方法論記事

ヒト好中球細胞外トラップ放出のリアルタイムハイスループット顕微鏡定量とアンタゴニストの薬理学の評価

DOI：

10.3791/67258

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2024年10月18日

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1Citryll B.V.

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この定義されたプロトコルは、 in vitroでヒト好中球の細胞外トラップ(NET)放出を視覚化および定量するためのリアルタイムのハイスループット顕微鏡アプローチを説明しています。再現性のある方法により、異なるNETosis誘導剤による刺激によるNET放出の特性と動態の調査が可能になり、NETosisアンタゴニストの薬理学の評価が可能になります。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

好中球は、NETosisと呼ばれるプロセスで好中球の細胞外トラップ(NET)を放出するなど、いくつかの戦略を用いて自然免疫防御に重要な役割を果たします。しかし、過去20年間で、組織へのNETの蓄積が複数の炎症性疾患および自己免疫疾患の病態生理学に寄与することが明らかになりました。そのため、NETosis拮抗薬の開発への関心が高まっています。NETosisを検出および分析するための可変および標準化されていない方法が同時に開発されましたが、それぞれに独自の利点と制限があります。ここでは、ヒトNETリリースを定量化するためのリアルタイム顕微鏡法について説明し、NETosisおよびNET阻害をハイスループットで研究することができます。表面積ベースの半自動分析では、NETsを認識し、NETsを非NETTING活性化好中球と区別します。非生理学的NETosis誘導剤であるカルシウムイオノフォアとホルボール-12-ミリスチン酸-13-アセテート(PMA)が、さまざまな特性と動態を持つNETの放出を引き起こすことを示しています。さらに、このアプローチにより、免疫複合体、N-ホルミルメチオニン-ロイシル-フェニルアラニン(fMLF)、尿酸ナトリウム結晶、ピロリン酸カルシウム結晶など、疾患関連刺激に応答したNET放出を研究できることを示します。NETosis拮抗薬の研究におけるこの方法の有用性を例示するために、NET放出のファースト・イン・クラスのモノクローナル抗体阻害剤であるCIT-013を使用しました。CIT-013は、シトルリン化ヒストンH2AおよびH4を標的とし、4.6nMのIC50 でNET放出を効率的に阻害します。試験した他の抗ヒストン抗体は、このNETosis阻害能力を欠いていました。全体として、このプロトコルにより、NETsの特異的で信頼性が高く、再現性のあるハイスループット定量が可能になり、NETosis拮抗薬のNET放出特性、動力学、薬理学の研究が強化されることを実証しています。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

好中球は血液中に豊富に存在し、感染や炎症の際に組織に移動します。彼らは、微生物から宿主を保護するために広範な兵器を使用することにより、自然免疫防御に重要な役割を果たします。好中球は、食作用、脱顆粒、活性酸素種(ROS)の生成、およびNETosis1と呼ばれるプロセスによる好中球細胞外トラップ(NET)と呼ばれる凝縮性クロマチンの放出を介して病原体を殺します。NETは、粒状タンパク質やカルプロテクチン2,3などで装飾されたクロマチンの細胞外構造であり、広範囲の分子4で刺激すると放出されます。NETosisは、NADPHオキシダーゼ依存性または非依存性の2つの主要な経路に大きく分類できます5,6,7。さらに、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ4(PAD4)によるN末端ヒストンテールのアルギニンシトルリン化は、NETosisと密接に関連しており、クロマチンの脱凝縮を促進し、最終的に脱凝縮したクロマチンの細胞外環境への排出につながります。

NET放出は病原体の排除に関与していますが、多くの研究により、異常で長期にわたるNET放出が、急性肺損傷8、関節リウマチ(RA)9、血管炎10、化膿性汗腺炎11などのさまざまな炎症性疾患の発症に関連していることが示されています。NETは炎症誘発性であり、自己抗原の供給源であり、周囲の組織に対して細胞毒性があり、免疫血栓症を引き起こし、破骨細胞の分化と骨侵食を促進するため、疾患におけるNETの有害な役割は多面的です9,12,13。低分子PAD4阻害剤によるNETosis経路の薬理学的阻害は、NETosisを標的とする治療薬が、NET蓄積が病因の重要な推進力である疾患の治療薬としての可能性を持っていることを示しています14。PAD4酵素を標的とする代わりに、ヒト化抗シトルリン化ヒストンモノクローナル抗体であるCIT-013を阻害するファーストインクラスのNETosisを使用しました。これは、シトルリン化ヒストンH2AおよびH4に特異的に結合します15。CIT-013は、NET放出を阻害し、マクロファージを介したNET食作用を増強するという独自の二重の作用機序を持っています16。CIT-013および前駆体分子は、NET関連炎症の複数のマウスモデルで治療効果を示しています17。

NET放出を研究するために、1)原形質膜不透過性DNAトレーサーと免疫蛍光プレートリーダーを組み合わせたDNA検出、2)上清中のDNAおよびNET特異的タンパク質とDNA複合体の酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)ベースの検出、3)免疫組織化学によるNET関連分子と細胞外DNAの共局在、など、長年にわたってさまざまな方法が開発されてきました。 4)ネット状の好中球を検出するためのフローサイトメトリーアプローチ。これらすべての方法には、それぞれに利点と制限があります。私たちは、原形質膜不透過性DNA色素16,18を使用して、ヒトNETリリースの顕微鏡定量のためのリアルタイムハイスループットアプローチを開発しました。記載されている方法により、NETosisの動態と特性を容易、信頼性、再現性のある方法で調査でき、CIT-013などのNETosisアンタゴニストの薬理学の評価が可能になります。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

すべての献血者は、ヘルシンキ宣言に従ってインフォームド コンセントを提供し、研究はヒト研究に関するシトリル倫理ガイドラインに従って実施されました。

注:ヒトの血液と単離された好中球を使用するすべての活動は、層流キャビネット内の無菌条件下で実行する必要があります。遠心分離のブレーキと加速の設定がプロトコルに記載されていない場合は、最大限に考慮できます。

1. 血液からの好中球の単離

  1. 健康なボランティアからリチウムヘパリンチューブで末梢血を採取し、新鮮な50mLチューブに血液を移します。
  2. リチウムヘパリンチューブを1x DPBSですすぎ、血液が移されたのと同じ50mLチューブに移します。最終的な血液と DPBS の比率が 1:1 であることを確認します。ピペッティングで血液とDPBSを混合し、均質な溶液を得ます。
  3. 13 mLの密度勾配溶液を別の新鮮な50 mLチューブに加え、密度勾配溶液の上に1:1で希釈した血液を最大50 mLまでゆっくりと(25 mLピペットで)加えます。
  4. 400 x g 、室温(RT)で40分間遠心分離し、加速とブレーキを最小限に抑えます。
    注:レイヤーが形成されます。上から下への層は次のとおりです:1.プラズマ;2.末梢血単核細胞(PBMC);3.密度勾配溶液;4.赤血球/好中球。
  5. まず、10mLピペットで血漿を廃棄し、次にPBMCと密度勾配溶液層をプラスチックパスツールピペットでできるだけ赤血球/好中球層を乱さずに廃棄します。
  6. 赤血球/好中球層を振とうして穏やかに再懸濁し、15mLの1x DPBSに25mLピペットで再懸濁します。
  7. 25 mLの6%デキストラン/0.9%NaCl溶液を加え、チューブを反転させて10倍混合し、チューブを直立させて室温で25分間セットします。
    注:レイヤーが形成されます。上から下への層は次のとおりです:1.好中球;2つの赤血球。
  8. 好中球層を10 mLピペットで新しい50 mLチューブに移し、500 x g およびRTで10分間遠心分離します。
    注:好中球ペレットにはまだ赤血球が含まれており、チューブにしっかりと付着していないため、注意してください。
  9. 上清をデカンテーションして廃棄し、10 mLのAmmonium-Chloride-Potassium(ACK)溶解バッファー(155 mM NH4Cl、10 mM KHCO3、および0.1 mM Na2EDTA、pH = 7.2)に10 mLのピペットで細胞ペレットを再懸濁し、すぐに40 mLのACK溶解バッファーを添加します。
  10. 溶液が半透明になるまでチューブを連続的に反転させながらRTでインキュベートし(これには1〜5分かかり、ドナーごとに異なる場合があります)、350 x g およびRTで10分間遠心分離します。
  11. 上清を取り除き、好中球ペレットの上に10%(v / v)熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、50 U / mLペニシリン、および50 μg / mLストレプトマイシン(以下、培地10%と呼ぶ)を補充したL-グルタミンを含む5 mLの培養培地を、好中球を懸濁液にせずにゆっくりと滴下します。.これにより、好中球ペレットからほとんどの赤血球が効率的に除去されます。
  12. 好中球ペレットの上に存在する赤血球のほとんどが培養液に10%再懸濁するまで、50 mLチューブを静かに渦巻かせます。その後、チューブをデカントして上清を取り除きます。
  13. 好中球ペレットを10 mLの培地10%に再懸濁し、完全に再懸濁したら、最大50 mLの培地10%を加えます。350 x g およびRTで10分間遠心分離します。
  14. 上清を取り除き、細胞ペレットを10 mLの培地10%に再懸濁します。

2. フローサイトメトリーによる純度確認のための好中球染色

  1. 細胞濃度を測定するには、好中球懸濁液を0.4%トリパンブルー溶液(比率1:1)で希釈し、明視野セルカウンターで好中球をカウントします。
    注:他のカウント方法も使用できます。
  2. 1 x 105 好中球を培地10%でV底96ウェルプレートのウェルに移し、400 x g およびRTで3分間遠心分離します。
  3. 上清を廃棄し、1% (w/v) ウシ血清アルブミン (BSA) および 0.1% (v/v) NaN3 (以下、蛍光活性化セルソーティング (FACS) バッファー) を含む Fc 受容体ブロック (50x 希釈) を添加した 1x DPBS 50 μL に細胞を再懸濁します。
  4. 室温で15分間インキュベートし、50倍希釈APC-Cy7標識マウス抗ヒトCD45抗体、600倍希釈したPerCP-Cy5.5標識マウス抗ヒトCD16抗体、133倍希釈FITC標識マウス抗ヒトCD66b抗体、および500倍希釈した固定可能生存色素eFluor 506を含むFACSバッファー50μLを加えます。
    注:CD45は白血球上に発現します。CD66bは顆粒球でのみ発現します。CD16は好中球で高発現し、好酸球で低発現し、好塩基球では発現しません。
  5. 暗所でRTで30分間インキュベートし、400 x g およびRTで3分間遠心分離します。
  6. 上清を捨て、好中球を175μLのFACSバッファーに再懸濁し、400 x g およびRTで3分間遠心分離します。
  7. 上清を捨て、好中球ペレットを175μLのFACSバッファーに再懸濁します。フローサイトメトリーシステムと関連ソフトウェアを使用してサンプルを解析します。

3. フローサイトメトリー解析ソフトウェアを用いた好中球純度解析

注:フローサイトメトリーデータの解析は、 資料表に示されているフローサイトメトリー解析ソフトウェアを使用して行いました。

  1. 次のステップバイステップの手順に従ってゲーティングを実行します。
    1. プロットで時間ゲートを設定します FSC-A 対 時間 適切なセルフローの領域を選択します。
    2. プロットSSC-AとFSC-Aのプロットでセルゲートを設定して、セルを選択し、破片を除外します。
    3. プロットFSC-AとAmCyan-Aのプロットで生細胞ゲートを設定して、生細胞を選択します。
    4. プロットFSC-AとAPC-Cy7に白血球ゲートを設定して、CD45+細胞を選択します。
    5. プロット FITC vs. PerCP-Cy5.5 で好中球ゲートを設定して、CD66b+CD16+ (好中球)、CD66b-CD16+ (好酸球)、CD66b-CD16- (好塩基球、単球、リンパ球) を区別します。
    6. プロット FSC-H vs. FSC-A で 1 つのセル ゲートを設定して、1 つの好中球を選択します。
    7. 好中球の純度を測定するには、単一の好中球を細胞の周波数(細胞ゲート内)として提示します。
      注:続行するには、好中球の純度が85%を超える必要があります。

4. ライブイメージング顕微鏡

注:このアッセイは、複数の96ウェルイメージングプレート、およびさまざまなNETosis刺激およびアンタゴニストに最適化されています。以下のプロトコルは、アプローチの一般的なビューを示しており、付属のテーブルを使用して指定できます。

  1. 0.01%ポリ-L-リジンを滅菌H2Oで1:10の比率で希釈することにより、0.001%ポリ-L-リジン溶液を調製します。
  2. 各ウェルに0.001%のポリ-L-リジン溶液を添加し、37°Cで少なくとも1時間インキュベートします。
    注:ウェルあたりの容量は、96ウェルイメージングプレートによって異なります(表1)。
  3. ウェルを200 μLのDPBSで3回洗浄し、余分なポリ-L-リジンを除去します。層流キャビネットですべての手順を実行します。プレートの蓋を取り外し、層流キャビネットでプレートを開いてウェルを乾かすまで(約1時間)風乾します。
  4. 実験に必要な好中球の数を計算し、余剰分を15mLチューブに移します。350 x g およびRTで10分間遠心分離します。
    注:各ウェルの好中球の量は、96ウェルイメージングプレートのタイプによって異なります(表1)。細胞密度は、個々の細胞を良好に分離できるように最適化されており、これは適切な分析に必要です。好中球密度が高すぎると、細胞やNETが隣接する細胞やNETと重なり合い、解析の品質に影響が出ます。
  5. 上清を廃棄し、2%(v / v)FBS、50 U / mLペニシリン、50 μg / mLストレプトマイシン、10 mM HEPES、および1 mM CaCl2 (以下、NETアッセイバッファーと呼びます)を添加したフェノールレッドを含まない培養培地に好中球を再懸濁します。
  6. 次の作業ソリューションを準備します。
    1. NET assay bufferで80 nM DNA色素を調製します。
    2. NETアッセイバッファーでNETosis刺激を調製します。
    3. NETosisアンタゴニストをNETアッセイバッファーで調製します。
      注:上記の作業溶液の濃度は、ウェルで必要な最終濃度の4倍であることに注意してください。NETosis刺激とNETosis拮抗薬の推奨濃度はさまざまです(表2 および 表3)。
  7. NETアッセイバッファー中の4倍濃縮DNA色素を各ウェルに加えます。
  8. NETアッセイバッファー中の4倍濃縮NETosis刺激を対応するウェルに添加し、刺激のないウェルまたはコーティングされた免疫複合体を含むウェルにのみNETアッセイバッファーを添加します(cIC;表2のプロトコール)。
  9. NETアッセイバッファー中の4倍濃縮NETosisアンタゴニストを対応するウェルに添加します。NETアッセイバッファーは、アンタゴニストを含まないウェルにのみ添加してください。
  10. 各ウェルに好中球懸濁液を添加します。
    注:4倍濃縮DNA色素、NETアッセイバッファー中の4倍濃縮NETosis刺激液、NETアッセイバッファー中の4倍濃縮NETosisアンタゴニスト、好中球の数、およびウェルあたりの好中球懸濁液の量は、96ウェルイメージングプレートによって異なります(表1)。ピペッティング時の気泡の形成を避けてください。
  11. プレートを100 x g およびRTで2分間遠心分離し、インキュベーターに設置した生細胞顕微鏡分析システムに96ウェルイメージングプレートを37°Cおよび5%CO2で挿入します。
    注:インキュベーションの最初の1分間に、96ウェルイメージングプレートの底部に結露が発生する可能性があります。これはティッシュで取り除く必要があります。

5. 取得用の生細胞顕微鏡解析システムソフトウェアの設定

注:位相差および免疫蛍光画像は、解析ソフトウェアによって制御される生細胞顕微鏡解析システムによって取得されました。

  1. 生細胞顕微鏡解析システムソフトウェアを開き、[デバイスに接続]をクリックします。ユーザー名とパスワードを入力します。「Schedule to acquire」をクリックし、プラスボタン(「Launch add vessel」)をクリックします。次に、「スケジュールに従ってスキャン」を選択し、「次へ」をクリックします。
  2. 新しいベッセルを最初から作成するには、[Create Vessel] セクションで [New] を選択し、[Next] をクリックします。「スキャン・タイプ」セクションで「標準」を選択し、「次へ」をクリックします。
  3. 次のスキャン設定を選択し、[ 次へ: セル単位: なし]をクリックします。 画像チャンネル:位相コントラスト と 緑 (取得時間 100ミリ秒)。 対物レンズ:20倍。
  4. 「 Vessel Selection 」セクションでスキャンする適切なタイプの容器を選択し、「 Next」をクリックします。
    1. 96ウェルプレート#1を使用する場合は 、Corning、プレート、96、N / A、3603、96ウェルコーニング(Blk / Wht)、マイクロプレートを選択します。
    2. 96ウェルプレート#2を使用する場合は、 Nunc、プレート、96、N / A、152028、96ウェルNunc opt bottom (Blk/Wht)、Microplatesを選択します。
  5. ドロワーで船舶の位置を指定し、[次へ]をクリックします。「スキャンパターン」セクションで、スキャンするウェルを選択し、ウェルごとの画像数を選択し(ウェルごとに4つの画像をスキャンして代表的な概要を取得します)、「次へ」をクリックします。
    注意: オートフォーカスに影響を与えるため、空のウェルを選択しないでください。
  6. 船舶に関する情報を提供するには、特に船舶ノートブックセクションにプレート名を挿入し、[次へ]をクリックします。「解析設定」セクションで「解析を後回しにする」を選択し、「次へ」をクリックします。
  7. 「スキャンスケジュール」セクションで、船舶のスキャンスケジュールを定義します。[新しいスケジュールをスキャン間隔で作成する] を選択し、[1 時間] を選択します。[スキャンの停止] を選択し、最初のスキャンから 00:05 時間後を選択します。「次へ」をクリックし、スキャン情報が正しい場合は「スケジュールに追加」をクリックします。
    1. スキャンスケジュールを編集する必要がある場合は、画面上部の スキャンスケジュール をダブルクリックします。スキャンスケジュール を右クリックし、必要に応じて編集および調整します。 フロッピーディスク アイコンをクリックして、スキャンスケジュールを保存します。
      注:同じ実験で複数の容器(プレート)をイメージングする場合、プラスボタン(Launch add vessel)をクリックし、 Scan on Scheduleを選択し、 Nextをクリックすることで、既存のスキャンスケジュールに容器を追加できます。新しい船舶を最初から作成するか(このプロトコルのステップ5.2を参照)、既存の船舶をコピーするか、以前にスキャンした船舶を使用します。これにより、前のプレートと同じ周波数と設定で連続スキャンが行われます。

6. ライブイメージング顕微鏡によるNETアッセイ解析

注:生細胞顕微鏡分析ソフトウェアを使用して、位相差および免疫蛍光画像を分析しました(材料表)。このシステムを使用しない場合、パブリックドメインのソフトウェアパッケージ4,18,19,20を使用して同様のNET解析を行うことができます。

  1. ライブセル顕微鏡解析ソフトウェアを開き、[デバイスに接続]をクリックします。ユーザー名とパスワードを入力し、[最近のスキャンを表示] をクリックします。解析する実験を開くには、実験の容器名をダブルクリックします。
  2. 「 分析の開始 」をクリックし、「 新規分析定義の作成」を選択します。 「次へ」をクリックします。
  3. 解析タイプセクションから 「基本アナライザ 」を選択し、「 次へ」をクリックします。 「イメージチャネル 」セクションで、「 緑」を選択し、「 フェーズ」の選択を解除して、「 次へ」をクリックします。
  4. 「イメージレイヤー」ウィンドウを開き、「緑」を選択して「フェーズ」の選択を解除します。緑のセクションで自動スケールをオフにし、緑のチャンネルの最小と最大を手動で設定して、NETを背景と区別します。
    注意: 位相差は、必要に応じてオンとオフを切り替えることができます。たとえば、NETが細胞外環境で排出されるかどうかを判断する場合です。
  5. 「Vessel Scan Times」ウィンドウを開き、NETが存在する必要がある適切な船舶スキャン時間を選択します。実験内の変動性を表す一連の画像を選択します(NETsのあるポジティブコントロールウェルからの画像とNETsのないネガティブコントロールウェルからの画像)。これらの画像は、解析のプレビューと調整に使用されます。「次へ」をクリックします。
  6. 「Analysis Definition Settings」ウィンドウを開き、ネット構造が偽陽性または偽陰性のネットを作成しないように、グリーンチャネルの解析設定の調整を開始します。次の設定を使用して、「現在のプレビュー」または「すべてプレビュー」をクリックして、現在の画像またはすべての画像にそれぞれ設定を適用します。
    1. [object name] で [ NETs] を選択します。
    2. セグメンテーションの場合は、[ 背景の減算なし - 適応] を選択します。
    3. 閾値GCUには、 3 から 5 まで選択します(実験によって異なります)。
    4. エッジ分割の場合は、[ オン](-10 から 0)を選択します。
    5. クリーンアップするには、[ 穴埋め]: 100 μm2 と [サイズ調整: -1 ピクセル] を選択します。
    6. フィルターについては、実験に応じて選択しますが、推奨されるカットオフ値は、面積: >200μm2、平均強度: <24.6、 積分強度: >7000です。
      メモ: 使用した設定に基づいて選択された構造は、マゼンタで輪郭が描かれています。これらの構造の上にマウスを置くと、オブジェクトのパラメーター(面積、偏心、積分強度、平均強度など)に関する詳細情報が表示され、NETパラメーターの包含基準または除外基準に関連する分析を最適化するのに役立ちます。複数の画像(ポジティブコントロールウェルとネガティブコントロールウェル)をチェックして、分析設定が正しいかどうかをテストします。
  7. NET 分析の設定が正しい場合は、[ 次へ] をクリックします。「スキャン時間とウェル」セクションで分析するタイムポイントとウェルを選択し、「 次へ」をクリックします。「解析定義の保存と適用」セクションに定義名を挿入し、「 次へ」をクリックします。解析情報が正しいことを確認したら、[ 完了 ] をクリックします。
    注:複数のプレートを分析する場合、または以前の実験の分析を使用する場合は、分析を開始し、[ 既存の分析定義をコピー ]または [既存の分析定義を使用 ]を選択し、[ 次へ]をクリックします。適切な既存の解析定義を選択し、[ 次へ] をクリックします。その後の解析手順では、[ 既存の解析定義をコピー ]を選択した場合は手順 6.4 に進み、[ 既存の解析定義を使用 ]を選択した場合は手順 6.7 に進みます。
  8. 目的の容器内の解析をクリックして、実験解析を開きます。 「グラフ・メトリック」 ウィンドウを開きます。
  9. プラスボタン(メトリックの作成)をクリックします。データは、NETコンフルエンシー(NETとマークされた画像領域の割合)またはネット好中球の割合(NETの数を細胞の数で割ったもの)として表すことができます。
    1. データを NET の密度としてパーセンテージで表示する場合は、[メトリック] セクションで [面積] を選択し、[値] セクションで [Confluence] を選択します。データをパーセンテージネット好中球として表示する場合は、[メトリック] セクションで [オブジェクト数] を選択し、[値] セクションで [画像ごと] を選択します。
    2. [OK] をクリックします。[ユーザー定義メトリック] セクションで [NETs Area Confluence (%)] または [NETs Object Count Per Image (Per Image)] を選択します。「Select Scans」セクションで、分析する必要のあるすべてのタイムポイントを選択します。「Select Wells」セクションで分析する必要のあるウェルをすべて選択し、「Export Data」をクリックします。
  10. [グラフのエクスポート]セクションで次の設定を選択します。
    1. [ 各スキャンを独自のテーブルとして表示] を選択します (列: 1、2...行: A, B...) です。
    2. [行と列のラベルを表示] を選択します。
    3. [1 つのファイル内のすべてのスキャン] を選択し、[参照] をクリックしてファイルの場所と名前を調整します。
    4. [ ヘッダーに実験の詳細を含める] を選択します。
    5. [データを個々の画像に分割] を選択します。
  11. [ エクスポート ] をクリックしてデータを「.txt」ファイルとしてエクスポートし、インポートしてスプレッドシートでさらに分析できます。
    注:ネット好中球の割合を決定するには、t = 0での好中球の数を決定する必要があります。これを行うには、プロトコルの次の手順に進みます。
  12. ステップ 6.1 に進み、t = 0 の画像の好中球数をカウントするために必要な追加の解析を開始します。
    1. 手順6.3で、[ フェーズ ]を選択し、画像チャネルセクションで [緑 ]の選択を解除します。
    2. ステップ6.4で、vessel scan timesセクションで t = 0 を選択します。
    3. 手順6.5で、[ Green]の選択を解除し、[ Phase]を選択し、必要に応じて [Phase Channel Settings ]を調整します。
    4. ステップ 6.6 で [オブジェクト名] を追加し、[セグメンテーション] セクションで [Classic Confluence] を選択し、セグメンテーション調整を 0 (バックグラウンド) に設定し、[穴埋め] を 100 μm2 に、[エリア] を 50 μm2 に調整します。
    5. ステップ 6.7 で、「スキャンの選択」セクションで t = 0 を選択します。
    6. ステップ 6.8 で、「 Neutrophil Count Analysis」を開きます。
    7. 手順 6.9 で、[ユーザー定義メトリック] セクションの [イメージあたりのオブジェクト数 (イメージごと)] を選択します。
    8. 最後に、次の計算を使用して、ネット好中球の割合を生成します: (ネットの数 / t = 0 の好中球の数) x 100%。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

リアルタイムのハイスループット顕微鏡法と不透過性DNA色素の組み合わせにより、NETosisの動態、特性、および基礎となる経路の研究が可能になり、NET放出の潜在的な阻害剤の評価が可能になります。このアプローチでは、NETは、健康な好中球の表面積と比較して有意に大きな表面積を持つDNA色素に対して陽性の構造として定義され(図1A)、クロマチンが細胞外環境に排出されたことを示している18。表面積ベースの分析により、NETと原形質膜の完全性が損なわれた活性化好中球を区別することができ、細胞内DNAの染色が明るいことが示されました(図1A)。

カルシウムイオノフォア(A23187)とPMAは、in vitroでNETosisを誘発するために一般的に使用されます。非生理学的刺激であるにもかかわらず、それらは明確なNETosis経路を活性化し、ドナー間のばらつきが少なく、一貫したNETosis誘導を保証するため、価値があります。A23187はカルシウムの流入を誘発し、PAD4の活性化とシトルリン化ヒストンに富むNETの放出をもたらし、PMAはNADPHオキシダーゼ複合体を活性化し、活性酸素種(ROS)の産生とその後の低レベルのシトルリン化ヒストン5,16,21のNETの放出をもたらします。NETosis応答の速度と大きさは、各刺激の濃度に依存し(図1B、C)、A23187はより速いNETosisを誘導し、PMAはNETを放出する好中球の割合を高くします(図1D-F)。A23187刺激から生じるNET(図1D、赤矢印)は、PMA誘導NET(図1D、黄色矢印)とは異なり、好中球原形質膜を超えて拡散し、PMA誘導NETは好中球原形質膜に隣接したままでした。さらに、A23187の刺激により、透過性の非ネット状DNA色素陽性好中球(図1D、青矢印)が得られ、DNAが細胞外空間に排出されませんでした。透過性の非ネット性DNA色素陽性好中球の検出は、A23187の濃度に依存しており(図1G)、NETosisを刺激するために使用されるPMAの濃度に関係なくほとんど存在しませんでした(図1D、H)。このアッセイは、非生理的なNETosis刺激A23187およびPMAを使用するだけでなく、NETosisの疾患関連トリガーの研究にも適しています。一例として、可溶性免疫複合体(sIC)またはピロリン酸カルシウム素因疾患(CPPD)に存在する結晶で活性化された好中球は、刺激がない場合と比較してNET放出が有意に増加しました。好中球がコーティング免疫複合体(cIC)、fMLP、および尿酸ナトリウム(MSU)結晶で活性化された場合、NETレベルの上昇傾向が観察されました(図1I)。しかし、これらの刺激については、ドナー間でかなりの変動が観察されました。

NETosis経路およびNETosis関連酵素の薬理学的阻害は、NETosisを標的とする治療薬が、NET蓄積が病理を有意に引き起こす疾患の効果的な治療法である可能性があることを示しました14,17,22,23,24。このリアルタイム顕微鏡NETアッセイは、NETosisアンタゴニストをハイスループットで研究するための、簡単で信頼性が高く、再現性のあるアプローチです。これを例示するために、シトルリン化ヒストンH2AおよびH4を高い親和性で標的とするファースト・イン・クラスのヒト化モノクローナル抗体CIT-013を使用しました15,16。A23187はNETosis経路を活性化し、その結果、シトルリン化ヒストンを含むNETが生成され、その後CIT-013によって標的とされ、NETosis阻害機能16が発揮されます。実際、A23187 に対する NET 放出は、CIT-013 (図 2A および補足ビデオ 1) によって完全に抑制され、IC50 は 4.6 nM (図 2B) でした。CIT-013のNETosis阻害能は、異なる(非)シトルリン化ヒストンを標的とする他の市販抗体がNET放出を阻害できなかったため、独特です(図2C)。

これまでに、CIT-013の非常に類似した前駆体分子(2つのアミノ酸が異なるが、類似のエピトープに等しい親和性で結合する)が、活性化血小板、痛風滑液、RA滑液などの生理学的刺激に応答してNETosisをブロックすることを示しました17。ここでは、sICによって誘導されるNET放出がCIT-013によって阻害されることを示しています(図2D)。この刺激によって誘発されるNETosisを阻害することの治療的関連性は、SLE、RA、およびその他の自己免疫疾患によって強調されており、血清または滑液中の自己抗体がICの形成をサポートし、NETosis25,26を引き起こします。

これらのデータを総合すると、このリアルタイムのハイスループット顕微鏡アプローチがNET放出の動態と特性の研究に適しており、NETosisの阻害剤の研究を可能にすることを示しています。この方法はヒト好中球の使用に最適化されていますが、変更を加えることで、他の種の好中球の研究にも適している可能性があります。このアッセイで得られたデータは、NETが原因の疾患に対する強力で効果的な治療法としてのCIT-013の理論的根拠の基礎となります。

figure-results-1
図1:NETリリースを研究するためのリアルタイムのハイスループット顕微鏡。健康なボランティアの血液から単離された好中球をA23187またはPMAで刺激して、NETosis経路をトリガーしました。NETリリースは、原形質膜不透過性DNA色素を用いたリアルタイムハイスループット顕微鏡で可視化し、生細胞顕微鏡解析システムソフトウェアで表面積に基づいて定量しました。(A)非刺激性の健康な好中球(灰色)、細胞外NETs、および細胞内DNA染色による透過性非ネット性好中球(緑)の表面積の解析。(B,C)示された A23187 または PMA 濃度 (n = 2) で刺激された好中球からの経時的な NET 放出の定量化。(D)A23187(赤矢印)とPMA(黄矢印)の異なる時点におけるNETリリースの代表的な画像。透過性の非ネット好中球の例は、青い矢印で示されています。(E)NETの合流性(n = 5)のパーセンテージとして表されるNETリリースの経時的な定量化。統計はt = 240分で行われました。(F)経時的なNET放出の定量化は、ネット好中球の割合として表されました(n = 2)。(G、H)示された A23187 または PMA 濃度 (n = 2) で刺激された好中球からの透過性非ネット好中球の経時的な定量化。(I)可溶性免疫複合体(sIC)、コーティングIC(cIC)、fMLP、尿酸ナトリウム(MSU)結晶、およびピロリン酸カルシウム素因疾患(CPPD)に存在する結晶(n = 8-28)によって誘導されるt = 240分でのNET放出の定量化。結果は、平均の平均±標準誤差として報告されます。**P < 0.01、および****P < 0.0001、反復測定の一元配置分散分析と Dunnett の多重比較検定 (B)、Kruskal-Wallis 検定と Dunn の多重比較検定 (I)。パネルA-Fは、van der Lindenらの許可を得て変更されています16。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:CIT-013はNETリリースを阻害します。 (A)CIT-013またはアイソタイプコントロール抗体(cIgG)の非存在下(Abなし)または存在下でのt = 240分でのA23187誘導NET放出の定量化。(B)t = 240分(n = 3)でのCIT-013によるA23187誘発性NET放出の用量依存的な阻害。データはcIgGに正規化されました(100%NETリリースとして設定)。(C)示された濃度のCIT-013、抗ヒストンH4抗体、抗シトルリン化ヒストンH3抗体#1、または抗シトルリン化ヒストンH3抗体#2の存在下でのt=240分でのA23187誘導NET放出の定量化(n = 6)。(D)CIT-013またはcIgGの存在下で可溶性免疫複合体(IC)によって誘導されるt = 240分でのNET放出の定量化。結果は、平均の平均±標準誤差として報告されます。P < 0.0001、テューキーの多重比較 (A) または両側のウィルコクソン一致ペアの符号付き順位検定 (D) を使用した一元配置分散分析の反復測定。パネル A、 B、 およびD は、van der Lindenらの許可を得て変更されています16。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

96ウェルプレート#196ウェルプレート#2
ウェルあたりの容量0.001%ポリ-L-リジン溶液50 μL100μL
ウェルあたりの好中球懸濁液の量50 μL87.5μL
ウェルあたりの好中球の数2 x 104 セル3.5 x 104 セル
ウェルあたりのNETアッセイバッファー中の4倍濃縮(= 80 nM)DNA色素50 μL87.5μL
ウェルあたりのNETアッセイバッファー中の4倍濃縮NETosis刺激50 μL87.5μL
ウェルあたりの NET アッセイバッファー中の 4x 濃縮 NETosis アンタゴニスト50 μL87.5μL

表1:さまざまな96ウェルイメージングプレート用に最適化された容量と細胞数。

濃縮作業液(4倍濃縮)最終濃度
カルシウムイオノフォア(A23187)50 μM12.5 μM
PMAの16 nM4 nM
fMLPの4 μM1 μM
尿酸ナトリウム(MSU)結晶400 μg/mL100 μg/mL
ピロリン酸カルシウム素因病(CPPD)結晶400 μg/mL100 μg/mL
可溶性免疫複合体(sIC)1. DPBS中の5 μg/mLヒト血清アルブミン(HSA)をDPBS中の282.5 μg/mLポリクローナルウサギ抗HSA抗体に添加します。
2. 37°Cで90分以上インキュベートします。
3. ボルテックスにより均質化し、50 μL sIC溶液を対応するウェルに加えます。
コーティング免疫複合体(cIC)1. 10 μg/mL HSAをDPBSに96ウェルプレートの対応するウェルで添加します。
2. 4°Cで一晩インキュベートします。
3. 200 μL 0.05% Tween-20 in DPBS(以下、PBS/0.05%Tween)でウェルを3回洗浄します。
4. PBS/0.05% Tween(以下、ブロッキングバッファーと呼ぶ)中の200 μL 1%(w / v)ウシ血清アルブミンでウェルをブロックします。
5. 室温で120分間インキュベートし、穏やかに攪拌します(400rpm)。
6. ウェルを200 μL PBS/0.05% Tweenで3回洗浄します。
7. ブロッキングバッファー中の50 μLポリクローナルウサギ抗HSA抗体を対応するウェルに加えます。
8. 室温で60分間インキュベートし、穏やかに撹拌します(400rpm)。
9. ウェルを200 μL PBS/0.05% Tweenで3回洗浄します。
10. 最後に、ウェルを200 μL DPBSで3回洗浄します。これで、ウェルはプロトコルのステップ4.7の準備が整いました。

表2:NETosis刺激の推奨濃度。

濃縮作業液(4倍濃縮)最終濃度
抗鶏卵リゾチーム抗体 (対照抗体; cIgG)80 nM20 nM
CIT-01380 nM20 nM

表3:NETosis拮抗薬の推奨濃度。

補足ビデオ1。 好中球は、cIgGの存在下でA23187で刺激され(左)、CIT-013の存在下で刺激され、原形質膜不透過性DNA色素を使用してNET放出を経時的に可視化しました。NET のリリースは、CIT-013 の存在下では禁止されます。この映画は、DNA色素(緑色)と位相差のオーバーレイです。このビデオは、van der Lindenらの許可を得て入手した16。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

2004年にNETが発見されて以来、in vitroでNETsの放出を実験的に調査するための多くの戦略が開発されてきましたが、免疫蛍光顕微鏡はNETosisを定量化するための最も一般的な手法です27,28。顕微鏡法はNETリリースを視覚化するのに便利ですが、固定された時点の画像の非自動顕微鏡定量化はかなり不正確であり、観察者バイアスに悩まされる可能性があるため、制限があります。NET放出の研究に使用される別の手法は、マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリー29,30であり、多数のネット好中球を測定し、偏りのない分析を採用していますが、NETosisの初期段階の好中球に焦点を当てており、NETsを放出した好中球を定量化していません。NETosisキネティクスに関する多くの研究では、DNA色素を使用して、蛍光プレートリーダー31と組み合わせてNET放出を定量化する。この手法は、細胞内DNA染色によりNETを活性化または死滅する好中球と区別できないため、NET放出の定量化やNETosis拮抗薬の研究には適していません。上記は、NETosisの研究に現在使用されているアプローチが価値がある一方で、限界があることを強調しています。

この研究で説明したリアルタイム顕微鏡法は、以前に報告された技術で見つかった多くの問題に対処します。偏りのない半自動のハイスループット、再現性、正確なNET定量を提供します。実際、このアプローチは、NETs18の引き伸ばされた形態のようなピペッティングアーチファクトを最小限に抑え、DNA放出18,32の明確な形態および動態を通じてNETosisを壊死およびアポトーシスと区別することができる。さらに、このアプローチは、NETs33の機能的および表現型的基準を満たす構造を生成するネクロトーティック好中球のNET形成など、制御された細胞死のためのさまざまな生化学的経路を研究する機会を提供します。

このプロトコルには、NETの定量を成功させるために従う必要のあるいくつかの重要なステップがあります。まず、正確なNET定量には、ウェルあたりの細胞数が正しいことが重要です。好中球の密度が高すぎると、細胞やNETが隣接する細胞やNETと重なってしまい、区別がつきにくくなり、結果として定量が不正確になってしまいます。第二に、細胞外環境に分泌されるNETsを染色するために、低濃度の非毒性原形質膜不透過性DNA結合色素を使用することが前提条件です。原形質膜透過性DNA結合色素は、好中球の活性化や細胞死を容易に誘導することができます。第三に、ウェルごとに複数の画像をスキャンして、不均一な好中球集団におけるNETリリースの代表的な概要を把握する必要があります。第四に、画像あたりの好中球の数を補正し、ネット好中球の割合を計算するには、t = 0 での好中球の位相コントラスト画像が必要です。

このリアルタイムのハイスループット顕微鏡法のアプローチは、他のNET検出アッセイに比べて多くの利点がありますが、私たちが知る限り、NETの放出を確認するための追加のNET成分を検出するための蛍光色素がないため、この方法には制限があります。追加のNET成分を検出するための蛍光標識抗体を使用できますが、抗体-免疫複合体が好中球の活性化や場合によってはNETosisに影響を与えるため、望ましくない影響を与える可能性があります。したがって、このアッセイのセットアップでは追加の抗体を使用しないことを好み、代わりによく知られているNETosis誘導刺激を使用することをお勧めします。まだ確立されていないNETosis刺激を使用する場合は、ライブイメージングアッセイの前に、シトルリン化ヒストンなどのNET特異的タンパク質と複合体化されたDNAを検出するためにELISAを使用することを提唱しています。第二に、アッセイ内およびアッセイ間の変動は、ドナー間の変動から生じる可能性があり、健康なドナーからの好中球は、健康な集団内の不均一性のために、さまざまなNETosis刺激に対して異なる反応を示します。アッセイのばらつきを最小限に抑えるには、好中球は短命で凍結保存できないため、採取したばかりの血液から1時間以内に単離し、実験ですぐに使用する必要があります。さらに、好中球の活性化を最小限に抑えるために、好中球単離プロトコルが検証され、採用されることが重要です。好中球は敏感な細胞であり、機械的ストレスやその他の種類のストレスにより、精製プロセス中に刺激に対する反応性を変化させる可能性があります。好中球の活性化状態とNET放出は、針の種類、使用する採血管、インキュベーション温度、遠心分離速度、および採血から好中球単離までの時間34,35,36,37によって影響を受ける可能性があります。検討可能な追加の好中球単離法は、赤血球溶解を伴わない陰性免疫磁気選択法を用いたKrémerら36によって記載されている。この方法は、全血中の手つかずの好中球に似ており、精製プロセス中の好中球の活性化を防ぐのに適している可能性があります。上記のすべては、さまざまな研究グループからのデータを細心の注意を払って比較する必要があることをこの分野に警告するのに役立つはずです。

全体として、記載されているリアルタイムのハイスループット顕微鏡法は、再現性のある効率的な方法でNETの正確な定量を可能にし、NET放出の特性、大きさ、および動態の研究に使用でき、NETosis拮抗薬の活性の調査を可能にします。後者の一例として、現在臨床開発中のヒト化抗シトルリン化ヒストンH2AおよびH4モノクローナル抗体CIT-013を用いた。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者はシトリルの従業員であり、金銭的な利害関係があります。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、ライブイメージング顕微鏡法に関するプロジェクトの一部を管理してくれたPaul Vinkに感謝します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
A-23187 遊離酸 (カルシマイシン)サーモフィッシャーA1493
塩化アンモニウム (NH4Cl)Sigma AldrichA9434
抗鶏卵リゾチーム (対照抗体; cIgG)CrownBioC0001
APC-Cy7-標識マウス 抗ヒト CD45 抗体 (クローン 2D1)Biolegend3685151 & micro;g/mL 最終濃度
BD FACSCantoTM II システム + FACSDiva ソフトウェア (version 8.0.1) BDn/aフローサイトメトリーシステム
ウシ血清アルブミン (BSA) フラクション Vロシュ10735108001
CaCl2 (1 M)VWRE506
ピロリン酸カルシウム素因疾患 (CPPD) 結晶InvivoGenlrl-cppd
セロメーター オート T4 明視野セルカウンター + 解析ソフトウェア (version 3.3.9.5)NexcelomBiosciencen/a明視野セルカウンター
CIT-013Citryll B.V.該当なし
Costar ブラック 96 ウェルプレート、クリアボトム Corning360396-well plate #1
Dextran T500Pharmacosmos551005009006
DPBS (1x)Gibco14190-144
Fetal Bovine Serum (FBS)SerenaS-FBS-SA-015
Ficoll GE Healthcare17-1440-02密度勾配溶液
FITC 標識マウス抗ヒト CD66b 抗体 (クローン G10F5)eBioscience17-0666-421.5 & micro;g/mL 最終濃度
固定可能な生存率色素 eFluor 506eBioscience65-0866-14
フローサイトメトリー解析ソフトウェアFLowJoVersion 10.8.0
fMLPSigma Aldrich47729-10MG-F
HEPES (1M)Gibco15630-080
ヒト 血清アルブミン (HSA)VWR31020
ヒトTruStain FcX Biolegend422302Fc受容体ブロック
IBIDI 96ウェルプレート、透明底 IBIDI8962696-well plate #2
IncuCyte SX3 + 解析ソフトウェア (version 2022B Rev1) Satoriusn/a生細胞顕微鏡分析システム
尿酸ナトリウム結晶InvivoGentlrl-msu
マウス抗ヒストンH3 (シトルリン R2 + R8 + R17) 抗体 ケイマン17939クローン 11D3; #1
マウス抗ヒストン H4 (K8Ac + K12Ac + K16Ac) 抗体 (クローン KM-2)絶対抗体Ab01681-2.0
Na2EDTASigma AldrichE5134
NaCl (0.9%)B. Braun25900
ペニシリン (5000 U/mL) - ストレプトマイシン (5000 µg/mL)Gibco15070-063
PerCP-Cy5.5-標識マウス抗ヒトCD16抗体 (クローン 3G8)バイオレジェンド3020270.33 & micro;g/mL 最終濃度
PMASigma AldrichP1585
ポリクローナルウサギ抗 HSA 抗体Sigma AldrichA0433-2ml
ポリ-L-リジン (0.01%)Sigma AldrichP4832
重炭酸カリウム (KHCO3)Sigma Aldrich237205
ウサギ抗ヒストン H3 (シトルリン R2 + R8 + R17) 抗体 Abcamab281584Multiclonal; #2
RPMI 1640 with GlutaMAXTM supplement Gibco61870-010L-グルタミン
RPMI 1640 を含む培地 フェノールレッドなし Gibco11835-030フェノールレッド
アジ化ナトリウム (NaN3)Sigma AldrichS2002
滅菌 H2OGibco15230204
Sytox Green Nucleid Acid Stain サーモフィッシャーS7020DNA 色素
トリパンブルー溶液 (0.4%)Gibco15250-061
Tween-20Sigma AldrichP1379
Vacutainer 血液チューブ Li-Heparin (17 IU/mL)BD367526

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. De Bont, C., Pruijn, G. J. M. Citrulline is not a major determinant of autoantibody reactivity to neutrophil extracellular traps. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 378 (1890), 20220249(2023).
  3. Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathog. 5 (10), e1000639(2009).
  4. Hoppenbrouwers, T., et al. In vitro induction of NETosis: Comprehensive live imaging comparison and systematic review. PLoS One. 12 (5), e0176472(2017).
  5. Kenny, E. F., et al. Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways. ELife. 6, e24437(2017).
  6. Parker, H., Dragunow, M., Hampton, M. B., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Requirements for NADPH oxidase and myeloperoxidase in neutrophil extracellular trap formation differ depending on the stimulus. J Leukoc Biol. 92 (4), 841-849 (2012).
  7. Neeli, I., Radic, M. Opposition between PKC isoforms regulates histone deimination and neutrophil extracellular chromatin release. Front Immunol. 4, 38(2013).
  8. Bosmann, M., Ward, P. A. Protein-based therapies for acute lung injury: targeting neutrophil extracellular traps. Expert Opin Ther Targets. 18 (6), 703-714 (2014).
  9. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).
  10. Shiratori-Aso, S., Nakazawa, D. The involvement of NETs in ANCA-associated vasculitis. Front Immunol. 14, 1261151(2023).
  11. Byrd, A. S., et al. Neutrophil extracellular traps, B cells, and type I interferons contribute to immune dysregulation in hidradenitis suppurativa. Sci Transl Med. 11 (508), eaav5908(2019).
  12. Kimball, A. S., Obi, A. T., Diaz, J. A., Henke, P. K. The emerging role of NETs in venous thrombosis and immunothrombosis. Front Immunol. 7, 236(2016).
  13. O'Neil, L. J., et al. Neutrophil extracellular trap-associated carbamylation and histones trigger osteoclast formation in rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. 82 (5), 630-638 (2023).
  14. Li, M., et al. A novel peptidylarginine deiminase 4 (PAD4) inhibitor BMS-P5 blocks formation of neutrophil extracellular traps and delays progression of multiple myeloma. Mol Cancer Ther. 19 (7), 1530-1538 (2020).
  15. Chirivi, R. G. S., et al. Anti-citrullinated protein antibodies as novel therapeutic drugs in rheumatoid arthritis. J Clin Cell Immunol. S6, 006(2013).
  16. Van der Linden, M., et al. Anti-citrullinated histone monoclonal antibody CIT-013, a dual action therapeutic for neutrophil extracellular trap-associated autoimmune diseases. MAbs. 15 (1), 2281763(2023).
  17. Chirivi, R. G. S., et al. Therapeutic ACPA inhibits NET formation: a potential therapy for neutrophil-mediated inflammatory diseases. Cell Mol Immunol. 18 (6), 1528-1544 (2021).
  18. Van der Linden, M., Westerlaken, G. H. A., Van Der Vlist, M., Van Montfrans, J., Meyaard, L. Differential signalling and kinetics of neutrophil extracellular trap release revealed by quantitative live imaging. Sci Rep. 7 (1), 6529(2017).
  19. Hoffmann, J. H. O., Schaekel, K., Gaiser, M. R., Enk, A. H., Hadaschik, E. N. Interindividual variation of NETosis in healthy donors: introduction and application of a refined method for extracellular trap quantification. Exp Dermatol. 25 (11), 895-900 (2016).
  20. Silva, L. M., Moutsopoulos, N., Bugge, T. H., Doyle, A. Live imaging and quantification of neutrophil extracellular trap formation. Curr Protoc. 1 (7), e157(2021).
  21. De Bont, C. M., Koopman, W. J. H., Boelens, W. C., Pruijn, G. J. M. Stimulus-dependent chromatin dynamics, citrullination, calcium signalling and ROS production during NET formation. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1865 (11 Pt A), 1621-1629 (2018).
  22. Gajendran, C., et al. Alleviation of arthritis through prevention of neutrophil extracellular traps by an orally available inhibitor of protein arginine deiminase 4. Sci Rep. 13 (1), 3189(2023).
  23. Biron, B. M., Chung, C. -S., O'Brien, X. M., Chen, Y., Reichner, J. S., Ayala, A. Cl-Amidine prevents histone 3 citrullination and neutrophil extracellular trap formation, and improves survival in a murine sepsis model. J Innate Immun. 9 (1), 22-32 (2017).
  24. Perdomo, J., et al. Neutrophil activation and NETosis are the major drivers of thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia. Nat Commun. 10 (1), 1322(2019).
  25. Lood, C., et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nat Med. 22 (2), 146-153 (2016).
  26. Kraaij, T., et al. A novel method for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps reveals ROS-independent NET release with immune complexes. Autoimmun Rev. 15 (6), 577-584 (2016).
  27. De Buhr, N., Von Köckritz-Blickwede, M. How neutrophil extracellular traps become visible. J Immunol Res. 2016, 1-13 (2016).
  28. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: How to generate and visualize them. J Vis Exp. (36), e1724(2010).
  29. Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. J Immunol Methods. 423, 104-110 (2015).
  30. Gavillet, M., et al. Flow cytometric assay for direct quantification of neutrophil extracellular traps in blood samples. Am J Hematol. 90 (12), 1155-1158 (2015).
  31. Sil, P., Yoo, D., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro. J Vis Exp. (112), e52779(2016).
  32. Gupta, S., Chan, D. W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. J Immunol. 200 (2), 869-879 (2018).
  33. D'Cruz, A. A., et al. The pseudokinase MLKL activates PAD4-dependent NET formation in necroptotic neutrophils. Sci Signal. 11 (546), eaao1716(2018).
  34. Nash, G., Abbitt, K., Tate, K., Jetha, K., Egginton, S. Changes in the mechanical and adhesive behaviour of human neutrophils on cooling in vitro. Pflugers Arch. 442 (5), 762-770 (2001).
  35. Hundhammer, T., Gruber, M., Wittmann, S. Paralytic impact of centrifugation on human neutrophils. Biomedicines. 10 (11), 2896(2022).
  36. Krémer, V., Godon, O., Bruhns, P., Jönsson, F., De Chaisemartin, L. Isolation methods determine human neutrophil responses after stimulation. Front Immunol. 14, 1301183(2023).
  37. Freitas, M., Porto, G., Lima, J. L. F. C., Fernandes, E. Isolation and activation of human neutrophils in vitro. The importance of the anticoagulant used during blood collection. Clin Biochem. 41 (7-8), 570-575 (2008).

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