方法論記事

3D流体チップにおける肺切除術後の内皮グリコカリックスのモデル化 - 血管ベースの臓器オンチップシステムの構築へのアプローチ

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DOI：

10.3791/67246

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2025年9月16日

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1Biomedical Engineering Department, Worcester Polytechnic Institute

この記事について

サマリー

ここでは、肺切除術を模倣するように設計されたオルガンオンチップ(OOC)システムを構築するためのプロトコルを提示します。このシステムは、グリコカリックス障害と肺切除後の合併症との潜在的な相関関係を調査します。

要約

内皮グリコカリックス (GCX) は、内皮細胞の管腔表面を覆う炭水化物が豊富な層であり、刺激に対する細胞反応の調節において極めて重要な役割を果たします。これは、細胞応答のメカノトランスデューサーとして機能する膜貫通タンパク質で構成されています。恒常性条件下では自然に構造と安定性を維持しますが、高せん断応力にさらされると損傷を引き起こし、さまざまな結果をもたらす可能性があります。内皮細胞に対する一般的なせん断応力の影響は調査されていますが、血管系、特に肺切除術後に対するせん断応力の程度と影響は十分に研究されていません。これを調査するために、肺切除術前後の肺血管系の CAD モデルの作成を含む包括的なアプローチが実施されました。計算流体シミュレーションを利用して、せん断応力と圧力の上昇の主要な領域が特定され、オルガンオンチップ(OOC)システムで再現されました。ヒト肺微小血管内皮細胞(HLMVEC)を、選択した切片の形状で型に播種し、 in vitroでせん断応力の上昇の影響を特徴付けました。実験後、HLMVEC を免疫染色して、肺切除術によって誘発される正常および増加したストレス下での GCX の健康状態を定性的に評価しました。計算モデリングと実験分析の統合により、せん断応力の変化が GCX にどのような影響を与えるかについての理解が深まり、血管機能や術後合併症への影響が明らかになります。

概要

肺切除術は、右肺または左肺を摘出するために行われる侵襲的でリスクの高い外科的介入です1。この処置は通常、肺がん、肺結核、外傷性肺損傷などのさまざまな重篤な病気の治療オプションとして利用されます2。この処置には有望ですが、不整脈から肺水腫に至るまでの術後合併症の発生率の増加によって強調される重大なリスクが生じます1。

肺摘出術は、心臓の心拍出量全体を残りの肺に向けることにより、心血管動態に大きな影響を与えます3。この血流の方向転換は、残りの肺血管系内の圧力とせん断応力を増加させることが知られています4。血流パターンのこれらの大きな変化により、内皮グリコカリックス(GCX)は、血流パターンのこれらの変化を感知する上で極めて重要な役割を果たします5。

GCXは、環境の変化に応じて生化学的活性を調節するゲル状の層です6,7。その発現は、静的培養と比較して、均一な流れに長時間さらされると増加し、乱れた流れにさらされると減少することが示されています8,9。GCXは、血管系全体にわたって0.1〜1μmの範囲の可変厚さを示し、血管の内皮細胞をコーティングする必須の機械伝達層として機能します10。このネットワークは、図1に示すように、糖、脂質、タンパク質の緻密な層で構成されています。これらの糖は結合して糖鎖を形成し、血流中に自由に存在することも、タンパク質や脂質に結合することもでき、プロテオグリカン、糖タンパク質、または糖脂質が形成されます7,11。プロテオグリカンはグリコサミノグリカン (GAG) 鎖で構成されており、血漿タンパク質または受容体を介して細胞膜に結合します。これらの GAG には、ヘパラン硫酸 (HS)、ヒアルロン酸 (HA)、コンドロイチン硫酸 (CS)、デルマタン硫酸、およびケラタン硫酸12 が含まれます。ヘパラン硫酸は主要な GAG であり、GCX に見られる総 GAG の 50% 以上を占めています。これらの側鎖は、CD44(表面接着受容体)とともに、グリピカン(グリコシルホスファチジルイノシトールによって固定)およびシンデカン(膜にまたがるドメインを持つ)を含む埋め込みコアタンパク質に結合することができます。上記の複合体は、成長因子の調節、抗炎症反応、血管拡張の促進、血管透過性の制御に重要な役割を果たします13。

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図1:GCXコンポーネント図。 内皮グリコカリックスの成分を表す概略図。この概略図は、血管の内腔にある頂端グリコカリックスを示し、その膜結合プロテオグリカンと糖タンパク質を示しています。BioRender.com で作成この 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

肺摘出術と GCX 損傷との正確な関係は十分に研究されていませんが、肺摘出術によって誘発される血流パターンの変化と GCX の完全性との間にはもっともらしい相関関係が存在します。血管系内の血流の乱れは、GCX6 に損傷を与えることが知られています。肺切除術後の残りの血管系の乱れた流れの増加とせん断応力の変化が、時間の経過とともに GCX に損傷を与える可能性があるという仮説を立てました。この悪化の加速は、術後の合併症や罹患率を触媒し、それによって患者の全体的な健康に対する固有のリスクを高める可能性があります13。

このプロトコルは、図 2 に概説されている一般的な手順に従って、肺切除術後の肺血管系をモデル化することを目的としていました。流体シミュレーションは、肺切除術の有無にかかわらずヒト肺血管系を再現するコンピューター支援設計モデルで実施されました。肺切除モデルは、CT スキャンと文献データから導き出された寸法に基づいて、3D モデリング ソフトウェアで 3D 肺血管系を設計し、計算流体力学 (CFD) ソフトウェアでの流れシミュレーションのためにさらに簡素化することによって作成されました。シミュレーションでは、対照と比較して肺切除モデルでせん断応力が増加した領域によって選択された、特定の関心領域が特定されました。これらの関心領域は、in vitroモデルを構築するために複製するために選択されました。in vitro モデルでは、流体チャンバー設計を利用して、正常な形状と肺切除術の形状を持つ血管系の複数のセクションをシミュレートし、流れ条件の違いをシミュレートしました。

ヒト肺微小血管内皮細胞(HLMVEC)を、選択された分岐領域を模倣するように形状されたフィブロネクチンでコーティングされたポリジメチルシロキサン(PDMS)基質上で培養しました。微小血管内皮細胞培養培地は、蠕動ポンプを使用してシステムを通して灌流されました。最後に、細胞とGCXを固定し、GCX染色抗体で免疫染色し、蛍光顕微鏡を使用して視覚化して、流体の流れにさらされた後の状態を評価しました。プロトコルの一般的なタイムラインを表1に示します。

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図2:OOC開発シーケンス。 肺肺切除術の効果を研究するための新しいOOCシステムの開発の順序 (1) ヒト肺血管系から生成されたCTスキャン。(2) 3D CADモデルの関心領域を特定するために使用されるCTスキャン形状。(3) in vitro モデルで関心のある形状を決定するための流体流シミュレーション。(4) シミュレーション結果から関心のある領域を含む PDMS 金型をモデル化 (5) 灌流用の金型を固定するためにアクリルケースに金型を挿入 (6) フローチャンバーのセットアップを完了しました (7) インキュベーターに移されたフローチャンバーのセットアップを完了しました (8) せん断応力にさらされた後に撮影された明視野および蛍光画像。BioRender.com で作成この 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表 1: 一般的なプロトコルのタイムライン。 プロトコル内でステップを実行する一般的なシーケンスと、各ステップの平均期間 (h)。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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プロトコル

この研究では、機関および連邦の倫理基準に従って収集された以前の文献14 からのコンピューター断層撮影 (CT) 画像データを利用しました。参照されたすべての画像データは、参加者の権利とプライバシーの保護を確保するために治験審査委員会 (IRB) による承認を受けて、参加者からのインフォームド コンセントを得ました。

1. CADソフトウェアでの肺血管系のモデリング

  1. モデル化する一次血管の生理学的形状を研究します。
  2. モデル化する血管の患者CT画像を使用して、 図2に示すように、複製する特定の形状を選択します。
    注: このプロトコルでは、以前の文献からの臨床状態の肺 CT スキャンが利用されました14。このプロトコルでは、任意のCTスキャンデータを使用して in vitro モデルを生成することもできます。
    1. DICOMビューアを開き、CT画像を インポート します。スライスをナビゲートして、目的の船舶を特定します。関連する画像を 保存して、 さらに分析します。
      注:このプロトコルの適用は、健康な肺切除術後の状態で内皮グリコカリックスをモデル化することであるため、このプロトコルのために複製された血管は肺血管系でした。他の場所は、さまざまな用途に使用できます。
  3. ImageJ FIJI v1.54f15 を使用して、CT 画像または文献値から血管の直径を測定します。
    1. 開ける ImageJ FIJIと保存したCT画像のインポート: ファイル>開くを選択します。
    2. ツールバーから [線ツール ] を選択して、CT 画像上の縮尺バーの長さにまたがる線を描画します。
    3. 次に、[ 分析] > [スケールの設定] を選択します。既知の距離を入力します(たとえば、画像の縮尺バーが10 mmの場合、既知の距離として10を入力します)。長さの単位(mmなど)を入力します。[ OK] をクリックします。
  4. ラインツールを使用して直径を測定します。これを行うには、ツールバーからラインツールを選択し、容器の直径にまたがる線を描画します。次に、[ 解析]>[測定 ]を選択して、直径値を取得します。
  5. 目的のすべての容器に対して手順1.3と1.4を繰り返し、測定値を記録します。
  6. 船舶の測定値をセグメントタイプにコンパイルして、モデリングを容易にします。
    1. 血管の測定値を分類するスプレッドシートを作成し、各行に血管名、測定値、セグメントタイプ(動脈、静脈など)のラベルを付けます。
  7. 文献とX線撮影の測定に基づいて、血管セグメントの長さと直径の参照表を作成します。
  8. 3D モデリング ソフトウェアを使用して 3D モデルを生成し、CT 画像の形状と寸法を複製します。
    1. ソフトウェアを開き、新しい部品ファイルを作成します: [ファイル] > [新しい>部材 ] を選択し、[ スケッチ] > [スケッチを作成 ] を選択し、ImageJ の寸法を使用してプロファイルを描画します。
    2. サーフェス スイープとロフトを 3D ジオメトリに利用する: スイープの場合は、 フィーチャー > スイープ ボス/ベースを選択します。ロフトの場合は、[ フィーチャー]>[ロフト付きボス/ベース]を選択します。
    3. 正確な測定値に一致するようにモデルを調整します。
  9. 対照モデルや肺切除モデルなど、開発するモデルのバリエーションを特定します。
    1. さまざまな条件 (例: 正常切除術と肺切除術) を概説し、各バリエーションに必要な構造変化をリストします。
  10. 元のモデルを複製して変更し、パラメータ(つまり、左右の肺切除術)に従って実験モデルを作成します。
    1. 元のモデルを保存し、[ファイル] > [コピーとして保存] を選択して、実験条件ごとにコピーを作成します。
    2. 定義されたパラメーターに従って各コピーを変更します (例: 右および左の肺切除術)。
  11. 数値流体力学(CFD)シミュレーション用のモデルをパーツ ファイルからParasolidファイルに変換します。
    1. [ファイル] > [名前を付けて保存] を選択します。ファイルタイプドロップダウンからParasolid(*.x_t)を選択し、目的のディレクトリにファイルを保存します。

2. 流体の流れシミュレーション

注:このステップは、肺切除術後に修正されたせん断応力の領域を特定して、 in vitro システム用に複製する血管形状を選択するのに役立ちます。さらに、 ソフトウェアライセンスはインポートモジュールをサポートしている必要があります。

  1. 新しい定常層流スタディを設定します。
    1. [モデル ウィザード]> [3D (空間寸法)]> [流体流>単相流>層流 (spf)> [追加] を選択して層流物理インターフェイスを追加> [スタディ] を選択し> [一般スタディ] で [定常] を選択し> [完了] を選択します。
  2. CADモデルからジオメトリを追加します。
    1. Parasolidファイルを読み込みます。「 キャップ面」(Cap Faces) を選択し、「グラフィックス」(Graphics) ウィンドウで、開いている各入口と出口で 容器の内壁の円周 を選択します。これらは、キャップ面の境界エッジになります。[ フォーム ユニオン] と [すべて構築] を選択します。
    2. [詳細を削除]を選択し、[削除する詳細]ですべてのオプションが選択されていることを確認し、[すべてビルド]を選択して不要なジオメトリを削除します。
  3. メッシュ 1 (メッシュ容器壁 + メッシュ流体ドメイン) の作成。
    1. サイズを事前定義:非常に細かく、流体力学用にキャリブレーションします。
    2. サイズ1をpredefined: extra fine、calibration for fluid dynamicsに設定し、Geometric Entity SelectionでBoundaryとManualを指定します。「グラフィックス」(Graphics) ウィンドウで、キャップ面の周囲のリング状の面を含む、容器壁ドメインの表示されているすべての外側の面を選択します。入口と出口のキャップ面は選択しないでください。
      注:肺切除術モデルの左右にある取り外したセクションの端にあるキャップ面は、肺切除術後の幾何学的境界と見なされるため、選択してください。
    3. [ コーナーの細分化]で、[ ドメイン] と [手動]を選択します。グラフィックスウィンドウで、[ ドメイン] 1 (血管壁) と [ドメイン] 2 (流体) を選択します。
    4. [境界選択]で、境界が[サイズ 1]の[ジオメトリ エンティティ選択]で指定されているものと同じであることを確認します。
    5. 「自由四面体 1」で、「ドメイン選択」の「ジオメトリエンティティレベル」で「残り」を選択します。
    6. 「境界層 1」(Boundary Layers 1) と「ジオメトリエンティティ選択」(Geometric Entity Selection) で、「ドメイン」(Domain) を指定し、グラフィックスウィンドウの「ドメイン」(Domain) 1 と「ドメイン」([ドメイン] 2) で「手動」(Manual) を選択します。境界画層のプロパティは、サイズ 1 で指定したものと同じ選択になります。
    7. メッシュ 1 の下の Build All を選択して、メッシュを構築します。
  4. メッシュ 2 の作成(メッシュ流体ドメインのみ)。
    1. メッシュ 1 を右クリックし、インポートを選択して「メッシュ 2」を作成し、インポート 2 を削除します。
    2. [インポート 1]で、[ メッシュ シーケンス ]を選択して、 メッシュ 1 を自動的に選択します。 [ソース メッシュを自動的に構築]、[ドメイン要素をインポート]、および [メッシュなしドメインをインポート ]がオンになっていることを確認し、[ インポート]を選択します。メッシュ 1 で定義されたすべての設定は、メッシュ 2 に引き継がれます。
    3. メッシュ 2 を右クリックし、エンティティの削除を選択します。エンティティ 1 を削除(Delete Entities 1)で、ジオメトリ エンティティ選択(Geometric Entity Selection)でドメイン(Domain)を選択し、手動(Manual)を選択し、グラフィックス ウィンドウで[ドメイン] 1(容器壁)を選択し、流体ドメイン メッシュのサーフェスが流体の流れと容器の内壁の間の界面にあるため、流体ジオメトリのみを残すためにすべて構築(Build All)を選択します。
  5. フローマテリアルの追加:文献の血液の特性を使用して新しいマテリアルを作成します。 [材料] を右クリックし、[ 空白材料]を選択します。ジオメトリエンティティレベルの選択で [ドメイン] を選択し、[ すべてのドメイン]を選択します。[材料タイプ]で [非固体 ]を選択し、粘度や密度などの血液の材料特性を追加します。
  6. 層流スタディの境界条件とパラメータを設定します。
    1. [ 層流 (spf)] を選択し、[ ドメインの選択] で [すべてのドメイン] を選択します。[ドメイン] 1 のみが表示されます。この場合のドメイン 1 は、血管壁ではなく流体ジオメトリです。流体特性 1 は、手順 5 で定義した材料から自動的に充填されます。
    2. 初期値1の圧力を生理的血圧に設定します。壁 1 の境界条件を滑り止めに設定します。
    3. グラフィックス ウィンドウで 入口 1 を選択し、境界条件を 完全に 開発された流れ に設定します。 [各不連続選択に個別に条件を適用する] がオンになっていることを確認します。
    4. [ 完全に開発されたフロー] で、[ フロー レート] を選択し、速度を入力します。
    5. [ 出口 1]で、[グラフィックス]ウィンドウですべての 出口 を選択し、[ 境界条件 ]が [圧力]に設定されていることを確認します。
    6. [圧力条件]で[合計]を選択し、圧力を入力します。[平均] と [バックフローの抑制] を選択します。
  7. スタディを設定して実行します。
    1. [スタディ]の[ステップ1:定常]で、[物理と変数]セクションが目的のスタディと一致し、[メッシュ選択]コンポーネント1が[メッシュ2]に設定されていることを確認します。[コンピューティング] を選択します。
  8. せん断応力の結果を解析します。
    1. [圧力 (spf)] を右クリックし、[複製] を選択します。名前をせん断応力に変更します。
    2. せ ん断応力でサー フェス を選択し、データセットを スタディ 1/ソリューション 1 (sol1)に変更します。
    3. [式] に「spf.sr*spf.mu set units to Pa」と入力します。
      注:これは「単相流せん断速度*単相流粘度」の略です。
    4. 次に、[ プロット ]を選択し、[ 透明度1] を右クリックして[ 無効にする]を選択します。
    5. せ ん断応力 を右クリックし、 ボリュームを選択して 、データセットを スタディ1/ソリューション1(sol1)に変更します。
    6. [式] に「spf.sr*spf.mu」と入力し、単位を [Pa] に設定します。
    7. プロットを選択し、サーフェスを右クリックし、無効化を選択して「ボリューム1」を視覚的に分析し、OOCモデルで研究する対象の船舶領域を決定します

3. PDMS金型の準備

  1. 流体シミュレーションの結果を使用して、対照モデルと全肺切除モデルの間でせん断応力に有意差を示す領域を選択することにより、対照および全肺切除の形状を選択し、それらをCADでネガティブモールドとして複製します。制御および全肺切除血管系のCADモデルの寸法を図3および図4に示します。
  2. さらに、細胞播種時の漏れを防ぐために、金型の入口と出口にプラグを設計します。
  3. 3Dプリンターを使用して、PLAフィラメントを使用して金型とプラグを印刷します。
  4. 3Dプリントされたポリ乳酸(PLA)型(対照+肺切除術)を入手します(図5A)。
  5. シリコーンエラストマーベース10部とシリコーンエラストマー硬化剤1部を秤量して、合計30 mLの混合物(質量/質量比10:1)を作り、金型を3mmの厚さに充填します(図5B)。
    注:計量プロセス中に原液を混合しないでください。試薬ごとに別々の計量材料を使用してください。
  6. エラストマーベースと硬化剤を一緒に注ぎ、よく混ぜます
    注:これは計量ボートで行うことができます。
  7. よく混合した溶液を型に注ぎます(型の半分で約15 mL)(図5C)。
  8. PDMSを真空チャンバーに30〜60分間、または気泡が残らなくなるまで入れて、PDMSを脱気します(図5D)。
  9. PDMSを真空チャンバーから取り出し、室温で48時間硬化させます。
    注:PLA金型の熱容量のため、硬化にはオーブンを使用しませんでした。
  10. PLA金型からPDMSを取り出します。
  11. PLA金型をDI水でたっぷりとすすぎ、表面に不純物が残らないようにし、再度使用できるようにします。

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図3:制御血管系の3D CAD図面。 上面図と側面図での制御血管系モデルの寸法(mm単位)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:肺切除血管系の3D CAD図面。 上面図と側面図での肺切除血管系モデルの寸法(mm単位)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:PDMS金型の作成。 PDMS金型の作成(A)対照(オレンジ)および肺切除術(緑)実験用の3DプリントPLAモールド。(B)PDMS製材料を備えた体重計。(C) PDMS 混合物 (10:1 ベース + 硬化剤) を 3D プリントされた型に流し込みます。(D)真空チャンバー内でPDMSを脱気します。BioRender.com で作成 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

4. 細胞培養と播種

  1. 地元のラボプロトコルに従って、適切な無菌技術を使用してください。
  2. 70%エタノールをスプレーし、PDMSピースと4枚の両面テープを含む、必要なすべての材料とコンポーネントをバイオセーフティキャビネット(BSC)(図6A)に持ち込みます。
  3. 両面テープを2枚ずつ各細胞培養プレートに置きます(図6B)。
  4. 各PDMS血管系の半分を、両面テープの上の独自の細胞培養皿に入れます(図6C)。
  5. BSCで20分間UV光にさらして、すべてのコンポーネントをさらに滅菌します。
  6. 必要に応じて、トリプシン、HLMVEC培地、および20 μg/mLのフィブロネクチンを37°Cで解凍します。
  7. マイクロピペットを使用して、20 μg/mL フィブロネクチンの 30 μL 滴を PDMS 血管系に沿って数滴留置します。PDMSを傾ける必要に応じて、ピペットチップを使用してPDMSを均一にコーティングします(図7A)。
  8. BSC中でPDMS片を30分間インキュベートします。
  9. インキュベーション後、フィブロネクチン溶液を吸引し、PDMS片をBSCで乾燥させます(図7B)。
  10. HLMVEC細胞のコンフルエントフラスコをインキュベーター(37°C、5%CO2)からBSCに持ち込みます。
  11. 培養フラスコからHLMVEC培地を吸引します。トリプシンまたは滅菌PBSで短時間すすいでください。
  12. 洗浄液を吸引し、フラスコに3 mLのトリプシンを加えます。37°C、5%CO2 で5分間インキュベートします。顕微鏡で細胞を観察し、すべての細胞がフラスコから切り離されていることを確認します。
  13. HLMVEC完全培地9mLを加えて、トリプシン作用を停止します。
  14. 細胞懸濁液を50 mLのコニカルチューブに移し、フラスコを10 mLのHLMVEC培地ですすぎ、残りの細胞を回収します。
  15. 50 mLチューブに移します。細胞を220 x g で5分間遠心分離します。
  16. 完了したら、チューブの底にある細胞ペレットを目視で確認します。チューブに70%エタノールをスプレーし、バイオセーフティキャビネットに入れます。ペレットを残して上清を吸引します。
  17. 細胞を1 mLの新鮮なHLMVEC培地に穏やかに再懸濁し、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。以下の式を使用して総細胞数を計算します(AHは血球計算盤の正方形あたりにカウントされた細胞の数です)。細胞を氷の上に置いてください。
    figure-protocol-4
  18. HLMVEC培地で細胞の濃度を2 x 106 細胞/ mLにします。
  19. 図5に示すように、3Dプリントされたプラグを各血管系の半分の端に配置して、PDMSモールドからの細胞懸濁液の漏れを排除します(合計4つのプラグ、PDMSピースごとに2つのプラグ)(図7C)。
  20. マイクロピペットを使用して、300 μLのHLMVEC細胞懸濁液(600 k細胞)を各PDMSピースに播種します(図7D)。
  21. HLMVEC細胞を含むPDMS片をインキュベーター(37°C、5%CO2)に1〜2時間静かに移して付着させます(図7E)。
  22. 顕微鏡で検査し、PDMS基板へのHLMVECの付着が成功していることを目視で確認します。
  23. PDMS血管系の半分をBSCに戻します。
  24. 4つのプラグを取り外し、PDMS血管系の半分を沈めるのに十分なHLMVEC培地を追加し、PDMS血管系を含む培養プレートをインキュベーターに戻します(図7F)。
  25. 播種の6〜10時間後、PDMSを取り囲むHLMVEC培地を血管系に手動でピペットで移し、細胞に最も近い培地をリフレッシュします。

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図6:PDMS金型をプレートに取り付ける。 PDMS血管系を細胞培養プレートに取り付けるための基本的な手順。(A)PDMS血管系の半分を培養プレートに入れるために必要な材料。(B)両面粘着テープ2枚を各滅菌培養プレートに斜めに配置します。(C)両面接着剤の上に取り付けられたPDMS血管系の半分。BioRender.com で作成この 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図7:HLMVECをPDMSモールドに播種します。 PDMS血管系におけるHLMVECの播種手順(A)血管系150〜300 μLに20 μg/mLのフィブロネクチンを充填します。(B)チルトタップ技術を使用して余分なフィブロネクチンを吸引します。(C)PDMS血管系の半分の端を3Dプリントプラグで差し込みます。(D)300 μL培地中の500〜600K細胞を各血管系の半分に播種します。(E)PDMSの半分をインキュベーターに1〜2時間入れて、細胞の付着を容易にします。(F) PDMS の半分をメディアで覆い、プラグを取り外します。BioRender.com で作成この 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

5. フローシステムの組み立てと実行

  1. 顕微鏡下での目視検査によって決定されたように、PDMS血管系の半分の細胞が完全に合流したら、フロー手順を実行します。
  2. 実験を行う前に、メーカーのプロトコルに従って蠕動ポンプを校正してください。
  3. フローチューブ、チューブコネクタ、シリンジリザーバー、ゴム栓など、オートクレーブ可能なすべてのコンポーネントをオートクレーブします。
  4. アクリルブロック、ネジ、プラグ、長さ1インチのMasterflex L/S 16チューブピース、および15 mmペトリ皿の蓋を70%エタノールに15分間浸し、BSCで20分間UV処理し、途中でひっくり返します。
  5. 他のすべての機器と材料が滅菌されたら、PDMS血管系の半分をBSCに持ち込みます。
  6. 血管系の半分を含むペトリ皿からHLMVEC培地を吸引します(図8A、B)。
  7. PDMSの半分を2つのポリカーボネートブロックに置き、それらが位置合わせされていることを確認します(図8C)。
  8. チューブがPDMSの半分に取り付けられる血管系の端にシリコーンシーラントを塗布し、インチの長さのチューブを下部血管系の両端に配置します(図8D)。
  9. 上部のアクリルブロック(PDMS血管系の上半分を含む)を下部のアクリルブロック(PDMS血管系の下半分を含む)に裏返します(図8E)。
  10. アクリルブロックを底のネジ付きブロックと一緒にボルトで固定し、長さ1インチのチューブの自由端を3Dプリントされたプラグで差し込みます(図8F)。
  11. 1つのプラグを取り外し、500 μLのHLMVEC培地を血管系にそっと注入し、気泡を防ぐために傾けてから、プラグを交換します。
  12. 組み立てたチップ全体をインキュベーターに入れ、シリコーンを1〜2時間硬化させます。
  13. 組み立てたチップとその他すべての滅菌材料をBSCに持ち込み、すべてを接続して、 図9に従ってフローシステムをセットアップします。蠕動ポンプを通って血管系入口に通るチューブがシリンジリザーバーの底に取り付けられていることを確認します。これにより、重力がチューブに供給され、システム内の気泡が減少します。
  14. フローシステムをHLMVECメディアで穏やかにプライミングします。50 mLの血清ピペットを使用して、30 mLの培地をシリンジリザーバーの上部に注入します(図10B)。蠕動ポンプを低流量で作動させ、チューブを充填します。システムが完全にプライミングされ、すべての気泡が除去されるまで、リザーバーに培地を追加し続けます。
    注:流動実験中に気泡が細胞をせん断する可能性があります。
  15. リザーバーの上部に配置されたゴム製ストッパーに取り付けられたフィッティングを使用して、チューブをリザーバー入口(血管モールド出口から)に取り付けます(図10C)。
  16. 蠕動ポンプからフローシステムを取り外し、金属パンの上に置きます。セットアップ全体をBSCからインキュベーター(37°C、5%CO2)にそっと移送します。チューブをインキュベーターの背面から蠕動ポンプに供給します。
  17. 蠕動ポンプを再度取り付け、目的の流量に設定して、血管モデルを介して血流速度をエミュレートします。
  18. ポンプを始動し、漏れがないことを確認します。システムを24時間または希望の時間実行します。定期的に漏れがないか確認してください。

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図8:フローチップの構築。 フローチップの構築(A)細胞培養プレートから培地を吸引します。(B)培地が吸引された後、PDMSは半分になります。(C) チップの構築に必要な他の材料 (プラグ、シリンジ フィルター、1/2 インチ チューブ ピース、シリコン シーラント、10 本ネジ、アクリル ブロック) を使用して、PDMS の半分をプレートから取り除きます。(D)PDMSの半分をアクリルブロックに入れ、赤でマークされた場所にシリコーンシーラントを塗布します。(E)チューブをそれぞれの切り欠きに配置します。(F)フローチャンバーの半分を接続し、プラグとシリンジフィルターを取り付けます。BioRender.com で作成この 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図9:フローシステムのセットアップ。 フローシステムのセットアップ。完全なフローシステムは、チューブ、チューブコネクタ、蠕動ポンプ、シリンジリザーバー、サポートスタンド、およびフローチップを使用して構築されています。BioRender.com で作成この 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図10:フローシステムのプライミング。 媒体によるフローシステムのプライミング(A)媒体なしのフローシステムの簡単なセットアップ。(B)シリンジリザーバーからゴム栓を取り外し、チューブが満たされ、リザーバーに20〜30 mLの余分な媒体ができるまで、培地を連続的に追加します。(C)HLMVEC培地でプライミングされたフローシステム。BioRender.com で作成この 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

6. 固定と染色

  1. 各PDMS血管系の半分をPBSで5分間洗浄します。血管部分全体を沈めるのに十分な量を追加します。
  2. プレートを傾けてPBSを流出させて血管系からPBSを吸引し、次に流出液を真空吸引します。
  3. PBS中の4%パラホルムアルデヒド(PFA)600 μLを各血管半分に加え、室温(RT)で20分間インキュベートします。
  4. 手順2の方法を使用して、PFA溶液を適切な廃棄物容器に吸引します。
  5. ステップ2の手順を使用して、固定細胞をPBSで3回、それぞれ5分間洗浄します。
    注: これらの洗浄液はそれぞれ、ホルムアルデヒド用の適切な廃棄物容器に廃棄してください。
  6. PDMS血管系の半分の端をきれいな3Dプリントプラグで塞ぎます。
  7. ブロッキングのためにPBS中の3%ウシ血清アルブミン(BSA)を調製します。
  8. 血管の半分に600 μLのブロッキング溶液を充填し、RTで30分間インキュベートします。
  9. プラグを取り外し、ブロッキング溶液を吸引します。
  10. 小麦胚芽凝集素(WGA)レクチンを3%BSA溶液中で結合ビオチン(一次抗体)で1:200希釈して調製し、GCX9を染色します。
  11. プラグを戻して血管系の端を塞ぎ、各血管半分に500 μLの一次抗体溶液を加えます。
  12. サンプルを室温で1時間インキュベートします。
  13. 以前に使用した技術に従って一次抗体を穏やかに吸引します。
  14. PBSで3回、それぞれ5分間洗浄します。
  15. WGAストレプトアビジン複合体(二次抗体)を3%BSA溶液中で1:500希釈して調製します。
  16. プラグを戻して血管系の端を塞ぎ、各血管の半分に500 μLの二次抗体溶液を加えます。
  17. 手順6.12〜6.14を繰り返します。
  18. 脈管系を完全に満たすために間隔をあけて30 μLの滴を分注することにより、DAPI封入剤を血管表面に追加します。
  19. PDMSにガラスカバーガラスを置き、血管チャネルを覆います。
  20. 透明なマニキュアを使用してカバーガラスの端をシールします。
  21. プレートを錫箔で覆い、イメージングまで4°Cで保存します。

7. イメージング

  1. 顕微鏡の電源を入れ、接続されたコンピューターでviewアプリケーションを開きます。
  2. 顕微鏡を開き、光を上げます。サンプルに合う適切なプラットフォームを取り付けます(汎用性の高いペトリ皿ホルダー)。
  3. サンプルを顕微鏡内のディッシュホルダーに置き、目的領域を対物レンズの上の中央に置きます。
  4. ライトを下げて顕微鏡の蓋を閉めます。
  5. 顕微鏡ソフトウェアで、[ 静止画像のキャプチャ] オプションを選択します。
  6. 試験片の種類を選択し、 多用途に使用してください。
  7. レンズセクションで適切な対物レンズを選択して、最適な視覚化を実現します。
  8. 顕微鏡ソフトウェアで、関心領域(ROI)に合わせて対物レンズの位置を調整します。
  9. オートフォーカスを選択すると、セルに大まかに焦点が合うはずです。
  10. 画像を完全に鮮明にするために、フォーカスを手動で調整します。
  11. 明るさと露出を調整して、細胞をより鮮明に視覚化します。
  12. ソフトウェアで マルチカラー と カラー をオンにします。
  13. CH設定で、 CH1フロアDAPI と CH2フロアGFPをオンにします。
  14. 各チャンネルの明るさを個別に調整して、画像を明確に視覚化します。
  15. 顕微鏡ソフトウェアで Z-Stack を選択します。
  16. 画像の最高平面に焦点を調整し、設定を選択して上限を設定します
  17. 画像の最下平面に焦点を調整し、設定を選択して下限を設定します
  18. 必要に応じてスライスの厚さを選択し、[ キャプチャの開始] を押して画像を撮影します。
    注:これらの画像は、さらに変更するために顕微鏡分析ソフトウェアにも出力されます。

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結果

流体シミュレーション層流定常状態研究の結果は、 図11に示すように、対照モデルと比較して、肺切除モデルの特定の分岐点でせん断応力の増加を示しました。プロトコルのステップ2.8で視覚化すると、赤い領域はせん断応力の高い領域を示し、青色の領域はせん断応力の低い領域を示します。

figure-results-1
図11:シミュレートされた関心のある領域。 肺切除モデル上の関心領域を可視化する流体シミュレーション(A)対照モデルの明るい青色の領域は、せん断応力の高い領域を示しています。(B)左側の肺切除モデルの赤い領域は、せん断応力が高い領域を示して...

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ディスカッション

血管モデリングは、探求のための重要な新しい分野です。正確な血管モデルの作成の成功は、組織工学と医薬品開発の分野を前進させる上で大きな期待を寄せています。この記事では、GCX 障害と肺切除後の合併症との潜在的な関連性を研究するために、肺切除術またはその他の血管系または形状をエミュレートするために利用できる OOC 血管系を生成するための新しい方法の概要を概説します。より広い規模では、この方法論は、形状やアテローム性動脈硬化症や動脈瘤などの他の疾患状態を調整することにより、他の血管系をエミュレートするためにも適用できます。

説明されているOOCシステムには、市場に出回っている他のOOCシステムに比べていくつかの利点があります。このシステムはシンプルな製造プロセスを使用し、OOCの代替品と比較して安価です。これにより、システムを簡単に適応させることができ、多くの異なる血管領域をモデル化して評価できる可能性が広がります。これらは、肺高血圧症、血管リモデリング、機械的ストレス、炎症、低酸素症に対する内皮反応など、肺血管系の生...

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開示事項

著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

著者は、ウスター工科大学生物医学工学部の支援と指導に深く感謝したいと思います。この研究の質と実行可能性を大幅に向上させたミーガン・ウエレット氏、ジョン・マーテル氏、スディッシュ・ヴェンガット氏の協力的な取り組みと革新的なアイデアに特別な感謝を申し上げます。さらに、サマンサ・コッキアーロ氏とウダヤ・ラタン氏の研究室での貢献と重要なサポートと支援に感謝したいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
#8-32 x 3/4インチコンボ丸頭亜鉛メッキ小ねじ( 8 パック)エバービルト204274613-
0.25%EDTA-トリプシンサーモフィッシャーサイエンティフィック25200056 -
15mL円錐形滅菌ポリプロピレン遠心分離管サーモサイエンティフィック12-565-269-
35x10mmディッシュ、Nunclon Deltaサーモサイエンティフィック153066-
50mL円錐形滅菌ポリプロピレン遠心分離管サーモサイエンティフィック12-565-271-
各種ゴム栓フィッシャーブランド14-132
BioLite細胞培養処理フラスコ(25cm^2)サーモサイエンティフィック12-556-009-
BioLite細胞培養処理フラスコ(75cm ^ 2)サーモサイエンティフィック12-556-010-
COMSOL マルチフィジックスコンソル該当なし-
両面接着剤 3メートル16758005-
エプレディア リチャード アラン サイエンティフィック カバー ガラス サーモサイエンティフィック22-050-218-
ウシ胎児血清サーモフィッシャーサイエンティフィック A5256701 -
フィブロネクチンサーモフィッシャーサイエンティフィック 33016015 20 & ムー;g/mL希釈
フィッシャーブランドIsotempデジタル制御ウォーターバス:モデル210フィッシャーブランド15-462-10Q-
フィッシャーブランド滅菌シリンジ (60mL)フィッシャーブランド14-955-461-
ヒト肺微小血管内皮細胞シグマ・アルドリッチ540-05A -
キーエンス BZX810 蛍光顕微鏡キーエンス該当なし-
Krayden Dow Sylgard 184 シリコンエラストメーターキット。クリア、(1.1LB)ダウ4019862-
Marga Cipta キャスト アクリル シート 厚さ 1/2 フィート、48x96 フィートマルガ・チプタ該当なし-
Masterflex L/S Easy-Load II ポンプヘッドマスターフレックス77200-50
Masterflex L/S 精密ポンプ チューブ、プラチナ硬化シリコン、L/S 16;25フィートマスターフレックス96410-16-
Masterflex L/S 標準蠕動ポンプマスターフレックス07522-20
マイクロピペット 0.2〜2 &LフィッシャーブランドFBE00002-
マイクロピペット10〜100&μ;LフィッシャーブランドFBE00100-
マイクロピペット 100 から 1000 &LフィッシャーブランドFBE01000-
マイクロピペット5〜50&μ;LフィッシャーブランドFBE00050-
微小血管内皮細胞増殖培地(500ml)シグマ - アルドリッチ111-500-
Nalgene滅菌シリンジフィルターサーモサイエンティフィック725-2520-
ニコン Eclipse TS-100 蛍光顕微鏡ニコンNI-TS100
リン酸緩衝生理食塩水(DPBS、10X)、ダルベッコの処方サーモサイエンティフィックJ61917です。K3-
Prusament PLA Prusa Galaxy Black 1kgプルサPRM-PLA-GLX-1000-
Rebelハイブリッド顕微鏡、正立および倒立、Echoの発見エコー76376-746-
シリコーンシーラント ロックタイト908570-
ソリッドワークスダッソー・システムズ該当なし
滅菌ポリスチレンディスポーザブル血清ピペット、拡大鏡ストライプ付き( 10mL )フィッシャーブランド13-678-11E-
拡大鏡ストライプ付き滅菌ポリスチレンディスポーザブル血清ピペット( 25mL )フィッシャーブランド13-678-11-
拡大鏡ストライプ付き滅菌ポリスチレン使い捨て血清ピペット( 50mL )フィッシャーブランド13-678-11階-
拡大鏡ストライプ付き滅菌ポリスチレン使い捨て血清ピペット( 5mL )フィッシャーブランド13-678-11D-
ストレプトアビジン、Alexa Fluor 488 複合体インビトロジェン S32354
ストレプトアビジン、Alexa Fluor 488 複合体インビトロゲンS32354-
シリンジ resevoir BDの300865
Thermo Scientific Alfa Aesar 1LT アルブミン、ウシ、フラクション V、35% ソルン、試薬グレード、脂肪酸フリー、アジドを保存サーモサイエンティフィックN12H004-
チューブコネクタフィッシャーブランド01-000-161-
VECTASHIELD退色防止封入媒体(DAPI 付き);ベクタシールドH-1200-10-
VWR ウォータージャケット付き CO2 インキュベーターアバンタル 10810-744 -
WGAビオチン化抗体ベクトルB-1025-

参考文献

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