に直接差し込みます。
      注:これにより、LC移動相溶媒の帯電微小液滴内に懸濁したペプチドを検出器のイオントランスファーチューブの入口に送達するLCカラムの内蔵エレクトロスプレーニードルが露出します。
    2. また、エレクトロスプレーの揮発効率を向上させるには、NSIソースの内蔵加熱ユニットをオンにして40°Cに設定してください。
  11. また、サンプルを実行する前に、圧縮窒素とヘリウムガスが MS 装置に十分に外部から入力されていることを確認してください。これは、各ガスの超高純度グレードの300サイズのスチールシリンダータンクを使用して、レギュレーターゲージをそれぞれ60psiと40psiの静流圧力に設定しています。
  12. MS 装置が窒素ガス入力の不安定性に関する警告を発する場合は、圧力を最大 100 psi まで上げます。タンクが少なくとも10〜20%満杯であることを確認してください(これは~250〜500 psiのトップバルブゲージの読み取り値です)。そうでない場合は、新しいものに交換してください。全容量の10%を下回ると、MS装置に汚染物質が引き込まれ、ガスタンクの底に沈殿するリスクがあります。
  13. ペプチドとその翻訳後修飾を最適に検出するように設計された制御ソフトウェア提供のテンプレートを使用して、質量分析計法を事前に作成し(図3D-H)、次の標準条件を入力します。
    1. 合計検出期間を80分に設定します。
    2. 一般検出モードをペプチドに設定します。
    3. NSIソースをポジティブモード(つまり、ペプチドイオンの電荷)に設定します。
    4. ナノスプレー針電圧を2000Vに設定し、 静止状態に保ちます。
    5. 窒素ガスの入力をNSIに設定し、検出器を静的に設定します。
    6. イオントランスファーチューブの温度を275°Cに設定します。
    7. ペプチド全体の質量(すなわち、親イオン;MS1)を呼び出して、スキャン範囲を350-2000 m / zに、RFレンズを30%に、最大注入時間を自動に、orbitrap質量分析計を120,000分解能に設定します。
      注:装置の代替イオントラップ機能は、オルビトラップと比較してこのタイプの分子をモニタリングするための感度が低いため、ここではペプチド質量のスクリーニングには使用されません。
    8. イオンフィルターを設定して、2〜7の範囲で複数の電荷状態を持つペプチドを区別します。これにより、機器はデータを記録しながら、分子の本質的に検出された電荷比(m/z)の質量を正確な質量に自動的に変換することができます。同様に、単一の電荷状態(m / z = 1)のみのペプチドは、その正確な質量を得るために変換係数を必要としません。
    9. イオンの 動的排除ゲート を60秒で1パス、±10 ppmの質量許容範囲に設定し、天然同位体原子が存在する分子をドロップアウトします( 例:14°C)。
    10. ペプチドに対して生成された同一性確認フラグメントの質量を検出します(すなわち、娘イオン;MS2)をデータ 依存の集録(DDAモード)に設定します。
    11. 質量変動許容範囲ウィンドウの設定を m/z = 1.6 にして、四重極単離によりペプチド全体(親イオン)を捕捉します。
    12. 電子衝撃モードをHCD(つまり、窒素とヘリウムガスを電子移動剤として使用した高エネルギーの衝突解離)、衝突エネルギーを30%に、スキャン範囲を自動に、最大注入時間を自動に、Orbitrap質量分析計を30,000分解能に設定して、捕捉されたペプチドのフラグメンテーションを実行します。
    13. 信号のピーク形状を重心形式に設定して、最終データ(MS1およびMS2イオン)を取得します。
  14. 検出されたペプチドの正確な質量測定は、通常、各サンプルバッチ実行の前に定期的に装置を校正することにより、以下に説明するように維持します。
    1. 制御ソフトウェアを使用して、MS装置をイオン源の電源オフ状態にし、NSIソースをデバイスの代替内部加熱エレクトロスプレーイオン化(HESI)ソースに切り替えます。これは、メタボロミクスや薬物動態実験など、LCポンプに非常に大きなサンプル注入量とそれに対応する高流量(1-2500 μL/min)を必要とするアプリケーションに使用されるソースです。
    2. 制御ソフトウェアで 完全な校正チェック オプションを選択します。
    3. テフロンコーティングされたプランジャーとステンレス鋼の鈍い針を備えた500 μLのガラスシリンジに市販のMS標準溶液を充填し、PTFEキャピラリーチューブラインをHSEIソースに接続します(電源オフ時)。
      注:ここで使用される標準物質には、m / z = 50〜2800の質量範囲にまたがり、幅広い可能な化学結合タイプ、特にペプチドに関連する化学結合タイプ(アミド基など)をカバーする天然分子と合成分子(カフェインなど)の混合物が含まれています。
    4. シリンジポンプを使用する場合と同様に、3〜5 μL/minの速度を使用して、MS標準物質のHSEIソースへの一定の注入を開始します(電源を入れた状態で)。制御ソフトウェアのライブビューウィンドウに標準ピークの安定したパターンが記録されたら、自動キャリブレーションチェックをアクティブにします。
      注:標準物質の質量測定の感度と精度に問題が見つからない場合、通常、完全な校正が成功するには<40分かかります。同様に、装置がチェックされたすべての MS ハードウェアパラメータに合格した場合にのみ、サンプルの実行に対して信頼できると見なされます。
    5. NSIソースとLCカラムを再セットアップし、ヒト[Glu 1]-フィブリノペプチドB(Glu-Fib)の標準溶液を1〜10 ng(1、2、6、10 ngなど)の総注入量で実行して、キャリブレーションの成功を確認します。未知のサンプルには、上記と同じLC分離およびMS検出法を使用してください。
    6. 適切なLC保持時間(~20分)、MS1およびMS2イオンの存在(m/z = 1285.54、813.39、785.84、445.12、333.19、および175.12)、および注入量に伴うピーク面積の増加の直線性について、Glu-Fib標準試料を確認します。
    7. 次に、制御およびデータキャプチャソフトウェアを使用して、サンプルタイプ、ファイル名、サンプルID、データパス、LC/MS装置メソッド、バイアル位置、および注入量を入力するための列を含む未知のペプチドおよびブランクサンプルを実行するためのシーケンステーブルを生成します(図3D-E)。
    8. 結果のMSデータファイル(拡張子:RAW、各500〜800 GB)を、装置コンピュータのハードドライブの指定されたパスフォルダに保存します。次に、これらのファイルを、後述するようにバイオインフォマティクスソフトウェアを駆動するのに十分な強力なワークステーションコンピュータに転送し、非常に広範で複雑なペプチド質量スペクトルデータ(すなわち、MS1およびMS2シグナル)を対応する総タンパク質組成プロファイルに変換します。

7. 生のMSデータを代表的なトータルプロテオーム結果に変換する

注:ペプチドサンプルでキャプチャされた生のMSデータは、バイオインフォマティクスソフトウェアを使用して、総タンパク質組成プロファイル(プロテオーム)に処理されます。簡単に言うと、バイオインフォマティクスソフトウェアは、タンパク質のアミノ酸配列を広範かつ独自にカバーすることで、生のMSデータをWebベースの種特異的プロテオームリファレンスライブラリーにある既知のペプチドMS1およびMS2スペクトルと照合することにより、サンプル中の元のタンパク質を再構築します。同定された各タンパク質の相対存在量は、一致した固有のペプチドのMS1シグナル強度を使用してプログラムによって決定されます。測定された存在量は、サンプル間で確実に比較できますが、それは、同じ調製バッチ内で、同一のLCおよびMS設定を使用して実行されている場合に限ります。それ以外の場合は、各サンプル内のペプチドの選択的TMT標識など、内部標準/レポーターイオン回収率に基づく前述の絶対定量手法を採用する必要があります。

  1. ワークステーションコンピュータのハードドライブに、Webベースのライブラリからプロテオームリファレンスファイルをダウンロードします。
    1. これは、UniprotのWebサイトにあるデータベースを使用して、関心のあるサンプル種(フェレット/ Mustela furoなど)を見つけます。これは FASTA ファイルと呼ばれます。 プロテオーム 検索ツールと テーブル ビューを使用して、プロテオーム参照ファイルを見つけてダウンロードします。
    2. 生成されるタンパク質同定の可能な数を最大化するには、FASTAファイルを作成するときに、Uniprotデータベースへの委員会の査読済み(Swiss-Prot)エントリと未レビュー(TrEMBL)の両方のエントリを選択します。同様に、タンパク質についてレビューされたすべてのアイソフォームを含めるオプションを選択します。
  2. バイオインフォマティクスソフトウェア(Proteome Discoverer)を スタートページ タブで開き、 管理 タブを選択します。
  3. [ FASTAファイルの維持] サブタブに移動し、実験用に生成された上記の種固有のFASTAファイルをプログラムにダウンロードします。
  4. [ スタートページ ]タブに戻り、[ 新しいスタディ/解析]をクリックし、ダイアログボックスの[ スタディ名 ]フィールドにスタディ名を入力し、[ スタディルートディレクトリ ]フィールドにスタディを保存するためのファイルフォルダを選択します。
  5. [ 処理ワークフロー] フィールドと [コンセンサス ワークフロー ] フィールドは後で選択されるため、今のところ空白のままにしておきます。
  6. [ OK ]をクリックして保存し、ダイアログ ボックスを終了すると、[ スタディ定義] ページが表示されます。
  7. [スタディ定義]タブに移動し、左中央にある[スタディの説明]ボックスにプロジェクトの詳細を入力します。
  8. [ 入力ファイル] タブに移動し、[ ファイルの追加]をクリックします。
    1. これにより、総タンパク質組成プロファイル(プロテオーム)結果に処理するために必要な生データファイルを選択して、コンピューターのハードドライブからダウンロードできるダイアログボックスが表示されます。
  9. [ 入力ファイル ]タブにリストされている生のMSデータファイルをクリックすると、個別に選択して強調表示することも、一度にすべて強調表示することもできます。
  10. それらをドラッグして、右中央にある [処理ステップ] サブボックスの一部にある [分析] ボックスの [分析用ファイル] セクションにドロップします。
  11. [ワークフロー]タブに移動し、右中央にある[分析]ボックスの[処理ステップ]ヘッダーの横にある[編集]をクリックします。
  12. [ 共通を開く] をクリックし、 ProcessingWF_Tribrid フォルダーから、HCDフラグメンテーションベースのMS検出で得られたリンタンパク質サブ同定用に指定された処理ワークフローファイルを選択します(図4A)。
    注: 編集可能なノードを含む処理ステップ図が [ ワークフロー ツリー ] ボックスに表示されます。以下で説明するように、2つのノードがあり、ユーザーが実験固有の情報を入力する必要があることを示す感嘆符でマークされます。
  13. 処理ワークフロー ツリー ダイアグラムで、 をクリックして [Spectrum Files RC ] ノードを開きます。
    1. スペ クトラムファイルのパラメーター RC カテゴリで、実験的に関心のあるタンパク質を同定するために検索するペプチド MS スペクトルの種特異的リファレンスライブラリーとして、以前に Uniprot Web サイトを使用して生成された FASTA ファイルをタンパク質 データベース パラメーターで見つけて選択します。
  14. をクリックして Sequest HT ノードを開き、次の 3 つの変更を行います。
    1. [ タンパク質データベース ]パラメーターで、上記のように同じFASTAファイルを選択します。
    2. 酵 素名 パラメーターで、トリ プシン(完全) または Lys-C(元のペプチド消化物の調製に使用されるメインプロテアーゼとバックアッププロテアーゼ)を選択します。
    3. [ 動的修正 ] パラメーターで、少なくとも Phospho / +79.966 Da (S, T, Y) が選択されていることを確認します。
      1. 後者の設定を使用して、リン酸基(m/z = 79.97)の対応するMSスペクトル損失を探すことにより、リン酸化によって翻訳後修飾されたタンパク質に関連するペプチドを明らかにします。
      2. リン酸塩が占めるアミノ酸部位(セリン、スレオニン、またはチロシン)は、MS2フラグメンテーションパターンの予想される変化によって見つけます。
      3. 関連するグループの正確な質量損失がわかっている場合は、この時点で、同じ方法で日常的に関心のある他のタンパク質翻訳後修飾(メチル化、アセチル化、ミリスチル化など)を Sequest HT ノードに追加します。同様に、リン酸化部位の検索を、ヒスチジンなど、あまり報告されていない他のアミノ酸に拡大します。
        注: 処理ステップのワークフローツリーの Spectrum Files RC ノードと Sequest HT ノードは、パラメータの調整が必要な 2 つだけです。
    4. 残りは、指定された目的のタンパク質同定を最も多く生成するためにメーカーによってすでに最適化されているため、デフォルト設定のままにしておきます。同様に、これはワークフローツリー内の他のすべてのノードにも当てはまります。
    5. Percolator ノードと IMP-ptmRS ノードがワークフローツリーの最後に含まれていることを確認します。
      注:パーコレーターは、反復フィッティングを使用して、最終結果を大幅に改善します。IMP-ptmRSは、リン酸化を含むすべてのタンパク質の翻訳後修飾の適切な同定と部位局在化を報告するために不可欠です。
  15. [ワークフロー]タブに戻り、右上にある[分析]ボックスの[コンセンサスステップ]ヘッダーの横にある[編集]をクリックします。これにより、コンセンサスステップのワークフローツリー図が表示されます。
  16. [ 共通を開く] をクリックし、 ConsensusWF フォルダーから、タンパク質組成プロファイル(プロテオーム)結果に必要な出力形式を生成するコンセンサスワークフローファイルを選択します(図4B)。
    注: 編集可能なノードを含むコンセンサスステップ図が [ワークフローツリー] ボックスで開きます。データの処理に使用されるダイアグラムは、タンパク質の相対存在量の定量を容易にするために、最初のMSFファイルノードから分岐としてインラインの特徴マッパーノードと前駆体イオン定量子ノードが追加された基本的なコンセンサスワークフローの変更によって生成されます。ワークフローのすべてのノードには、メーカーによって確立された最適化されたパラメータがすでに含まれていますが、以下で説明するように、適切な選択を再確認するための非常に重要なエントリを含むノードもあります。
  17. ワークフローツリー図で、 をクリックして Precursor Ions Quantifier ノードを開きます。これは、同定された各タンパク質の相対存在量を定量化するために不可欠なノードです。
    1. [一般定量設定]カテゴリで、[使用するペプチド]パラメーターで[ユニーク+カミソリ]オプションを見つけて選択します。
      注:ユニークなペプチドとは、単一のタンパク質に排他的なアミノ酸配列を含むペプチドです。したがって、MS信号強度に基づいてその量を具体的に決定するために使用されます。カミソリペプチドは、タンパク質のグループ間で共有されるものです。したがって、計算された相対存在量を一致させるために使用されます。
    2. [ 正規化とスケーリング ] カテゴリで、[ 正規化モード ] と [スケーリング モード ] の両方のパラメーターを [ なし ] オプションに変更します。
      注:これらの設定は、目的の選択されたタンパク質の計算された相対存在量を、細胞に安定して固有のタンパク質(ハウスキーピング遺伝子など)に対して正規化し、結果の値をスケーリングされた比率として表現したい場合にのみアクティブになります。
    3. 次に、[ Peptide and Protein Filter ] ノードをクリックして開き、[ Peptide Filters ] カテゴリで [ Peptide Confidence At Least (少なくともペプチド信頼度 )] と [Keep Lower Confidence PSM ] パラメーターをそれぞれ [High ] オプションと [False ] オプションに変更します。これにより、タンパク質の同定に使用されるペプチドの一致が、最大レベルの適合有意性(つまり、95%≥)に設定されます。
      注:あるいは、最初のパラメーターを Medium に設定して、ペプチドマッチの厳密性を緩和し、タンパク質ヒットの出力を大幅に増加させることもできます。しかし、これは逆に、多くの誤った識別を生成する非常に高いリスクにつながります。同様に、両方のパラメータに「低」の値が許容されるオプションとして使用されることはありません。
    4. これらは、パラメータを調整する必要があるコンセンサスステップの唯一のノードであり、残りはデフォルト設定を使用するままにします。
      注:全体として、コンセンサスステップワークフローは、すべての事後分析、すなわち、タンパク質の相対存在量、同定の信頼度(すなわち、誤発見率とペプチドスペクトル一致スコア)、およびマッピングされたペプチドカバレッジの決定を処理します。結果の統計とデータ分布もエンドテーブルとして提供されます。
  18. 上記の処理とコンセンサスステップのワークフローが整ったら、スタディ全体を保存し、分析ボックスの上部にある実行アイコン(歯車)をクリックします。複数の生MSデータファイルを一度に処理する場合は、処理の実行を開始する前に、近くのファイル別アイコン(四角形)をクリックしてチェックマークを付けます。
    注:1つのMS生データファイルをプロテオーム結果ファイル全体に処理するには、通常20〜40分かかりますが、低、中、高信頼度の一致(つまり、高ヒットに重み付け)に至るまでの数千のタンパク質同定の実行リストと、各エンティティ内に存在するリン酸塩修飾が得られます(図4C).同定されたタンパク質の主な結果出力パラメーターは、FDR(信頼度)、マスター(FASTAファイル/ライブラリエントリがレビューされた場合)、アクセッション#、説明、カバレッジ%、配列カバレッジ、ペプチドスペクトル一致(例えば、一意のペプチドの数)、物理的特性(例えば、kW(kDa単位のMW)、相対存在量、および修飾(すなわち、リン酸化基)です。
    1. 列は、ツールバーのファン ネル アイコン(図4C)を使用して、プロテオーム全体の結果を昇順または降順で配置するか、完全にフィルタリングし、研究の関心に応じて、例えば、信頼度の高い同定(タンパク質FDR)または高度なペプチドマッチング(例えば、カバレッジ%および/または見つかったユニークの数によるもののみを表示します)。
    2. 翻訳後修飾情報が特に必要な場合は、リン酸化を有する同定されたタンパク質をフィルタリングして、さらなる分析を行います。
    3. 適用されたフィルターを削除してウィンドウを更新するだけで元の出力に復元できるため、ファイル名を変更せずにフィルター処理された結果を保存します。

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結果

火山プロットへのオプションの処理によるトータルプロテオーム結果の視覚化
各サンプルのプロテオームの合計結果は、研究対象の特定のタンパク質のアクセッション#または記述によって容易に検索でき、関連する相対存在量を平均化し、次に有意な差について治療グループ間で比較します(例えば、t検定から導出されたp値による)。あるいは、実験の処理グループを構成する個々のサンプル間で完全に共有されているリンタンパク質を含むプロテオーム全体の全体的な変化を探すことは、非常に探索的価値があります。これは、データをオプションの火山プロットに変換することによって行われます。個々のサンプルのプロテオーム結果を生成するために使用されるバイオインフォマティクスソフトウェアは、生のMSデータファイルの処理中に処理グループ比較を自動的に実行し、対応する火山プロットを生成するように設定できます。ただし、プログラムはグループ平均の決定に費やされた個々の相対存在量を公然と示していないため、出力はしばしば解釈が困難です。同様に、タンパク質がサンプル中に検出できないか、疑わしいほど存在しない(たとえば、固有のペプチドがない)かどうかを明確に示すこ...

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ディスカッション

上記の方法では、液体窒素で急速凍結した組織を利用して、長期保存のために-80°Cに移す前に、すべての生物活性を直ちに停止させました。すべてのサンプルが収集されると、組織の均質化が起こりました。均質化中は、タンパク質の再活性化や分解を防ぐために、すべての組織とツールを冷たく保つことが重要です。また、均質化された組織からタンパク質を最初に抽出する際、タンパク質活性の喪失やタンパク質の分解を防ぐためにサンプルを冷蔵しておきます。この方法論を利用して、TBIの前臨床動物モデル(すなわち、模擬爆風過圧波被曝マウスとフェレット)から単離された脳、肺、脾臓、肝臓、血漿などの組織のタンパク質プロファイルの変化を解明しました。この方法は、グローバルプロテオームの組織全体の変化を調べるのに理想的です。ただし、さらなる実験では、このプロトコルを拡張して、組織の特定の領域に焦点を当てることができます。たとえば、将来の実験では、急凍前に分離された脳の解剖学的に異なる領域におけるリン酸化蛋白質変化に焦点を当てる可能性があります。私たちの研究室は以前、機能的および解剖学的に異なる領域を取得するために...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

このプロジェクトは、全米科学・工学・医学アカデミーのフェローシップ・オフィスとウォルター・リード陸軍研究所のオークリッジ科学教育研究所プログラムが管理する全米研究評議会アソシエイトシップ・プログラムへの任命によって部分的に支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
660 nmプロテインアッセイキットピアス / サーモサイエンティフィック22662サンプルのタンパク質濃度を測定するためのBCAには、Pierce 660nmタンパク質アッセイ試薬と希釈済みタンパク質アッセイ標準物質が含まれています
アセトニトリル、Optima LC/MSグレードサーモフィッシャーサイエンティフィック047138.K2液体クロマトグラフィー/質量分析に使用される超高純度アセトニトリル
アルミホイルプレートシールベックマン・コールター538619タンパク質アッセイプレートの開発時に使用したシール
BioTek Synergy Neo2 マルチモードリーダー / 紫外可視分光計アジレントhttps://www.agilent.com/en/product/microplate-instrumentation/microplate-readers/multimode-microplate-readers/biotek-synergy-neo2-hybrid-multimode-reader-1623195タンパク質濃度を決定するために660nmの吸光度測定値を入力するために使用される分光光度計/アッセイプレートリーダー装置。
ChromaCare LC-MS 装置フラッシュソリューションサーモフィッシャーサイエンティフィックT111101000アセトニトリル、イソプロプラノール、メタノール、および水をそれぞれ 25% 含む溶液で、サンプル実行後の LC システムの洗浄に役立ちます。
CK28 プレセリスチューブBertin Corp / テクノロジーP000911LYSK0A.0均質化された組織は、Precellyis装置を使用して組織溶解とタンパク質単離のためにこれらのチューブに入れられます。これらは、プロトコルで「均質化チューブ」と呼ばれる私たちの研究室で利用されているチューブです。
クライオポッドブルックス/アゼンタライフサイエンスhttps://www.azenta.com/products/cryopod-carrierティスーゼ均質化時にモルタルを冷却するための液体窒素を保持するための容器
EasyPep Mini MS サンプル前処理キットサーモフィッシャーサイエンティフィックA400061つのキットで20サンプルを処理でき、内容物にはタンパク質抽出用の溶解液、抽出液に添加されたユニバーサルヌクレアーゼ、およびステップ1.4および1.5に必要なリジェントが含まれます
EASY-Spray C18 LC カラム(15 cm L、50 & micro;m Dia、および 2 & micro;m粒径)サーモフィッシャーサイエンティフィックES901MS検出前のペプチドの分離に使用されるエレクトロスプレーLCカラム
FlexMixキャリブレーションソリューションピアス / サーモサイエンティフィックA39239サンプルラン前のMS装置の検出器の精度と感度を校正するために使用される16種類の標準分子の混合物
ギ酸、LC/MSグレードサーモフィッシャーサイエンティフィック85178すべてのLC溶液およびサンプルを最終濃度0.1%(v/v)でアシフィジングするために使用される超高純度ギ酸
プロテアーゼを停止し、ホスホターゼシングルユース阻害剤カクテル(100倍)サーモフィッシャーサイエンティフィック78442サンプル中のタンパク質やリンタンパク質の分解を防ぐために抽出バッファーに添加
メタノール、Optima LC/MSグレードサーモフィッシャーサイエンティフィック047192.K2液体クロマトグラフィー/質量分析に使用される超高純度メタノール
磁器モルタル、150 mLサーモフィッシャーサイエンティフィックFB961C容量150 mL、小さなフェレット組織(脳など)の均質化に使用
磁器モルタル、275 mLサーモフィッシャーサイエンティフィックFB961D容量275 mL、大きなフェレット組織(肝臓など)の均質化に使用
磁器モルタル、50 mLサーモフィッシャーサイエンティフィックFB961A型50 mL容量、マウス組織の均質化に使用
磁器ペストル、50 mLサーモフィッシャーサイエンティフィックFB961K型50mLモルタル用
磁器乳棒、150 mLサーモフィッシャーサイエンティフィックFB961M型150mLモルタル用
磁器乳棒、275 mLサーモフィッシャーサイエンティフィックFB961N275mLモルタル用
プレセリスBertin Corp / テクノロジーhttps://www.bertin-technologies.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys-evolution-homogenizer/組織サンプルを均質化するために使用される機器。次の設定が使用されました: 4500 RPM、サイクルあたり 2 x 30 秒、一時停止 30 秒。
プロテインアッセイ試薬ピアス / サーモサイエンティフィック22662ステップ3.4で使用したタンパク質アッセイ試薬。3.8
プロテオームディスカバラーサーモフィッシャーサイエンティフィックCSW0064764プロテオミクス/リン酸化プロテオミクスデータを解析するためのバイオインフォマティクスソフトウェア
SureSTART MSCERT スクリューキャップ LC インジェクションバイアル (0.02–容量1.5mL)サーモフィッシャーサイエンティフィック午後6台 39TRLC/MS装置に注入するサンプルを入れるために使用される高性能アプリケーション認定のスクリューキャップ(PTFE、プレスリットセプタム)ガラスバイアル。  
Ultimate 3000 UHPLC / Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MS (LC/MS) システムサーモフィッシャーサイエンティフィックLC:割引/MS:FETD2-10002、特別リクエストによる超高性能液体クロマトグラフィー/質量分析(LC/MS)装置で、サンプル中のペプチドを分離し、分子量で検出します。
細胞溶解用ユニバーサルヌクレアーゼ、100kU、400 & micro;Lピアス / サーモサイエンティフィック88702追加のユニバーサルヌクレアーゼが購入されました 
真空分離機プラスエッペンドルフhttps://www.eppendorf.com/us-en/Products/Centrifugation/Concentrator/Vacufuge-plus-p-PF-25748再構成前にペプチドサンプルを乾燥させるために使用される真空分離機。
水、Optima LC/MSグレードサーモフィッシャーサイエンティフィック047146.K2液体クロマトグラフィー/質量分析に使用される超純水

参考文献

  1. Wilhelm, M., et al. Mass-spectrometry-based draft of the human proteome. Nature. 509 (7502), 582-587 (2014).
  2. Souchelnytskyi, S. Bridging proteomics and systems biology: what are the roads to be traveled. Proteomics. 5 (16), 4123-4137 (2005).
  3. Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).
  4. Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
  5. Casado, P., et al. Integrative phosphoproteomics defines two biologically distinct groups of KMT2A rearranged acute myeloid leukaemia with different drug response phenotypes. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 80(2023).
  6. Fazakerley, D., et al. Phosphoproteomics reveals rewiring of the insulin signaling network and multi-nodal defects in insulin resistance. Nat Commun. 14 (1), 923(2023).
  7. Emdal, K. B., et al. Phosphoproteomics of primary AML patient samples reveals rationale for AKT combination therapy and p53 context to overcome selinexor resistance. Cell Rep. 40 (6), 111177(2022).
  8. Boutté, A. M., et al. Proteomic analysis and brain-specific systems biology in a rodent model of penetrating ballistic-like brain injury. Electrophoresis. 33 (24), 3693-3704 (2012).
  9. Peters, M. E., et al. Head injury serum markers for assessing response to trauma: Design of the HeadSMART study. Brain Inj. 31 (3), 370-378 (2017).
  10. Song, H., et al. Proteomic analysis and biochemical correlates of mitochondrial dysfunction after low-intensity primary blast exposure. J Neurotrauma. 36 (10), 1591-1605 (2019).
  11. Attilio, P. J., et al. The effects of blast exposure on protein deimination in the brain. Oxid Med Cell Longev. 2017, 8398072(2017).
  12. Zhao, Z., Zlokovic, B. V. Acetylated tau: A missing link between head injury and dementia. Med. 2 (6), 637-639 (2021).
  13. Meyerhoff, J., et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. J Vis Exp. (168), e61941(2021).
  14. Blagoev, B., Ong, S. E., Kratchmarova, I., Mann, M. Temporal analysis of phosphotyrosine-dependent signaling networks by quantitative proteomics. Nat Biotechnol. 22 (9), 1139-1145 (2004).

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