方法論記事

1分子磁気ピンセットを用いたテロメアタンパク質-DNA相互作用の解析

DOI：

10.3791/67251

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2024年8月30日

 ,  , 
1State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology, College of Pharmacy, Nankai University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、テロメアDNA結合タンパク質(テロメア反復結合因子1 [TRF1]およびTRF2)とヒト細胞から抽出された長いテロメアとの間の相互作用を研究するために、単一分子磁気ピンセットを使用する方法を示しています。テロメアとテロメア反復結合因子の準備手順、1分子実験の実行、データ収集と分析の方法について説明します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

染色体の末端にある保護構造であるテロメアは、細胞の寿命とゲノムの安定性を維持するために重要です。それらの適切な機能は、複製、伸長、および損傷応答の厳密に制御されたプロセスに依存します。シェルタリン複合体、特にテロメア反復結合因子1(TRF1)とTRF2は、テロメア防御において極めて重要な役割を果たしており、創薬の潜在的な抗がん標的として浮上しています。これらのタンパク質は、反復テロメアDNAモチーフTTAGGGに結合し、保護構造の形成と他のテロメアタンパク質の動員を促進します。構造的手法と高度なイメージング技術により、テロメアタンパク質-DNA相互作用に関する知見が得られてきましたが、その動的プロセスを解明するには、1分子のアプローチが必要です。磁気ピンセット、光ピンセット、原子間力顕微鏡(AFM)などのツールを使用して、テロメアタンパク質-DNA相互作用を研究し、TRF2依存性DNAの歪みやテロメラーゼ触媒などの重要な詳細を明らかにしています。しかし、テロメア反復モチーフを用いた単一分子コンストラクトの調製は依然として困難な課題であり、単一分子の機械的手法を利用する研究の幅が限られる可能性があります。これに対処するために、私たちは磁気ピンセットを備えた完全長ヒトテロメアDNAを使用して相互作用を研究する方法を開発しました。このプロトコルでは、TRF2の発現と精製、テロメアDNAの調製、単一分子メカニカルアッセイの設定、およびデータの分析の方法について説明します。この詳細なガイドは、テロメア生物学およびテロメア標的創薬の研究者に役立ちます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

テロメアは、染色体1,2,3の末端にある保護構造です。細胞分裂中のテロメアの侵食は細胞の老化と老化につながり、テロメアの異常な伸長はがんの一因となります4,5。テロメアが適切に機能するためには、その複製、伸長、および損傷応答を高度に制御する必要があります6,7,8。シェルタリンは6つのサブユニットで構成され、テロメア保護において中心的な役割を果たしています9,10,11。テロメアをより深く理解することで、テロメアの生物学に関する貴重な洞察を得ることができます。

TRF1およびTRF2は、シェルタリンのコアサブユニットであり、テロメア結合タンパク質である12,13。TRF1とTRF2はどちらも、Mybドメイン14を介してテロメアの反復DNAモチーフTTAGGGに結合します。それらは、それらの共有TRFHドメインを通じて二量体を形成し、これにより、テロメア二本鎖DNAを取り囲み、テロメアタンパク質15,16,17,18,19をリクルートすることができる。TRF2は、テロメアDループおよびTループの形成に特に重要である20,21。テロメア保護におけるそれらの重要な役割のために、TRF1およびTRF2は、潜在的な抗がん剤標的として浮上している22,23,24,25。

テロメアでのタンパク質-DNA相互作用の調査には、多大な努力が払われてきました。電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)や表面プラズモン共鳴(SPR)などの生化学的方法を使用して、結合親和性を調べている20,26。DNAと複合体を形成したテロメア結合タンパク質の多数の構造は、クライオ電子顕微鏡(クライオ電子顕微鏡)、X線結晶構造解析、および核磁気共鳴(NMR)を使用して解明されています27,28,29。確率的光学再構成顕微鏡(STORM)のような超解像イメージング技術により、TRF2依存性Tループ形成が明らかになった21。最近、ナノポアシーケンシングが開発され、テロメア配列4,30,31をプロファイリングしています。これらの構造的知見により、テロメアタンパク質-DNA相互作用の理解が大幅に向上しました。テロメアタンパク質-DNA相互作用のダイナミクスをさらに探求するためには、新しい技術の開発が不可欠です。

単一分子ツールは、テロメア32,33,34でのタンパク質-DNA相互作用を探索するための強力な技術です。磁気ピンセット、光ピンセット、AFMなどの単一分子の機械的方法が、TRF2依存性DNAの歪みを調査し、TRF2を介したヒトテロメアクロマチンの柱状スタッキングを明らかにし、プロセシブテロメラーゼ触媒作用を観察するために採用されてきました35,36,37,38,39,40.これらの方法は、トポロジカルコンフォメーションや、タンパク質-DNAの会合と解離の動力学を調べるのに特に有用です。

しかし、テロメア反復モチーフを用いた単一分子コンストラクトの調製には依然として課題があり、単一分子の機械的手法を用いた研究は限られています。この制限に対処するために、我々は、完全長ヒトテロメア41上の全球的なタンパク質-DNA相互作用を研究するための単一分子の力学的方法を開発しました。この方法は、ヒト細胞からテロメアDNAを直接抽出するため、手間のかかる人工テロメアDNAの調製を回避できます。これにより、数キロベースに及ぶ長い天然テロメアの動力学的過程の研究が容易になります。

このプロトコルでは、一般的な単一分子の機械的ツールである磁気ピンセットを使用してテロメアタンパク質-DNA相互作用をプローブするためのステップの詳細な説明を提供します42,43,44。TRF2を例に、テロメアタンパク質の発現・精製方法や、ヒト細胞からテロメアDNAを作製する方法を示します。さらに、テロメアタンパク質-DNA相互作用を研究するための磁気ピンセットでの単一分子アッセイの設定方法を示し、その後の単一分子実験のデータ解析についても説明します。このプロトコルは、テロメア生物学およびテロメア標的創薬の分野の研究者に利益をもたらします。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 一般的な材料と方法

  1. このプロトコールで使用される塩、化学物質、抗生物質、酵素、抗体、および樹脂材料については、 材料ファイルの表 を参照してください。
  2. 冷泉港プロトコル45,46,47,48,49,50,51,52,53のレシピに従って、ルリア・ベルターニ(LB)液体培地、LB寒天培地、HEPES緩衝液、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、トリスEDTA(TE)緩衝液を準備します。
  3. pET28aベクター(Addgene)、原核細胞株、および真核細胞株(ATCC)を市販のソースから入手します。その後、実験室で連続的に培養し継代します。
  4. 大量の液体の場合は、120°Cで20分間オートクレーブします。少量の場合は、孔径が0.22μmの滅菌フィルターを使用してください。
  5. 溶液を最終容量にする前に、HClまたはNaOHを使用して溶液のpHを目的のレベルに調整します。
    注:磁気ピンセットはカスタムビルドでLabVIEW 2017の環境で動作しますが、1分子のデータ解析はMATLAB 2017 2,54,55で実行されます。
  6. 安全上の理由から、長袖の白衣、ニトリル手袋(または不浸透性で物質に耐性のある材料で作られた手袋)、安全メガネまたはゴーグル、つま先が閉じた靴を着用してください。

2. テロメアDNA結合タンパク質のタンパク質発現と精製

  1. 細胞培養を行い、タンパク質発現を誘導します。
    1. テロメアDNA結合タンパク質(図1A)(この場合はTRF2)のコード配列を、酵素消化およびライゲーションによりpET28aベクターに挿入し、SUMOを融合タグとして使用します。BamHIとHindIIIの制限部位の間に挿入すると、pET28a-SUMO-TRF2のプラスミドが得られます(図1B)。
    2. BL21(DE3)細胞をpET28a-SUMO-TRF2プラスミドで形質転換します。
      1. コンピテントBL21(DE3)細胞の50μLアリコートを氷上で解凍します。
      2. pET28a-SUMO-TRF2プラスミド(50 ngのDNAを含む)のDNA1 μLをコンピテントセルに添加します。ピペッティングを上下に動かさずに、穏やかに渦を巻いて混ぜます。
        注意: 渦巻きにしないでください。
      3. 混合物を氷上で30分間インキュベートします。
      4. ヒートショックの場合は、セル混合物をウォーターバスで42°Cで正確に45秒間加熱します。すぐに細胞を氷に2分間戻し、形質転換した細胞を安定させます。
      5. 950 μLの室温(RT)LB培地を細胞に加えて、回復を促進します。
      6. 形質転換細胞を37°Cで1時間インキュベートし、220rpmで振とうします。
      7. 形質転換混合物100 μLを、50 μg/mLのカナマイシン(85.8 μM)を含むLB寒天プレートに広げます。
      8. 播種した細胞を37°Cで一晩インキュベートします。 インキュベーション後、スターター培養物の接種に使用する異なるコロニーを選択します。
        注:プレート上のコロニーは、4°Cで最大2週間保存できます。
    3. 形質転換したBL21(DE3)細胞のコロニーをピックアップし、50 μg/mLのカナマイシン(85.8 μM)を添加した5 mLのLB培地で培養します。220 rpmで振とうしながら、37°Cで18時間インキュベートします。
    4. スケールアップするには、2 mLの一晩培養液を、50 μg/mLのカナマイシン(85.8 μM)を含む200 mLのLB培地に移します。600 nm(OD 600)の光学密度が0.6〜0.8に達するまで、220 rpmで振とうしながら37°Cでインキュベートを続けます。
    5. 培養物1 mLを非誘導対照サンプルとして取ります。
    6. 残りの培養物をイソプロピルβ-d-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)で最終濃度1 mMまで誘導し、20°Cで17時間インキュベートしてタンパク質発現を促進します。
    7. 5%スタッキングゲルと10%セパレーションゲルを用いてSDS-PAGEを行います。SDS-PAGEローディングバッファーでサンプルをロードし、SDS-PAGEを最初に100 Vで30分間、続いて120 Vで50分間Tris-Glycineバッファーで実行します。クマシーブルーで染色して、タンパク質の発現を視覚化します( 補足表1のレシピを参照)(図1C)。
      注: エクスプレッションが観察されない場合のトラブルシューティングについては、ディスカッションを参照してください。
  2. タンパク質を精製します。
    1. 細胞を4°C、8500 x g で10分間遠心分離して回収します。上清を捨て、ペレットを200mLのPBSで洗います。再度遠心分離し、上清を廃棄し、細胞ペレットを25 mLの溶解バッファー(20 mM HEPES、300 mM NaCl、20 mMイミダゾール、10%グリセロール、0.5 mM DTT、1 mMフェニルメチルスルホニルフッ化物[PMSF])に再懸濁します。
      注意: PMSFは腐食性で有毒であり、火傷を引き起こします。適切な防護服、手袋、目/顔の保護具を着用してください。
      注:すぐに続行しない場合は、-80°Cで凍結します。
    2. 5 μL の 100 mg/mL リゾチーム、5 μL の 1 U/μL DNase I、および 5 μL の 10 mg/mL RNase A を再懸濁細胞に加えます。
    3. 氷上で超音波処理を行い、250Wで1秒のバーストと2秒の一時停止、合計30分間行います。
    4. 38,000 x g、4°Cで40分間(30〜60分が許容されます)遠心分離し、0.22μmシリンジフィルターで上清をろ過します。
    5. 8.76 gのNaCl(最終濃度300 mM)と0.68 gのイミダゾール(最終濃度20 mM)を20 mM HEPES(pH 8.0)に溶解して、500 mLのNiカラム結合バッファーを調製します。0.22 μmフィルターで溶液をろ過します。
      注意:イミダゾールは危険であり、皮膚や目の炎症を引き起こす可能性があります。.また、胎児に害を及ぼす可能性もあります。目、皮膚、衣服との接触を避けてください。摂取したり吸い込んだりしないでください。フェイスプロテクションを含む個人用保護具を着用してください。
    6. 段階的な溶出のためにイミダゾール(100 mM、200 mM、300 mM、500 mM)の濃度を上げたNiカラム溶出バッファー(20 mM HEPES(pH 8.0)、300 mM NaCl)を調製し、すべてのバッファーが適切にろ過されるようにします。
    7. ろ過した上清を、結合バッファー(20 mM HEPES(pH 8.0)、300 mM NaCl、20 mM イミダゾール)中の予め平衡化したNiカラムにロードします。結合バッファーで洗浄し、調製したイミダゾールグラジエントでタンパク質を溶出し、それぞれ1mLの12のフラクションを収集します(図1C)。純度>95%のフラクションを組み合わせます。
    8. 溶出した6xHis-sumo-TRF2融合タンパク質の濃度をA280 で分光光度計で測定します。
    9. 1分子アッセイで使用するタンパク質については、製造元の指示に従って相撲プロテアーゼ(通常、融合タンパク質2 μgあたり0.125 Uのプロテアーゼ)を添加し、4°Cで一晩消化します。
    10. 相撲プロテアーゼ処理後、混合物をNiカラムに再度ロードして、未消化の融合タンパク質とHisタグ付き相撲タンパク質を結合させ、タグフリーのTRF2タンパク質を流します。フロースルーを収集します。
  3. タンパク質の濃度を測定し、タンパク質を保存します。
    1. 精製したTRF2タンパク質を30 kDaカットオフ遠心フィルターユニットで濃縮し、20 mM HEPES(pH 8.0)、150 mM NaCl、0.5 mM DTTを含む保存バッファーに交換して、イミダゾール濃度を150 mM未満に下げます。
    2. 容量が1mL未満になるまで、濃縮プロセスを繰り返します。
    3. SDS-PAGEによる各精製ステップのサンプルの分析により、タンパク質の純度と完全性を評価します(図1C)。
      注:アフィニティークロマトグラフィーは、タンパク質の精製、溶出サンプルの収集と洗浄、およびタンパク質の完全性の評価と品質管理を確保するためのSDS-PAGEの実施に使用されます。アフィニティークロマトグラフィーだけでは純度の要件を満たしていない場合は、サイズ排除クロマトグラフィーを使用してタンパク質の純度をさらに高めます。UV吸光度曲線は溶出画分の評価に役立ち、SDS-PAGEはタンパク質の完全性を検証し、プロセス全体で厳格な品質管理を保証します。
    4. グリセロールを最終濃度50%まで濃縮し、バッファー交換したタンパク質に添加して保存します。
    5. タンパク質を-80°Cで保存します。

3. ヒトテロメア制限フラグメントの調製

  1. ゲノムDNAを抽出します。
    1. フローチャート(図2A)に従って、1 x 107 細胞を1000 x g で3分間遠心分離し、上清を廃棄します。洗浄は、細胞を200 μLのPBSに再懸濁し、再度1000 x g で3分間遠心分離し、上清を捨てます。
    2. 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)、100 mM NaCl、100 mM EDTA、および 1% SDS を含むバッファー 760 μL を 1 x 107 細胞を含むチューブに加え、気泡を避けるためにピペッティングで穏やかに再懸濁します。
      注意: 渦巻きにしないでください。
    3. タンパク質を消化し、サンプル中のDNaseおよびRNaseを除去するには、プロテイナーゼKを最終濃度0.5 mg/mL(10 mg/mLのストック溶液40 μLに相当)まで添加します。チューブの底を軽くたたいて混ぜます(ボルテックスしないでください)。
    4. 37°Cで一晩インキュベートします。
    5. 265 μLの5.4 M NaClを添加します。チューブを毎分5回反転させて5分間混合し、次に氷の上に20分間置きます。
    6. 最高速度(例:16,900 x g)でRTで10分間遠心分離します。
    7. 上清を遠心チューブに移し、浮遊する脂質や沈殿物を避けて、等量のイソプロパノール(約750μL)を加えます。DNAは上清中にあります。
    8. チューブを5回反転させて混ぜます。遠心分離管内に沈殿するDNAのペレットの存在を視覚的に確認します。
    9. RTで最高速度で10分間遠心分離します。
    10. 上清を捨てます。遠心分離管を5回反転させて、DNAペレットを500μLの70%エタノールで洗浄します。
      注:ペレットはDNAです。
    11. 室温で最高速度(例:16,900 x g)で10分間遠心分離します。
    12. DNAペレットを残して、すべての上清を慎重に取り除きます。ペレットをRTで5分間自然乾燥させます。
      注:ゲノムDNAは溶解しにくくなる可能性があるため、過度に乾燥しないでください。
    13. DNAペレットを475 μLのTEバッファー(10 mM Tris-HCl [pH 8.0]、1 mM EDTA)に再懸濁します。チューブの底を軽くたたいてやさしく混ぜます。DNA調製時のRNAの消化には、10 mg/mL RNase A(最終濃度0.5 mg/mL)を25 μL加え、DNAペレットが完全に溶解するまで軽くたたいて混合します。
      注:DNAのせん断を防ぐために、ボルテックスは避けてください。
    14. DNAサンプルを4°Cで一晩インキュベートします。
    15. 等量のトリス飽和フェノール抽出を行う:500 μLのフェノールを遠心分離チューブに加え、ピペットで穏やかに混合し、最高速度で4°Cで10分間遠心分離します。
      注意: フェノールにさらされると、皮膚、目、鼻、喉、神経系に刺激を与える可能性があります。目、皮膚、衣服との接触を避けてください。摂取したり吸い込んだりしないでください。フェイスプロテクションを含む個人用保護具を着用してください。
      注:DNAは上部水相にあり、タンパク質は間相にあり、有機相は下部にあります。
    16. 3回繰り返します。DNAの上清(約280μL)を採取します。
    17. DNAサンプルの容量に応じて、3 M酢酸ナトリウム(最終濃度0.3 M、pH 5.2)の1/10容量(28 μL)と冷100%エタノールの2容量(616 μL)を加えます。遠心分離管を-80°Cに2〜3時間置きます。
    18. 最高速度(例:16,900 x g)で4°Cで10分間遠心分離します。 遠心分離前に凍結した場合は、溶液を氷上で解凍します。
    19. 上清を捨て、遠心分離管を反転させて70%エタノールで3〜4回洗浄します。4°Cで5分間最高速度で遠心分離します。
    20. エタノールを取り出し、ペレットをRTで5分間風乾させます。
    21. 100 μL の TE バッファーを加え、チューブを軽くたたいて混合し、4 °C で 2 時間放置して完全に溶解します。
      注:1%アガロースゲル上のゲノムDNAの完全性を調べます(図2B)。
    22. DNAを-20°Cで冷凍庫に保管します。少なくとも1年間は安定しています。
  2. ゲノムDNAの消化と修飾を行います。
    1. 4 μgのゲノムDNAを取り、1 μLのCviAII(10 U)、2 μLの10倍消化バッファー(レシピについては 補足表1 を参照)と組み合わせ、水を加えて総容量20 μLにします。
      注:FatIは、NEBによって廃止されたCviAIIを置き換えることができます。
    2. 前の混合物(20 μL)を入れた同じチューブに、1 μLのNdeI(20 U)、1 μLのMseI(10 U)、および1 μLのBfaI(10 U)を加えます。また、2 μLの10倍消化バッファーと15 μLの水を加えて、総容量を40 μLにします。37°Cで12時間インキュベートした後、すべての酵素を80°Cで20分間熱不活性化します。
      注:ゲノムDNAの消化は、Terminal Restriction Fragment(TRF)法を使用して調べることができます(図2C)。4つの制限酵素(CviAII、NdeI、MseI、BfaI)の組み合わせにより、ゲノムDNAが約800 bpの断片に消化され、テロメア下DNAの汚染が最小限に抑えられたTRFが得られます。
    3. ジゴキシゲニン修飾には、消化したゲノムDNAを40 μL取り、1 mM dATP(最終濃度0.08 mM)を4 μL、1 mMジゴキシゲニン-11-dUTP(最終濃度0.08 mM)を4 μL、Klenow Fragment(5 U)1 μL、100 mM DTT(最終濃度1 mM)0.5 μL、および10x消化バッファー1 μLを添加します。37°Cで12時間インキュベートした後、75°Cで20分間加熱してKlenowフラグメントを不活性化します。
    4. ビオチン標識には、ジゴキシゲニン修飾ゲノムDNA 12.5 μL(1 μg)を添加し、テロメア一本鎖オーバーハングに相補的な1 μMビオチン化テロメアプローブ(1 pmol)を1 μL追加します。611.5 μL の TE Li バッファー (10 mM Tris-HCl (pH 8.0)、1 mM EDTA、50 mM LiCl) を加えて 50 mM K イオンを 1 mM に希釈すると、総容量は 625 μL になり、それぞれ 39 μL のチューブを 16 本に分けることができます。
    5. サーマルサイクラーで75°Cで3分間加熱し、その後、25°Cに達するまで30秒ごとに温度を0.1°C下げます。
    6. DNAサンプルは-20°Cで少なくとも1年間保存します。

4. 磁気ピンセットでのテロメアDNAサンプル用フローセルのセットアップ

  1. 1分子アッセイ用のフローセルを作製します。
    1. 電動グラインダーを使用して、上部カバースリップ(厚さ2 mmの#0.2カバーガラス)の入口と出口として穴を開けます。
    2. カバースリップを洗剤で30分間超音波処理して清掃します。
    3. カバースリップを超純水で3回洗います。
    4. カバースリップをイソプロパノールで30分間超音波処理して清掃します。
    5. カバースリップを超純水で3回洗います。
    6. 15〜30分間の超音波処理により、超高純度でカバースリップを清掃します。
    7. カバースリップを窒素で乾かします。
      注:プロトコルはここで停止でき、洗浄されたカバースリップは後で使用するために保管できます。
    8. 底面のカバースリップ(穴なし)に20 μLの0.1%ニトロセルロースをコーティングし、リファレンスビーズ(20倍希釈、直径3 μm)を加えます。100°Cで4分間焼きます。
    9. メスを使用して、金属金型に従って2層のパラフィルムスペーサーをカットします。モールドは、カバーガラスと同じ寸法の長方形のアルミニウム合金ピースで、チャネルの切断を容易にするために中央がくり抜かれています。
    10. フローセルサンドイッチを組み立てます(図3A)。85°Cに加熱し、パラフィルムがチャネルを密閉するまで、2本の綿棒を使用してマッサージします。
    11. フローセルを抗体でコーティングします。70 μL の抗ジゴキシゲニン抗体 (0.1 mg/mL) をフローセルに直接注入します。RTで1時間放置します。
    12. フローセルを不動態化します。70 μLの10 mg/mL BSAを注入して、抗ジゴキシゲニン抗体を置換します。RTで12時間放置します。未結合の抗ジゴキシゲニン抗体は、厳密なフラッシングにより次のステップで洗い流されます。
      注:フローセルを4°Cで1〜2週間保存します。
    13. DNAを含まない5 μLの洗浄済みMyOne (10 mg/mL)(または5 μLの洗浄済みM270 (10 mg/mL))ビーズをフローセルにフラッシングし、非特異的結合を試験します。10分間放置した後、ワーキングバッファー(20 mM HEPES(pH 7.5)、100 mM NaCl、1 mM EDTA)を使用してビーズを洗い流します。1つの視野で表面に付着したビーズの数を数えます。適切に処理された表面には、ビーズがゼロまたは数個しか表示されません。
  2. テロメアDNAテザーをフローセル内で単離し、固定化します。
    1. M270ビーズ10 μL(10 mg/mL)または10 mg/mL MyOneを5 μL取り、50 μLのワーキングバッファー(20 mM HEPES [pH 7.5]、100 mM NaCl、1 mM EDTA)で磁石を使用して5回洗浄します。
    2. 消化したゲノムDNA500 ngを取り出し、1.5 mLの遠心チューブに入れます。DNAサンプルの上にすべてのビーズ(50 μL)を加えます。
    3. ピペッティングせずに、遠心分離チューブを数回静かにフリックして、ビーズとDNAサンプルを混合します。混合物を氷の上に1時間放置します。500 μLのワーキングバッファーで、磁石を使用してビーズを引き下げ、10分間隔で洗浄します。
    4. 30 μLのワーキングバッファーを使用してサンプルを再懸濁し、混合物をフローセルにロードします。30分間放置します。結合されていない磁気ビーズを洗い流します。
      注:テロメアDNAは、ジゴキシゲニン抗体とビオチンストレプトアビジンによって媒介されるアフィニティー相互作用を通じて、ボトムカバースリップと磁気ビーズの間につながれています(図3B)。
  3. 磁気ピンセットにフローセルを設置
    1. フローセルを70%エタノールで洗浄し、レンズティッシュを使用して表面を乾燥させます。洗浄したフローセルを下部サンプルホルダーに置き、ドライバーを使用して上部サンプルラックを静かに組み立てます。
    2. レンズオイルをフローセルの底面に一滴垂らし、対物レンズと整列させます。次に、サンプルホルダーを対物レンズの上に置き、ドライバーで固定します。
    3. 垂直に配置された5mm立方磁石のペアを選択します。マグネットホルダーを磁気ピンセットの光路のX軸に合わせ、イメージングします。
      注: これは重要なステップです。磁場の方向は整列しているため、マグネットホルダーの向きによって決まります。
    4. グラフィカルプログラミングソフトウェアを起動し、磁気ピンセットのコントローラーを接続します。視野を調整して、フローセルの下部にある参照ビードを配置し、対物レンズをわずかに調整して、参照ビードが明確な回折リングを示すようにします。
    5. 磁石をフローセルの上部まで下に移動します。
      注: これは重要なステップです。ビーズの回折パターンの急激な変化は、磁石がフローセルの表面に触れたばかりであることを示しています。この位置は、測定ゼロ点のオフセットと見なされます。
      注意: 磁石を慎重に下げ、大きなステップから始めて徐々に小さなステップに移します。フローセルに近づくときにフローセルが損傷しないように、0.1mm刻みで移動します。
    6. 磁石を最も高い位置まで持ち上げ、マグネットホルダーを取り外します。
    7. 廃液ボトルに接続されている蠕動ポンプをオンにし、液体を捨てます。100 μLの作業バッファーをインレットに加え、ペリスタルティックポンプの流量を100 μL/minに設定して、フローセルにバッファーを充填します。

5. 1分子磁気ピンセットを用いたテロメアの測定

  1. カメラをセットアップします。
    1. 輝度調整を行うCMOS (Complementary Metal-Oxide Semiconductor) カメラのグレースケールを 150 レベルに設定します。
    2. 関心領域 (ROI) のサイズを定義します。
    3. フレームレートを200Hzに設定し、露光時間を5000μsにします。
      注: これは重要なステップです。シャッターのデッドタイムがゼロに設定されていることを確認します。
    4. 磁石の位置を3cm(約8 pN)に移動し、ビーズへの対物レンズの焦点を調整します。
  2. ルックアップ テーブル (LUT) を確立します。
    1. 磁石を8pNに対応する位置に移動して、DNAにつながれた磁気ビーズをしっかりと伸ばします。
    2. LUTを200ステップ、ステップサイズを0.05μmに設定します。
    3. CMOSカメラを使用して、さまざまな位置で磁気ビーズのプロファイルをキャプチャし、LUTを確立します。
      注: これは重要なステップです。フローセルに固定されたポリスチレンビーズは、目的のビーズのドリフトを排除するための参照ビーズとして機能します。
  3. 1分子の機械実験を設計します。
    1. MATLAB でスクリプトを記述して、フォース ランプまたはフォース ジャンプ アッセイの運動運動を制御します。
      注: これは重要なステップです。このスクリプトは、マグネットの動きのコマンドをエンコードします。フォースローディングレートは、フォースランプアッセイのこのステップで設定されます。フォースジャンプアッセイのレベルと期間もここで決定されます(図4、補足ファイル1、補足ファイル2、および補足ファイル3)。
    2. スクリプトをグラフィカルプログラミングソフトウェアにインポートして、単一分子実験をテストします。
    3. 1分子実験の実行に必要な合計フレーム数を確認し、使用可能なメモリがこの要件を超えていることを確認します。
      注: データの保存には時間がかかるため、割り当てられたメモリが必要より少ない場合、データは失われます。
    4. 最大イメージング速度を確認して、同時に監視できるビーズの最大数を決定します。
      注:イメージング速度の制限を超えた場合、実験は終了します。
    5. フォースジャンプアッセイを例に、単一分子の機械実験を実行します。磁気ビーズに力が突然加えられ、磁気ビーズはこれらの力をDNA分子に伝達し、すぐにDNA分子を上に伸ばします。

6. 磁気ピンセットを用いたテロメア上のTRF1/2の測定

  1. フォースランプアッセイ
    1. TRF1を例にとると、10 nM TRF1 のうち 200 μL を低速流速 (30 μL/分など) でフローセルにロードします。TRF1がテロメアDNAに結合するまで30分間待ちます。
    2. フォース ロード レートが ±1 pN/s のフォース ランプ実験のスクリプトを選択します。
    3. データ ファイルに適切な名前を付けて、実験を実行します。データは、分析のために指定された宛先に保存されます(図5)。
      注:この実験中、力は0pNから17pNの間で直線的に増加および減少し、テロメアDNAを伸縮させ、TRF1/2によって媒介されるDNAループを切断します。
  2. フォースジャンプアッセイ
    1. フォースジャンプアッセイを実行するスクリプトを選択します。
      注:テロメアDNAを伸ばすために、たとえば、0 pNで40秒間の「Rest force」(Frest)、60秒間で2〜8 pNの範囲の「Test force」(Ftest)、10 pNで30秒間の「High force」(Fhigh)、20 pNで30秒間の「最大力」(Fmax)など、さまざまな力が加えられます。
    2. データ ファイルに適切な名前を付けて、実験を実行します。データは、分析のために指定された宛先に保存されます(図5)。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

図1Aは、原核細胞で発現可能な439アミノ酸と542アミノ酸からなるTRF1とTRF2の概略的なドメインと構造を示しています。TRF1の調製は、文献41に以前に記載されている。ここでは、TRF2の調製の包括的な説明と代表的な結果を提供します。図1Bは、大腸菌でTRF2を発現するために使用されるプラスミドマップを示しています。図1Bに示すように、大腸菌の誘導前後のTRF2発現を評価しました。精製およびタグ切断プロセスもSDS-PAGEを使用して分析しました(図1C)。このプロトコルに従って、両方のテロメア結合タンパク質、TRF1およびTRF2が大腸菌で首尾よく発現した。

テロメアDNAは、末端制限フラグメント(TRF)の形で、4つの制限酵素の組み合わせを使用してヒトゲノムから生成されます。図2Aに示すフローチャートに従って、ヒト細胞からゲノムを抽出しました。この酵素は、完全長テロメアDNAをそのまま残し、ゲノムDNAを選択的に消化するため、1分子アッセイの材料となります。私たちは、さまざまなヒト細胞株を使用してTRF DNA調製物を広範囲に試験してきました。図2Bに示すように、ゲノムDNAの完全性をアガロースゲル電気泳動を用いて調べました。その後、TRFは、テロメア反復配列TTAGGG(図2C)に相補的な蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いて、サザンブロッティングにより分析した。これは、他の場所で説明した方法に従って41,56。平均して、人間のTRFの長さは約数キロベースです。

1分子アッセイは、 図3Aに示すように組み立てられたフローセル内で行われます。ニトロセルロースコーティングが負に帯電したガラス表面を覆い、抗体吸着のための親水性マトリックスを提供します。BSA不動態化は、抗ジゴキシゲニン抗体に結合していないニトロセルロースマトリックスの領域をブロックします。鉄ナノ粒子を含まないポリスチレンビーズは、参照ビーズとして機能します。TRFテザーは、ニトロセルロースマトリックス上のジゴキシゲニン抗体と磁気ビーズ表面上のビオチン-ストレプトアビジンとの間の親和性相互作用によって形成されます(図3B)。TRF1またはTRF2はフローセルに導入され、自由拡散を介してTRF DNAテザーに結合します。磁気ピンセットは磁場を調節するために使用され、磁気ビーズに力を発生させてTRFテザーを伸ばしたり緩めたりすることで、タンパク質-DNA相互作用の探索を可能にします。

単一分子の機械的アッセイは、磁気ピンセットのモーターの動きを制御するスクリプトを開発することによって設計されています。フローチャートは、磁気ピンセットを使用した単一分子アッセイのためにMatLabでこのスクリプトを作成するための構造化されたアプローチを提供します(図4A)。磁石はZ軸に沿って0〜25mmの範囲で移動します。力は、磁石の位置に基づいて、磁石の形状に従って、文献54に記載されている方程式を使用して計算されます。特定の力負荷率に対して、磁石の位置と移動速度は、フォースランプアッセイの例(図4B-D)で示されているように、所望の力操作プロファイルを達成するためにMatLabで設計およびプログラムされます。

TRF1を例にとり、1分子磁気ピンセットを用いてテロメアのDNA-タンパク質相互作用を調べました。実験セットアップは、 図5Aに示すように、フォースランプアッセイとして構成でき、フォース-伸長曲線は、タンパク質-DNA相互作用の切断による伸張中にジグザグの特徴を示し、緩和中のトレースは、タンパク質媒介ループのないDNAファイバーを反映します。このセットアップは、 図5B、Cに示すように、フォースジャンプアッセイとして構成することもでき、特定の力の下でのタンパク質-DNA相互作用の伸長と持続時間を測定することができます。テロメアDNA-タンパク質複合体の解離速度論は、これらの測定から導き出すことができます(図5D)。さらに、DNA-タンパク質複合体におけるループの形成は、伸長の変化によって明らかにすることができます(図5E)。さらに、このテロメアDNA実験装置内でタンパク質濃度を滴定することができます。また、ヒト細胞由来のテロメアDNAの長さの不均一性により、様々な長さのテロメアにおけるループ形成メカニズムを調べることができます(図6)。

figure-results-1
図1:TRF1/2の発現と精製 (A)TRF1とTRF2のドメインアーキテクチャ。(B) 大腸菌でTRF2を発現するためのpET28a-SUMO-TRF2のプラスミドマップ。(C)発現および精製のさまざまな段階で得られたサンプルのSDS-PAGE分析。レーン1:IPTGによる誘発なし。レーン2:細胞溶解によって得られたIPTG誘導沈殿物。レーン3:細胞溶解後に得られたIPTG誘導上清。レーン4:Niカラムを流れます。レーン5:低イミダゾールバッファーで洗浄し、不純物タンパク質を除去します。レーン6:300 mMのイミダゾールを含むバッファーを使用した6xHis-SUMO-TRF2の溶出。レーン7:SUMOプロテアーゼ酵素によるSUMOタグの消化。レーン8:Niカラムによる再精製と、20 mMイミダゾールを含むバッファーによるTRF2の溶出(6xHisおよびSUMOタグ除去)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:末端制限フラグメント(TRF)の調製(A)ヒト細胞からのTRF調製のためのフローチャート。(B)5つのヒト細胞株に対する1%アガロースゲルを使用したゲノムDNAの完全性の検討。(C)5つのヒト細胞株についてサザンブロッティングによって行われたTRF分析。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-3
図3:単一分子メカニカルアッセイの調製(A)単一分子メカニカルアッセイ用のフローセルの調製を示すフローチャート。(B)磁気ピンセットを使用した単一分子メカニカルアッセイの概略図。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-4
図4:単一分子メカニカルアッセイの設計(A)フォースランプアッセイを実行するためのスクリプトを生成するためのフローチャート。(B)z軸に沿った磁石の移動プロファイル。(C)磁石の動きに対応する力プロファイル。(D)磁石の位置と結果として生じる力との間の相関関係。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-5
図5:テロメアDNA-タンパク質相互作用を1分子磁気ピンセットでプローブ (A)TRF1-テロメア相互作用を、20 mM HEPES(pH 7.5)、1 mM EDTA、および100 mM NaClを23°Cで含むバッファー中のフォースランプアッセイ(N = 10)でプローブした。 TRF1の濃度は10nMで、力負荷率は±1pN / sでした。適用されたフォースプロトコルは、Frest = 0 pN、Ftest = 2 pN - 8 pN、Fhigh = 10 pN、および Fmax = 20 pN でした。緩衝条件と温度条件は(A)と同じでした。(C)TRF1-テロメア相互作用は、TRF1濃度が10nMのフォースジャンプアッセイでプローブされました。(D)TRF1-テロメア複合体の解離速度論。テストされた力での解離率の対数(平均 ± SD、n = 206)は、Kramer-Bell-Evans モデル(赤の曲線と凡例の方程式)に従います。挿入図は、Ftest での平均解離時間 (<τ>) を示しています。(E)TRF1-テロメア複合体の破裂イベント時の伸長変化(ΔL)の分布。黒と赤の曲線はガウス近似を表します。この図は、Li et al.41の許可を得て修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-6
図6:テロメアでTRF1によって形成されるDNAループの数とサイズ。 (A)[TRF1]=20nMにおけるDNAループサイズ(ΔL)のテロメア長依存性。曲線はガウス近似を表します。(B)[TRF1]=40nMにおけるΔLのテロメア長依存性。(C)ΔLとテロメアあたりの破裂イベントの数Nとの相関。ゼロ次相関は r = -0.20 で、p < 0.001 (サンプル サイズ = 1496) です。(D)ΔLとNの間の負の相関を説明する可能なメカニズムを示す漫画で、TRF1がプライマリループドメインを持つ単一のテロメアを高次トポロジーに圧縮できることを示唆しています。この図は、Li et al.41の許可を得て修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:スクリプトを生成するためのMatLabコード.m このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル2:一定の力assay.txtのスクリプト。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル3:フォースランプassay.txtのスクリプト。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表1:レシピこのファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、単一分子レベルでのTRFの操作に磁気ピンセットを採用しています57,58,59。私たちは、磁気ビーズを利用して、ゲノムDNA断片からTRFを分離します。制限酵素消化後、TRFは磁気ビーズに結合し、ゲノムDNA断片から容易に分離することができます。このアプローチでは、磁気ピンセットを使用した操作が可能になり、透明度の問題によって制限される光ピンセットとは異なり、磁気ビーズを効果的にトラップできます。さらに、AFMは単一分子の操作に使用できますが、TRFを磁気ビーズから解離させ、マイカ表面とカンチレバーチップの間に固定するためには、追加のステップが必要です。対照的に、磁気ピンセットは、TRFの単一分子操作のためのより簡単で効率的な方法を提供し、これらの追加のステップの必要性を排除する41。

ゲノムDNAとTRFの完全性を維持することは非常に重要です。なぜなら、単一分子の操作は無傷のTRFに依存するからです。磁気ピンセットを使用して、タンパク質とDNAの相互作用を調べるためにTRFの両端を保持することで、TRFを伸ばしたりリラックスさせたりします。磁気ビーズの正確な力測定は、単一分子の機械的アッセイの基本です54。したがって、立方体の磁石は、磁気ピンセットでカメラの光路と平行または直交するように配置する必要があります(ステップ4.3.3の下の注)これにより、確立された式54,60に従って正確な3次元ビーズ位置記録が保証されます。磁石のオフセットは、磁石ビーズの位置とその結果生じる磁気ビーズの力を決定するために重要です。我々は、一貫性を保つために約0.2mmの厚さの#2カバーガラスを使用するか、または異なるカバーガラス54の方程式のオフセットを調整する。フレームレートは、タンパク質-DNA相互作用のダイナミクスを捉えるために不可欠であり、完全なビーズ移動データを得るためにはシャッターデッドタイムをゼロにする必要があります。スクリプトによってコード化された運動運動は、単一分子の機械的アッセイを設計する上で中心的な役割を果たします。荷重負荷率、力、持続時間などの重要なパラメータは、繰り返し設定および最適化する必要があります。1分子アッセイで使用されるタンパク質濃度は、タンパク質-DNA相互作用の研究に最適なレベルを決定するために広範な滴定が必要です。初期力試験は、力分光法を用いたフォースランプアッセイを使用して実行できますが、フォースジャンプアッセイは、関心のある力を一定レベルで評価します。

このプロトコルを適応させる際には、いくつかの課題に遭遇する可能性があります。大腸菌でTRF1またはTRF2が発現しない場合は、小規模な試験から始めて、細胞を溶解し、SDS-PAGEおよび染色でタンパク質を分析し、タグ特異的抗体を使用してウェスタンブロットで確認します。コンストラクトとプラスミドを検証して、突然変異、フレームシフト、または早期停止コドンのない正しいクローニングを確認し、大腸菌に対するプロモーターの適合性を確認する必要があります。発現を最適化するには、さまざまな大腸菌株(BL21(DE3)、Rosettaなど)を試験し、増殖温度(15-25°C)、誘導時間(2-16時間)、IPTG濃度(0.1-1 mM)を調整します。封入体は、超音波処理の前後に細胞ペレットを分析することによって対処する必要があります。コドンバイアスには、希少なtRNAを提供する株やコドン最適化に取り組む必要があります。さまざまな増殖培地(LB、TB、自動誘導)を試し、振とう速度と培養量を調整して曝気を改善します。毒性の問題については、厳しく制御されたプロモーターまたはコピー数が少ないベクターを使用し、グルコース(0.2%)を添加してリーキーlacプロモーターの発現を抑制します。適切な抗生物質選択によりプラスミドの完全性を維持し、細胞溶解法61,62を最適化することにより、完全なタンパク質放出を確保します。

単一分子アッセイでTRFテザーが見つからない場合、1つの可能性は、十分な初期ゲノムDNAが使用されていないことです。TRFと同等の500 ngのゲノムDNAを使用して、単一分子の機械的アッセイを設定してみてください。磁気ピンセットでTRFテザーを見つける際の永続的な問題は、ゲノムDNAの消化時間が過度に長いことが原因である可能性があります。スター活動を避けるために、消化手順を12時間未満に保ちます。さらに、テロメアDNAの一本鎖オーバーハングにG-四重鎖が形成されると、ビオチン標識オリゴヌクレオチドの磁気ビーズへの結合のためのアニーリングが阻害される可能性があります。これを防ぐには、カリウムイオンまたはナトリウムイオン濃度を1 mM未満に維持して、G-四重鎖の形成を回避し、単一分子セットアップでTRFテザーを形成する可能性を高めます。さらに、アニーリングステップ(ステップ3.2.5)中に加熱温度を上げると、G-四重鎖が不安定になり、ビオチン標識オリゴヌクレオチドのTRFへの結合が容易になります。

TRF1またはTRF2タンパク質の存在下では、TRF DNAテザーは、これらのタンパク質のテロメア上の結合部位が豊富にあるため、磁気ピンセットで引き伸ばすのが難しくなる可能性があります。タンパク質濃度を滴定することで、単一分子のメカニカルアッセイの最適なレベルを特定することができます。タンパク質-DNA結合親和性は、EMSAまたはSPRアッセイを使用して評価し、解離定数(Kd)を決定することができ、これにより、単一分子アッセイに適した濃度を知ることができます。

ゲノムDNAから生成されるTRFの量が限られているため、単一分子アッセイの効率が妨げられる可能性があります。そのため、1分子のデータの収集は、人工的に合成されたテロメアDNAコンストラクトを使用する場合に比べて時間がかかる場合があります。しかし、ヒトゲノムから直接供給されるテロメアを使用することには、一般的に細菌のプラスミドやPCR法で調製される人工テロメアDNAにはないいくつかの利点があります。1つの利点は、ヒトTRFの長さが不均一であるため、タンパク質-DNA相互作用におけるテロメアの長さ依存性を調べることができることです。一方、人工テロメアDNAは通常、長さが均一であり、さまざまな長さの人工テロメアDNAを生成するには、時間と労力がかかります。さらに、ヒトTRFには、修飾、突然変異、損傷などの天然マーカーを含む、細胞からの元の配列が含まれています。これにより、人工テロメアDNAでは不可能な生理学的または病理学的条件下でのタンパク質-DNA相互作用の研究が可能になります。

このプロトコルは、テロメアバイオロジーの分野における単一分子レベルの研究に不可欠であり、テロメアを標的とした創薬に利益をもたらす可能性があります。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、競合する金銭的利益またはその他の利益相反を宣言しません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究は、中国国家自然科学基金会 [Grant 32071227 to Z.Y.]、Tianjin Municipal Natural Science Foundation of China (22JCYBJC01070 to Z.Y.)、State Key Laboratory of Precision Measuring Technology and Instruments (Tianjin University) [Grant pilab2210 to Z.Y.]の支援を受けました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
抗ジゴキシゲニンロシュ11214667001
BfaINew England Biolab (NEB)R0568S
BSASigma-AldrichV900933
CMOS カメラ MikrotronMC1362
CviAIINew England Biolab (NEB)R0640S
DIG-11-dUTPJena BioscienceNU-803-DIGXL
DNA 抽出ソリューションG-CLONEEX0108
Dnase I, Rnase-Free, Hc EaThermo Fisher ScientificEN0523
dNTP mixtureNanjing Vazyme Biotech Co., Ltd (Vazyme)P032-02
DTTSolarbioD1070
Dynabeads M-270  ビーズサーモフィッシャーサイエンティフィック65305ストレプトアビジンビーズ
Dynabeads MyOne ビーズサーモフィッシャーサイエンティフィック65001ストレプトアビジンビーズ
エタノール天津 No.6 化学試薬工場1083
グリセロール北京 Hwrkchemical共。LtdSMG66258-1
イミダゾールSolarbioII0070
IPTGSolarbioI8070
イソプロパノール天津 No.6 化学試薬工場A1079
カナマイシンサーモフィッシャーサイエンティフィックEN0523
クレノウフラグメント (3′-5′ exo-)ニューイングランドバイオラボ (NEB)M0212S
LabView National Instrumentshttps://www.ni.com/en-us/shop/product/labview.htmlグラフィカルプログラミングソフトウェア 
LiClBide Pharmatech Co., Ltd (bidepharm)BD136449
LysozymeSolarbioL8120-5
MseINew England Biolab (NEB)R0525S
NaClShanghai AladdinC111533
NanoDropThermo Fisher ScientificSpectrophotometer
NdeINew England Biolab (NEB)R0111S
Ni NTAビーズ6FF常州Smart-Lifesciences Biotechnology Co.,LtdSA005025
ニトロセルロース膜ABclonal RM02801
PMSFSolarbioP8340
Proteinase KBeyotime Biotech Inc (beyotime)ST535-500mg
rCutSmart BufferNew England Biolab (NEB)B6004S
Rnase ASigma-AldrichR4875
酢酸ナトリウムSERVA Electrophoresis GmbH2124902
Sumo proteaseBeyotime Biotech Inc (beyotime)P2312M

参考文献

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