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方法論記事

遺伝子改変Tet-OnスパイキングHEK細胞におけるエレクトロポレーション誘発性活動電位生成の変化のモニタリング

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DOI:

10.3791/67257

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2024年9月6日

 ,  , 
1Faculty of Electrical Engineering, University of Ljubljana

この記事について

サマリー

in vitroでの興奮性細胞の応答を研究するために、このプロトコルでは、遺伝子操作されたテットオンスパイクHEK細胞の単純な興奮性細胞モデルでのエレクトロポレーションによる活動電位発生の変化、および関連パラメータの自動抽出による膜貫通電圧の変化の光学モニタリングについて説明します。

要約

神経細胞や筋肉細胞などの興奮性細胞は、急速に出現するエレクトロポレーションベースの治療の主要な標的となる可能性があります。しかし、主要な標的ではない治療法でも電気パルスの影響を受けることがあり、これが有害な副作用を引き起こす可能性があります。したがって、興奮性組織と非興奮性組織のエレクトロポレーションベースの処理を最適化するには、興奮性細胞、そのイオンチャネル、および興奮性に対する電気パルスの影響を in vitroで研究する必要があります。この目的のために、遺伝子操作されたtet-onスパイクHEK細胞の単純な興奮性細胞モデル上でのエレクトロポレーションによる活動電位発生の変化を光学的にモニタリングするためのプロトコルが開発されました。蛍光ポテンショメトリック色素を使用して、膜貫通電圧の変化を蛍光顕微鏡で監視し、細胞応答の関連パラメーターをMATLABアプリケーションを使用して自動的に抽出しました。このようにして、さまざまな電気パルスに対する興奮性細胞の応答と、励起とエレクトロポレーションの相互作用を効率的に評価できます。

概要

エレクトロポレーションでは、高電圧の電気パルスにより、他の方法では透過性が低い分子の原形質膜透過性が増加します1。エレクトロポレーションベースの技術は、今日、医学2、バイオテクノロジー3、および食品技術4のアプリケーションで広く使用されています。

神経細胞や筋肉細胞などの興奮性細胞は、心臓、脳、骨格筋5で急速に出現しているエレクトロポレーションベースの治療の主要な標的の一つです。さらに、主要な標的ではない治療でも電気パルスの影響を受けることがあり、痛み、筋肉のけいれん、神経損傷などの有害な副作用を引き起こす可能性があります6。つまり、電気パルスは興奮性細胞に電気刺激を引き起こす可能性があり、電位依存性イオンチャネルを活性化し、活動電位(AP)をトリガーします。しかし、より高い電界では、細胞の原形質膜が透過化され、細孔/欠陥を通る追加のイオン電流が発生します7。この追加のイオン電流は、励起とエレクトロポレーションの間の複雑な相互作用における細胞の興奮性に影響を与えます。したがって、興奮性組織と非興奮性組織のエレクトロポレーションベースの処理を最適化するには、興奮性細胞、そのイオンチャネル、および興奮性に対する電気パルスの影響を in vitroで研究する必要があります。

最近の研究8では、興奮性細胞のエレクトロポレーションを研究するための貴重なツールとして、Cohenらによって開発された遺伝子操作されたヒト胚性腎臓(HEK)細胞9,10を調査しました。これらの他の点では興奮性のない細胞では、興奮性に必要なナトリウムチャネルとカリウムチャネル(NaV1.5およびKir2.1)の最小限の補体が発現します。これらの細胞におけるKir2.1の発現は、ドキシサイクリン誘導性テットオンシステムによって制御されており、興奮性スパイキングS-HEK(NaV1.5およびKir2.1を含む)および非興奮性非スパイク性NS-HEK細胞(NaV1.5チャネルのみを含む)の2つの細胞変異体の確立を可能にします。これにより、同じ種類の細胞の興奮性変異体と非興奮性変異体に対する電気パルスの影響を比較することができます。単離された初代興奮性細胞、胚性または人工多能性幹細胞から分化した興奮性細胞、興奮性組織に由来する細胞株と比較して、S-HEK細胞には、取り扱い、培養、増殖が容易で、ナトリウムおよびカリウムチャネルが明確に定義されており、堅牢なAPを生成するなど、いくつかの利点があります8。

私たちは、蛍光電位差測定色素を使用して、異なる振幅の電気パルスによって引き起こされる膜貫通電圧(TMV)の変化を監視するためのプロトコルを設計しました。このようにして、エレクトロポレーションがS-HEK細胞のAP生成や、S-HEK細胞とNS-HEK細胞の両方でTMVの他の変化にどのように影響するかを調べることができます。簡単に言うと、S-HEKまたはNS-HEK細胞は2分ごとに100μsの電気パルスに1回さらされ、各パルスの塗布の周囲で蛍光の相対的な変化が約3秒間記録されます。印加されるパルスは電圧が上昇し、最初に細胞内のAPをトリガーし、より高い電界ではエレクトロポレーションをトリガーします。パルス印加間の2分間の間隔は、連続したパルスの累積的な影響を最小限に抑えながら、実験を細胞を劣化させない程度に短くするために選択されました。画像処理は、ポテンショメトリック色素の蛍光応答の関連パラメーターを抽出するために、カスタムMATLABアプリケーションを使用して自動化され、S-HEKおよびNS-HEK細胞のTMV(APおよびエレクトロポレーションによる持続的な脱分極)の変化を評価しました。

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プロトコル

1. 試薬の調製と細胞培養

  1. Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucoseに10%ウシ胎児血清、2 mMグルタミン、ペニシリン-ストレプトマイシン(ペニシリン100 U/mL、ストレプトマイシン100 μg/mL)、2 μg/mLピューロマイシン、5 μg/mLブラストシジン、および200 μg/mLジェネチシンを添加して、細胞培養培地を調製します。
  2. 137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、および1.8 mM KH2PO4、pH 7.4でリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を調製します。孔径0.22μmの滅菌メンブレンフィルターでろ過します。
  3. 2 mM KCl、125 mM NaCl、2 mM CaCl2、1 mM MgCl2、10 mM HEPES、30 mMグルコース、pH 7.3でチロード溶液を調製します。0.5 mM KCl、126.5 mM NaCl、2 mM CaCl2、1 mM MgCl2、10 mM HEPES、30 mMグルコース、pH 7.3で低カリウムチロード溶液を調製します。両方の溶液を、孔径0.22 μmの滅菌メンブレンフィルターでろ過します。
  4. 5 mgのポリ-L-リジンを含むバイアルに5 mLのPBSを加えて、1 mg / mLのポリ-L-リジンストック溶液を調製します。.
  5. 蒸留水で2 mg/mLのドキシサイクリンストック溶液を調製し、孔径0.22 μmの滅菌メンブレンフィルターでろ過します。
  6. 純粋なエタノールに4 mMのポテンショメトリック色素ElectroFluor630ストック溶液を調製します(100 nM - 73 μgの色素を含むチューブに25 μLの純粋なエタノールを加えます)。
  7. 遺伝子改変HEK細胞をT25フラスコで6mLの細胞培養培地で培養します8。培地の成分は光に敏感です。したがって、メディウムを光から保護し(ミディアムフラスコをアルミホイルで包みます)、暗い場所で通過を行います。
  8. 3 x 105 または5 x 105 細胞を新鮮なT25フラスコに播種することにより、3〜4日ごとに細胞を継代します。血球計算盤を使用して細胞をカウントします。マスターフラスコ内の細胞は、持続的なKir2.1発現に耐えられないため、ドキシサイクリンを添加していない非興奮性NS-HEK細胞として保持します。実験では、14未満の継代の細胞を使用してください。

2. サンプル調製

  1. カバーガラスチャンバースライドのポリ-L-リジンコーティング
    1. 2ウェルカバーガラスチャンバースライドの1ウェルにPBS1 mLをピペットで移し、滅菌済みの1 mg/mLポリ-L-リジン溶液10 μLを加えてピペットでよく混合します。
    2. 無菌条件で室温で1.5時間、層流フード内でインキュベートします。ポリ-L-リジンでPBSを取り外し、さらに洗浄する必要はありません。
  2. 細胞の播種
    1. 1.5 mLチューブ内の培養培地で1:10希釈のドキシサイクリンストック溶液を調製します。各ウェルについて、30 μL の 1:10 ドキシサイクリン希釈液 (3 μL のドキシサイクリンストック溶液と 27 μL の培地) が必要であり、実験ウェルの総数に応じて最終容量を調製します。
    2. T25フラスコから培地を取り出し、CO2 インキュベーター内の2.5 mLのトリプシン-EDTA溶液で細胞をトリプシン化し、37°Cで2分間過ごします。
    3. 2.5 mLの新鮮な培地を加え、ピペッティングで穏やかに細胞を表面から剥離します。細胞懸濁液をよく混合します。
    4. 血球計算盤で細胞をカウントし、懸濁液中の細胞の密度を決定します。
    5. 培養を確立するために必要なトリプシン処理細胞懸濁液の量を計算します。2日間培養の場合は2.5 x 105 細胞を播種し、3日間培養の場合はウェルあたり1 x 105 細胞を播種します。必要に応じて、セルの正確な数を調整します。
    6. 1470 μLから以前に計算した細胞懸濁液容量を差し引いて、培地の容量を計算します。残りの30μLは、1:10ドキシサイクリン希釈液の容量を表します。各ウェルの総容量は 1500 μL (細胞、ドキシサイクリン、および培地) です。
    7. 興奮性S-HEK細胞を含むサンプルを調製するには、計算された量の培地とトリプシン化細胞懸濁液を1つのウェルにピペットで移し、1:10ドキシサイクリン希釈液30μLを加えます。実験には長い時間がかかる(約40分)ため、2つのウェルチャンバーのうち1つのウェルのみを使用してください。チャンバーをCO2 インキュベーターに入れる直前に、穏やかにピペッティングしてよく混合します。
    8. 非興奮性NS-HEK細胞を含むサンプルを調製するには、計算容量の培地をウェルにピペットで移し、ドキシサイクリンを含まないS-HEK細胞の計算容量の90%を細胞懸濁液に加えます。NS-HEK細胞はS-HEK細胞よりもわずかに速く成長します。
    9. 実験の2〜3日前に、5% CO2 インキュベーターで37°Cのチャンバーをインキュベートします。ドキシサイクリンを含むサンプルの場合、このインキュベーション時間は細胞を興奮性にするのに十分です。
  3. セルのラベル付け
    1. 実験の前に、3 μLの電位差差色素ストック溶液を1.5 mLのチューブにピペットで移し、開いたチューブを室温で層流フードに放置して、エタノールを蒸発させ、電位差差色素を乾燥させます(約15分)。997 μLの冷温培地(4°Cの冷蔵庫から)をチューブに加え、染料を最終濃度12 μMまで溶解します。
    2. 培地をウェルから取り出し、1 mLの電位差測定色素溶液を細胞に加えます。4°Cで冷蔵し、20分間インキュベートします。
    3. 電位差測定用色素溶液を取り出し、チューブに保存して再利用します(1日で最大6回の連続実験が可能です)。
    4. 細胞をTyrode溶液で3回穏やかに洗浄し、最後の洗浄後、1mLの低カリウムTyrode溶液をウェルにピペットで入れます。

3. 電気刺激およびエレクトロポレーション

  1. パルス発生器をトリガーする顕微鏡システムからのTTL信号を使用した画像取得とパルス配信の同期を設定します。高電圧パルスの生成には、カスタムパルス発生器11 またはTTL信号で外部からトリガできる任意のパルス発生器を使用する。
    注:提示された実験構成では、LAS Xソフトウェアが画像取得に使用され、タイムラプス取得中に事前に選択した時間にTTL信号を送信するように構成できます。
  2. 直径0.8mm、内縁間距離5mmの平行Pt/Irワイヤー電極をチャンバーの底部に配置し、チャンバーを顕微鏡で固定します。
  3. 電極をパルス発生器に接続します。電圧プローブと電流プローブを使用してパルス発生器の出力をオシロスコープに接続し、実験中にパルスが正しく供給されたことを確認できるようにします。
  4. 明視野に細胞を集中させます。電極間のほぼ中央に位置するセルをイメージします。
  5. 40倍対物レンズを使用してタイムラプスモードで蛍光画像の最初の取得を開始し、視野全体の蛍光信号を記録します。カメラは、アクションポテンシャルの明確な時間経過(理想的には25フレーム/秒以上)を取得するのに十分な速度である必要があります。
    1. タイムラプスモードで80枚の画像を取得し、少なくとも25フレーム/秒で撮影して、活動電位のリアルタイム経過を解決します。画像取得の合計時間は約 3 秒です。画像取得時には、励起波長635 nm、露光時間10 msで細胞を照射し、約700 nmでの発光を検出します。この最初の取得では、パルスを適用しないでください - この取得は、その後の色素光退色の取得を修正するために使用されます。この取得後、2 分間待ちます。
      注:この実験では、27.8フレーム/秒、つまり36ミリ秒の周期を使用します。これは、タイムラプス録画での最初の画像取得の開始から次の画像取得の開始までの時間です)。
  6. 2分ごとに、手順3.5と同じ方法でタイムラプスを記録します。これらの取得では、10番目の画像の取得時(324ミリ秒)に100μsのパルスを1回印加します。63 V、75 V、88 V、100 V、125 V、150 V、175 V、200 Vのパルス電圧で画像を取り込み、セルがさらされる電界を印加電圧と電極の距離比(E = 126、150、176、200、250、300、350、400 V/cm)として推定します。
    注:低電界では、パルスが活動電位をトリガーします。より高い電界では、それらはエレクトロポレーションを引き起こし、それは長期にわたる脱分極として現れます。細胞の各サンプルでの実験の所要時間は約40分です(標識に20分、顕微鏡に20分)。

4. データ分析

  1. タイムラプス録画をtiff形式にエクスポートします。
  2. 個々の実験中に印加されたすべての電圧(細胞の1つのサンプル)のタイムラプス記録を1つのフォルダに入れます。タイムラプス記録の名前を、MATLAB アプリケーションで電界 E が認識できる形式に変更します: Vcm (例: 126 V/cm の場合は 126Vcm)。名前の残りの部分は任意にすることができます。パルスが印加されない実験開始時の取得については、000Vcmというフレーズを使用して名前を変更します。タイムラプス録画の名前の例:2022_1_20 1DOX 000Vcm、2022_1_20 1DOX 126Vcm、2022_1_20 1DOX 150Vcmなど
  3. からダウンロードできるアプリケーションを開きます
    https://github.com/bor-kos/fluorescenceActionPotential。「データフォルダの選択 」をクリックして、1つの実験のタイムラプス録画を含むフォルダを選択します。
  4. さらにデータ分析に使用するピクセルを選択します。これを行うには、2 つのスライダーを使用して、メンブレンの鮮明な画像を得るための下限しきい値 (紫色) と、分析から破片 (蛍光性の高い大きなスポット) を排除するための上限しきい値 (緑色) を決定します。
  5. 「データの分析」を選択します。[分析] タブに、抽出されたパラメーターのテーブルが表示されます。表の右側には、使用した各Eの時間における相対蛍光のグラフが表示されます。テーブルの上の左側にあるドロップダウンメニューから、特定のEのグラフを選択します。
  6. すべてのグラフを調べ、偽ピーク検出の場合は手動補正を実行します。Analysisタブの下部にある Clear AUTO Peaks を選択すると、自動的に検出されたピークがクリアされます。 グラフ をクリックして、新しいピークタイムポイントを手動で決定します。
  7. [解析]タブの下部にある [Rerun AUTO Peak Detection ]を選択して、自動ピーク検出を再度実行します。抽出されたパラメータは、新しいピークに調整されます。
  8. [解析] タブの右下にある [データのエクスポート ] を選択して、使用する各 E の .mat ファイル、スプレッドシート ファイル、PNG 画像の形式で同じフォルダーにデータをエクスポートします。

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結果

電気パルスによって 誘発されるin vitro の興奮性細胞のTMVの変化は、このプロトコルで光学的に監視でき、蛍光信号を分析して関連するパラメータを抽出することができます。

実験のセットアップを 図1Aに示します。実験で使用される100μsの電気パルスの典型的な信号を 図1Bに示します。顕微鏡下に置かれたチャンバー内の細胞は、通常、 図1C (明視野画像)および 図1D (蛍光画像)の細胞のように見えます。2分ごとに、電圧が上昇する電気パルスを同じ細胞に印加する実験を行います。2分間のインターパルス時間は、特に顕著なエレクトロポレーションに関連する最大振幅のパルスを使用する場合、細胞膜の完全な再封止および回収を可能にするのに十分な長さではない可能性があることに注意してください。したがって、パルスの累積的な影響が予想されます。こ...

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ディスカッション

S-HEK細胞は、NaV1.5およびKir2.19という明確なナトリウムおよびカリウムチャネルを持つ単純な興奮性細胞モデルです。これにより、興奮性細胞が電気パルスの印加に対してどのように応答するかを深く研究し、S-HEK細胞で発現するチャネルのよく知られた理論的特性に基づいて、実験データを数理モデルと関連付けることができます。私たちの以前の研究8では、Eが増加する100μsパルスに対するこれらの細胞の応答を実験的および理論的に説明しました。Eが低いと、S-HEK細胞は単一または複数の活動電位で応答しますが、Eが高いと、APは延長され、持続的な脱分極に変わります。持続的な脱分極は、これらの細胞の非興奮性バージョン(NS-HEK)でもはっきりと見えるため、エレクトロポレーションとそれに伴う非選択的イオン電流の増加に起因します。

蛍光ポテンショメトリック色素の使用は、興奮性細胞のAP...

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開示事項

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

この研究は、スロベニア研究イノベーション庁(ARIS)の研究プログラムP2-0249、インフラストラクチャプログラムI0-0022、および研究プロジェクトJ2-2503の支援を受けました。この研究は、ARISとリュブリャナ大学がスタートアップ研究プログラムへの資金提供を通じて一部支援しました。この作業の一部は、プロジェクトMN-0023内のNextGenerationEUおよびNOOの資金提供を通じて、欧州連合とARISによって支援されました。この研究は、ERC Starting Grant(No.101115323-REINCARNATION)とMarie Skłodowska-Curieフェローシップ(No.893077-EPmIC)を通じて、欧州連合によって部分的に支援されました。ただし、表明された見解や意見は著者のものであり、必ずしも欧州連合または欧州研究会議の見解を反映するものではありません。欧州連合も付与機関も、それらに対して責任を負うことはできません。著者らは、テットオンスパイクHEK細胞を提供してくださったハーバード大学のAdam E. Cohen氏と、細胞培養研究室でのDuša Hodžić氏に感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.5 mLチューブRatiolab 5615000
2ウェルNunc Lab-Tek IIチャンバー#1.5ドイツカバーグラスシステムサーモフィッシャーサイエンティフィック 
ADP305 差動電圧プローブTeledyne LeCroy
AP015 電流プローブTeledyne LeCroy
Blasticidin サーモフィッシャーサイエンティフィック 
CO2インキュベーター PHCbi MCO -230AICUV
ドキシサイクリン シグマ・アルドリッチ/メルクD9891
ダルベッコのModifed Eagle's 中高グルコース増殖培地Sigma-Aldrich/MerckD5671
ElectroFluor630 (Di-4-ANEQ(F)PTEA)ポテンショメトリックプローブ31795
ウシ胎児血清Sigma-Aldrich/MerckF2442
GeneticinThermo Fisher Scientific 
グルタミンSigma-Aldrich/MerckG7513
層流フードIskra Pio MC 15-2
MATLABMathworks
ペニシリン–ストレプトマイシンSigma-Aldrich/MerckP07681
ポリ-L-リジン臭化水素酸塩 シグマ・アルドリッチ/メルクP9155-5MG  
パルス発生器 カスタムメイド参照11
PuromycinThermo Fisher Scientific 
T25 25cm²組織培養フラスコTPP 90026
Tet-on Spiking HEK cellsAmerican Type Culture Collection ATCCCRL-3479
Thunder Imager Live Cell system for fluorescence microscopyライカ マイクロシステムズ 
トリプシン-EDTA溶液Sigma-Aldrich/MerckT3924
WavePro 7300A オシロスコープTeledyne LeCroy
155379A111390310131035A1113803

参考文献

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  3. Kotnik, T., et al. Electroporation-based applications in biotechnology. Trend Biotechnol. 33 (8), 480-488 (2015).
  4. Mahnič-Kalamiza, S., Vorobiev, E., Miklavčič, D. Electroporation in food processing and biorefinery. J Memb Biol. 247 (12), 1279-1304 (2014).
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