in vitroでの興奮性細胞の応答を研究するために、このプロトコルでは、遺伝子操作されたテットオンスパイクHEK細胞の単純な興奮性細胞モデルでのエレクトロポレーションによる活動電位発生の変化、および関連パラメータの自動抽出による膜貫通電圧の変化の光学モニタリングについて説明します。
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この記事について
サマリー
要約
神経細胞や筋肉細胞などの興奮性細胞は、急速に出現するエレクトロポレーションベースの治療の主要な標的となる可能性があります。しかし、主要な標的ではない治療法でも電気パルスの影響を受けることがあり、これが有害な副作用を引き起こす可能性があります。したがって、興奮性組織と非興奮性組織のエレクトロポレーションベースの処理を最適化するには、興奮性細胞、そのイオンチャネル、および興奮性に対する電気パルスの影響を in vitroで研究する必要があります。この目的のために、遺伝子操作されたtet-onスパイクHEK細胞の単純な興奮性細胞モデル上でのエレクトロポレーションによる活動電位発生の変化を光学的にモニタリングするためのプロトコルが開発されました。蛍光ポテンショメトリック色素を使用して、膜貫通電圧の変化を蛍光顕微鏡で監視し、細胞応答の関連パラメーターをMATLABアプリケーションを使用して自動的に抽出しました。このようにして、さまざまな電気パルスに対する興奮性細胞の応答と、励起とエレクトロポレーションの相互作用を効率的に評価できます。
概要
エレクトロポレーションでは、高電圧の電気パルスにより、他の方法では透過性が低い分子の原形質膜透過性が増加します1。エレクトロポレーションベースの技術は、今日、医学2、バイオテクノロジー3、および食品技術4のアプリケーションで広く使用されています。
神経細胞や筋肉細胞などの興奮性細胞は、心臓、脳、骨格筋5で急速に出現しているエレクトロポレーションベースの治療の主要な標的の一つです。さらに、主要な標的ではない治療でも電気パルスの影響を受けることがあり、痛み、筋肉のけいれん、神経損傷などの有害な副作用を引き起こす可能性があります6。つまり、電気パルスは興奮性細胞に電気刺激を引き起こす可能性があり、電位依存性イオンチャネルを活性化し、活動電位(AP)をトリガーします。しかし、より高い電界では、細胞の原形質膜が透過化され、細孔/欠陥を通る追加のイオン電流が発生します7。この追加のイオン電流は、励起とエレクトロポレーションの間の複雑な相互作用における細胞の興奮性に影響を与えます。したがって、....
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プロトコル
1. 試薬の調製と細胞培養
- Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucoseに10%ウシ胎児血清、2 mMグルタミン、ペニシリン-ストレプトマイシン(ペニシリン100 U/mL、ストレプトマイシン100 μg/mL)、2 μg/mLピューロマイシン、5 μg/mLブラストシジン、および200 μg/mLジェネチシンを添加して、細胞培養培地を調製します。
- 137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、および1.8 mM KH2PO4、pH 7.4でリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を調製します。孔径0.22μmの滅菌メンブレンフィルターでろ過します。
- 2 mM KCl、125 mM NaCl、2 mM CaCl2、1 mM MgCl2、10 mM HEPES、30 mMグルコース、pH 7.3でチロード溶液を調製します。0.5 mM KCl、126.5 mM NaCl、2 mM CaCl2、1 mM MgCl2、10 mM HEPES、30 mMグルコース、pH 7.3で低カリウムチロード溶液を調製します。両方の溶液を、孔径0.....
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結果
電気パルスによって 誘発されるin vitro の興奮性細胞のTMVの変化は、このプロトコルで光学的に監視でき、蛍光信号を分析して関連するパラメータを抽出することができます。
実験のセットアップを 図1Aに示します。実験で使用される100μsの電気パルスの典型的な信号を 図1Bに示します。顕微鏡下に置かれたチャンバー内の細胞は、通常、 図1C (明視野画像)および 図1D (蛍光画像)の細胞のように見えます。2分ごとに、電圧が上昇する電気パルスを同じ細胞に印加する実験を行います。2分間のインターパルス時間は、特に顕著なエレクトロポレーションに関連する最大振幅のパルスを使用する場合、細胞膜の完全な再封止および回収を可能にするのに十分な長さではない可能性があることに注意してください。したがって、パルスの累積的な影響が予想されます。こ.......
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ディスカッション
S-HEK細胞は、NaV1.5およびKir2.19という明確なナトリウムおよびカリウムチャネルを持つ単純な興奮性細胞モデルです。これにより、興奮性細胞が電気パルスの印加に対してどのように応答するかを深く研究し、S-HEK細胞で発現するチャネルのよく知られた理論的特性に基づいて、実験データを数理モデルと関連付けることができます。私たちの以前の研究8では、Eが増加する100μsパルスに対するこれらの細胞の応答を実験的および理論的に説明しました。Eが低いと、S-HEK細胞は単一または複数の活動電位で応答しますが、Eが高いと、APは延長され、持続的な脱分極に変わります。持続的な脱分極は、これらの細胞の非興奮性バージョン(NS-HEK)でもはっきりと見えるため、エレクトロポレーションとそれに伴う非選択的イオン電流の増加に起因します。
蛍光ポテンショメトリック色素の使用は、興奮性細胞のAP.......
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開示事項
著者は、利益相反を宣言しません。
謝辞
この研究は、スロベニア研究イノベーション庁(ARIS)の研究プログラムP2-0249、インフラストラクチャプログラムI0-0022、および研究プロジェクトJ2-2503の支援を受けました。この研究は、ARISとリュブリャナ大学がスタートアップ研究プログラムへの資金提供を通じて一部支援しました。この作業の一部は、プロジェクトMN-0023内のNextGenerationEUおよびNOOの資金提供を通じて、欧州連合とARISによって支援されました。この研究は、ERC Starting Grant(No.101115323-REINCARNATION)とMarie Skłodowska-Curieフェローシップ(No.893077-EPmIC)を通じて、欧州連合によって部分的に支援されました。ただし、表明された見解や意見は著者のものであり、必ずしも欧州連合または欧州研究会議の見解を反映するものではありません。欧州連合も付与機関も、それらに対して責任を負うことはできません。著者らは、テットオンスパイクHEK細胞を提供してくださったハーバード大学のAdam E. Cohen氏と、細胞培養研究室でのDuša Hodžić氏に感謝しています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1.5 mLチューブ | Ratiolab | 5615000 | |
| 2ウェルNunc Lab-Tek IIチャンバー#1.5ドイツカバーグラスシステム | サーモフィッシャーサイエンティフィック | ||
| ADP305 差動電圧プローブ | Teledyne LeCroy | ||
| AP015 電流プローブ | Teledyne LeCroy | ||
| Blasticidin | サーモフィッシャーサイエンティフィック | ||
| CO2インキュベーター | PHCbi | MCO -230AICUV | |
| ドキシサイクリン | シグマ・アルドリッチ/メルク | D9891 | |
| ダルベッコのModifed Eagle's 中高グルコース増殖培地 | Sigma-Aldrich/Merck | D5671 | |
| ElectroFluor630 (Di-4-ANEQ(F)PTEA) | ポテンショメトリックプローブ | 31795 | |
| ウシ胎児血清 | Sigma-Aldrich/Merck | F2442 | |
| Geneticin | Thermo Fisher Scientific | ||
| グルタミン | Sigma-Aldrich/Merck | G7513 | |
| 層流フード | Iskra Pio | MC 15-2 | |
| MATLAB | Mathworks | ||
| ペニシリン–ストレプトマイシン | Sigma-Aldrich/Merck | P07681 | |
| ポリ-L-リジン臭化水素酸塩 | シグマ・アルドリッチ/メルク | P9155-5MG | |
| パルス発生器 | カスタムメイド | 参照11 | |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | ||
| T25 25cm²組織培養フラスコ | TPP | 90026 | |
| Tet-on Spiking HEK cells | American Type Culture Collection ATCC | CRL-3479 | |
| Thunder Imager Live Cell system for fluorescence microscopy | ライカ マイクロシステムズ | ||
| トリプシン-EDTA溶液 | Sigma-Aldrich/Merck | T3924 | |
| WavePro 7300A オシロスコープ | Teledyne LeCroy |
参考文献
- Kotnik, T., Rems, L., Tarek, M., Miklavčič, D. Membrane electroporation and electropermeabilization: Mechanisms and models. Ann Rev Biophys. 48 (1), 63-91 (2019).
- Yarmush, M. L., Golberg, A., Serša, G., Kotnik, T., Miklavčič, D. Electro....
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再版と許可
