IDH1変異体びまん性低悪性度神経膠腫の外植片培養のためのプロトコール

サマリー

IDH1変異体びまん性低悪性度神経膠腫は、培養が困難な希少腫瘍です。私たちは、IDH1変異タンパク質の発現を保持し、数ヶ月間培養を維持するシンプルな非酵素的外植片法を紹介します。重要なことに、この技術は凍結保存された腫瘍に作用し、神経膠腫の研究に貴重なリソースを提供します。

要約

最も多い原発性脳腫瘍であるびまん性神経膠腫は、病理組織学的基準と遺伝子変異に基づいて低悪性度と高悪性度に分類されます。びまん性低悪性度神経膠腫はサブセットを構成し、主に若年成人を苦しめ、高悪性度神経膠腫の素因となります。びまん性低悪性度神経膠腫には、星状細胞腫と乏突起膠腫の2つの主要なタイプがあり、それぞれが異なる遺伝的および組織学的特徴によって定義されます。これらの腫瘍は、代謝酵素IDH1の変異変異体を特徴的に示し、細胞分化を阻害します。それらは不均一であり、増殖性幹細胞とより分化した静止性グリア細胞の両方で構成されています。

患者特異的なin vitro腫瘍モデルは、発がんメカニズムを解明し、個別化治療のための薬剤選択を調整する大きな可能性を秘めています。しかし、IDH1変異体低悪性度神経膠腫に特化した信頼性の高いin vitroモデルがないため、基礎研究やトランスレーショナル研究が妨げられています。ここでは、酵素解離を必要とせずに、IDH1変異腫瘍を既定培地の外植片として培養する簡単な方法を紹介します。これらの外植片は、IDH1変異タンパク質の発現を維持するとともに、ASCL1(MASH1)、OLIG1、OLIG2などのオリゴデンドロサイト前駆細胞やアストロサイト(GFAP、SOX9)のマーカーとして、長期間維持することができます。また、DMSOの凍結腫瘍からも確立できます。これらの培養物は、薬物スクリーニング、ビデオ顕微鏡検査、および遺伝子研究のための貴重なプラットフォームとして機能し、したがって、これらの困難な腫瘍の理解と治療の進歩を促進します。また、IDH1変異細胞株を作製する可能性も秘めています。

概要

びまん性神経膠腫は、最も頻度の高い原発性脳腫瘍です。これらの腫瘍は、非常に強力な治療(手術、放射線、化学療法)にもかかわらず、現在不治の病です¹。神経膠腫形成は、脳に存在する成体幹細胞またはグリア前駆細胞に由来するという仮説を支持する証拠が増え²。膠芽腫は最も侵攻性の高いタイプですが、びまん性低悪性度神経膠腫(DLGG、悪性度2の腫瘍)も蔓延しています(びまん性神経膠腫の15%)^1,3。DLGGはゆっくりと成長し、白質路に沿って移動しますが、これはこの「びまん性」新生物の特徴です⁴。これらのDLGGは、治療にもかかわらず再発することが多く、最終的には高悪性度(グレード3および4)^5に進行します。

DLGGは、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ1または2遺伝子(IDH1またはIDH2)のミスセンス変異を特徴とし、その結果、腫瘍代謝産物である2-ヒドロキシグルタル酸(2HG)の異常な産生を引き起こします。これにより、エピジェネティックな調節不全^{6による細胞分化が阻害されます}。IDH1変異グリオーマはさらにサブタイプに分類されます:星状細胞腫は通常、ATRXとP53に変異を持っていますが、乏突起グリオーマは1p19q欠失^{7によって特徴付けられ}ます。これらの腫瘍は、腫瘍細胞の不均一性を示します。シングルセルRNAシーケンシングと免疫特性評価により、腫瘍細胞の多様な集団が明らかになり、これらの腫瘍内で幹細胞様、星状細胞様、およびオリゴデンドロサイト様の表現型が見られます^8,9。

膠芽腫が容易に入手できる長期培養と細胞株の恩恵を受けているのとは対照的に、IDH1変異腫瘍の調査に特化した細胞ツールが著しく不足しています¹。これは、治療法の開発を進め、IDH1変異体神経膠腫の発症と疾患の進行についての理解を深める上で大きな障害となります。従来の血清増殖細胞株は、長期間利用されてきたものの、元の腫瘍の複製が不十分で、転写プロファイルの変化が見られます。あるいは、2Dまたは3D腫瘍様モデルのいずれであっても、無血清培養条件では、腫瘍細胞の転写プロファイルとそのin vivo表現型(正常な脳組織への浸潤など)をより効果的に保存することができます^10,11。

さらに、患者の手術標本に由来する短期の細胞培養は、腫瘍の分子プロファイルと細胞の多様性を保持し、それにより細胞株と比較して腫瘍の生物学的特性をよりよく表現します¹²。ここでは、神経膠腫の研究と治療法開発のための改良されたin vitroモデルの必要性に対処することを目的として、新鮮または凍結患者の切除に由来する外植片としてIDH1変異変異びまん性低悪性度神経膠腫培養を培養するための簡単な非酵素的方法を紹介します。また、IDH1変異細胞株を作製する可能性も秘めています。

プロトコル

このプロトコルで利用された腫瘍断片は、患者の同意を得て、十分に特徴付けられ、倫理的に承認されたコレクションから取得されました。本研究は、Gliomacult: Characterization and Primary Cultures of Low-Grade Gliomas (Project No.RECH/P722/1-5)を承認し、2023年8月28日に腫瘍バイオバンクの科学評議会で承認されました。

1. 培養プレートの調製

注:これらの手順は、滅菌組織培養層流フードの下で実行してください。

1. 培養の少なくとも1時間前に、ポリ-D-リジン(PDL)およびラミニン被覆24ウェルプレートを調製します。
   1. 10 mgのPDL粉末を100 mLのホウ酸塩緩衝液(pH 8.4)で希釈し、最終濃度を100 μg/mLにします。溶解したら、溶液(0.22 μm)をろ過して無菌状態にします。PDL はすぐに使用できます。3 mLのアリコートを調製し、-20°Cで保存します。
   2. 1-2 mg/mLラミニンチューブを4°Cで解凍し、ゲル形成を避けてください。50 μLのアリコートを調製し、-20 °C.
      で保存します。 注意: 解凍と凍結を繰り返すことは避けてください。
   3. プレートコーティング
      1. オプションのステップ:細胞培養皿に適した滅菌カバースリップØ、13mmを24ウェルプレートに配置し、ウェルごとに1つのカバースリップ
         注:このステップは、神経膠腫外植片のさらなる免疫染色のためのものです。
      2. ウェルのコーティングには、3 mLのPDL溶液を9 mLの1x PBSに混合し、50 μLのラミニンを加えます。この溶液を各ウェルに500μL加えると、コーティング濃度が1〜2μg/cm²になります。コーティングされたプレートを室温で、できればゆっくりと揺さぶる(15 RPM)しながら、少なくとも1時間インキュベー
      トします。
      3. 培養の直前に、PDL-ラミニン溶液を取り出し、滅菌した1x PBS.
         で2回すすぎます。 注意: 井戸を乾かさないでください。

2. メディア

1. DMEM/F12にL-グルタミンを添加した製剤、およびビタミンAを含まないN2とB27からなる血清補充ブレンドを含む定義培地でIDH1変異外植片を培養します。シプロフロキサシン、ゲンタマイシン、真菌などの抗生物質を使用して、細菌や真菌の汚染を防ぎます。さらに、成長因子ヘパリン、EGF、およびFGF2を培地に組み込み、ろ過(0.2μm)し、4°C.
   で最大2週間保存します 注:培地の成分と調製の詳細については、表1および材料表を参照してください。

3. 外植片の準備

1. サンプル処理の前に、図1Aに示されているように、ワークスペースと滅菌ツールを準備します。クールパックに70%エタノールを噴霧して消毒します。はさみと鉗子を70%エタノールに浸し、PBSですすいで滅菌します。
2. 腫瘍切除術を速やかに、理想的には外科的摘出後2時間以内に氷上で培養します(図1B).
   注:腫瘍サンプルは、より良い結果を得るために、最小直径9〜10mmである必要があります。組織は、この方法が組織学的目的に好ましいため、培地なしで輸送されます。液体がないため、瞬間凍結時の氷結晶の形成が防止され、必要に応じてその後の組織学的検査のために組織の完全性が維持されます。
3. 腫瘍標本を入れた培養皿をクールパックの上に置き、1X PBSで優しくすすぎ、余分な血液を取り除きます。
4. 切除された腫瘍は、多くの場合、腫瘍塊、浸潤組織、および非腫瘍性成分を含む、有意なサイズと不均一性を示します (図 1C)。腫瘍細胞の単離には、腫瘍細胞をより多く含む傾向があるため、柔らかいまたはゼリー状のテクスチャーを持つ灰色の色が表示されている部分を選択します。逆に、硬い領域や白い領域は、培養に適した腫瘍細胞が少ない場合があり(図1D)、黒くなった領域は電気焼灼の結果である可能性が高く、分析に信頼できる結果が得られない可能性があるため、避けてください。
5. 選択したサンプルを1.5 mLのマイクロチューブまたはクライオバイアルに移してミンチします。1.5mLのマイクロチューブまたはクライオバイアルに1mLの滅菌培地を加え、小さな小片(1〜2 mm³)が得られるまで滅菌ハサミでサンプルを切り刻みます
   注:小さな破片、通常は1〜2 mm³のサイズ(図1E)を得るには、約1〜2分間のチョッピングが必要です。
6. 滅菌ハサミで、青色の1,000μLピペットチップの端を慎重にトリミングし、直径約3〜4mmの広い開口部を作ります。この改良チップを使用して、ミンチ組織片の50-200μLをピペットで取り、各ウェルに均等に分配します。小さいピースは急速に沈降する傾向があるため、各ウェルの懸濁液を穏やかに再均質化して、均一な分布を確保します。
   注: 過密状態を避け、各ウェルに過剰な数のフラグメントを導入しないようにしてバランスを保ちます (図 1F)。
7. 腫瘍断片を37°Cで、湿度100%の5%CO2インキュベーターでインキュベートします。腫瘍の代謝活性(培地の急速な黄変によって示されます)と各ウェルのフラグメントの数がそれを必要とする場合は、毎日培地を交換してください。培地交換の際は、200μLのチップ付きピペットで培地を繊細に吸引し、付着した腫瘍片を乱さないように注意
して行ってください。

図1:腫瘍外植片の培養手順。びまん性低悪性度神経膠腫切除術は、WHO 2021の分類に従ってグレードIIの星状細胞腫と診断された44歳の患者から行われました。この腫瘍は、ATRX染色が認められないとともに、IDH1変異(Exon 4 c.395 G>A, p.Arg132His)およびTP53変異(Exon 8 c.843_844delinsGT, p.Asp281_Arg282delinsGluHis)を示しました。TERT遺伝子のEts/TCF結合部位(C250TおよびC228T)には変異は検出されませんでした。(A)作業面はクールパックで構成されており、サンプルの劣化を最小限に抑え、生物学的成分の生存率を維持する環境を提供します。これらの予防措置は、組織の品質と完全性を維持するために重要です。(B)病院からラボへのサンプルの輸送は、氷上で行う必要があります。(C)腫瘍切除片。矢印は、文化に最も適した部分を示しています。(D)腫瘍の解剖を行い、ミンチする最も関連性の高い部分を選択します。私たちの経験では、白質は一般的に成功した外植片を生成する可能性が低くなります。(E)ハサミで機械的にミンチした後の15mLチューブ内の直径約1〜2mm³の腫瘍断片。(F)適切な播種に必要な腫瘍片の数は、24ウェルプレート上のウェルについて示されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

4. ミンチ腫瘍の凍結保存と解凍

注:凍結保存は、外植片の培養物が汚染して失われた場合や、腫瘍サンプルを後で処理するためのバックアップを保証します。

1. 凍結保存:8 mLの細胞培養培地に2 mLのDMSOを加えて、凍結培地(20% v / v DMSO溶液)を調製します。
2. 1容量のミンチ腫瘍懸濁液と等容量の20%DMSO凍結培地を組み合わせて、最終濃度10%DMSOを達成します。混合物を慎重に上下にピペットで動かして完全に混合し、約1 mLをクライオバイアルに分注します。
3. クライオバイアルを極低温容器に迅速に移して徐々に温度を下げ、続いて-80°Cで一晩インキュベートしてから、液体窒素で最終保存します
   注:DMSOなどの特定の凍結保護剤は、細胞が必要以上に室温でそれらにさらされると有害になる可能性があるため、この手順は細胞を凍結培地に入れた直後に実行する必要があります。
4. 解凍:液体窒素からクライオバイアルを取り出し、細胞の約80%が融解するまで、すぐに37°Cの水浴に入れます。
5. DMSOを除去するには、懸濁液を5 mLの予熱済み1x PBSが入った15 mLの遠心チューブにすばやくピペットで移し、300 × gで5分間遠心分離します。
6. 上清を取り除き、1X PBSで洗浄を繰り返し、続いて遠心分離します(ステップ4.5)。ペレットを乱さないように注意しながら上清を吸引し、適量の培地を加えてプレコートされたPDL-Laminin 24ウェルプレートに移し、インキュベーターに入れます。
7. 24時間後、セルが付着したことを確認します。数日後、培地を交換して非接着性フラグメントを除去します。

5. 文化の変遷

注:一度確立されると、外植片はビデオ顕微鏡検査または免疫染色に使用できます。あるいは、腫瘍細胞が外植片から移動し、健康に見える場合、外植片を酵素解離を経てウェルに再播種し、さらなる実験を行うことができます。ただし、このプロトコルは繰り返し継代するようには設計されていないことに注意することが重要です。通常、腫瘍細胞が老化または死滅する前に試みることができるのは1回の継代のみです。すべての外植片培養が成功裏に通過するわけではありません。

1. 継代するには、古い培地を取り出し、1X PBSですすぎ、(125 μL)0.05%トリプシン-EDTAをウェルに加え、37 °Cで3〜4分間インキュベートした後、6.5 μLのトリプシン阻害剤、12 μLの20 mM CaCl₂(最終希釈を2 mMに)、および1 μLのDNAse I.
   を添加します 注:解離に必要なインキュベーション時間は、培養物によって異なる場合があります。少なくとも3分後に細胞が剥離しているかどうかを確認することが重要です。通常、外植片は単一細胞懸濁液に完全に解離しない場合があり、小さなクラスターが保持されることが多く、これにより新しい外植片培養物が生成される可能性があります。
2. p1000を500〜600μLに設定した状態で、外植片を分解するために穏やかに洗い流します。気泡の形成を避けてください。
3. 1x PBSを5 mL加え、300 × gで5分間遠心分離します。上清を吸引し、ペレットを新鮮な温めた培地に再懸濁し、播種にカウントします。
4. 分裂する細胞を位相差顕微鏡で観察することにより、細胞株を生成する可能性のある培養物を特定します。これらの分裂細胞は、通常、図 2A に示すように、丸みを帯びた形態と目に見える染色体を持っています。

結果

数日後、一部の腫瘍断片がウェル表面に付着し、外植片からの細胞の成長が始まります。最初のプレーティングから腫瘍増殖細胞の出現までの時間は、サンプルごとに異なります。初期の培養物には、多くの場合、かなりの細胞破片が含まれているため、生細胞の存在を評価することは困難です。したがって、培養は最低4週間維持する必要があります。細胞が成長し始めると、双極性または多極性の外観を持つ細長い細胞が観察されます（図2B,C)。

凍結保存されたミンチ腫瘍を解凍すると、外植片培養の成功率がわずかに低下することがあります。凍結保存の影響を正確に定量化していませんが、成功率の低下は軽微であると思われます。我々は、図2Dで示された3つのケースで示されているように、新鮮腫瘍由来の細胞と凍結保存された腫瘍由来の細胞との間に細胞形態に有意な差は観察されていません。腫瘍外植片からの細胞の顕著で広範な移動も、凍結保存されたサンプルで通常観察されます。図2Eに示すように、...

ディスカッション

IDH1変異低悪性度神経膠腫のin vitroおよび前臨床モデルの開発は、これらの腫瘍の増殖が遅く、IDH変異によって引き起こされる広範なゲノムおよびエピゲノム変化を複製することが複雑であるため、特に困難です。さらに、これらの浸潤性腫瘍細胞は、免疫細胞、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞などの周囲の細胞と積極的に相互作用し、生存のためにそれらに依存する可能性があります。この複雑な相互作用は、実験室環境で再現することは困難です。

IDH1変異低悪性度神経膠腫に関する新たな生物学的洞察を明らかにし、革新的な治療法の開発を進めるには、ヒトの病気の複雑さを忠実に再現するモデルを確立することが不可欠です。神経膠芽腫などの高悪性度神経膠腫と比較して、現在、IDH 変異神経膠腫に利用できる in vitro モデルは比較的少ないです。ほとんどのIDH1変異細胞株は、未分化乏突起膠腫(BT260およびBT237など)などの高悪性度神経膠腫に由来し、追加の変異を有し、IDH1変異を有するびまん性低悪性度神経膠腫の特徴を部分的にしか再現していません。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Anti-ASCL1	BD Pharmingen™	556604	希釈 1:500
抗 ATRX	Sigma-Aldrich	HPA001906	希釈 1:100
抗 CD68	Agilent	M081401-2	希釈 1:500
抗 GFAP	Aves Labs	AB_2313547	希釈 1:500
抗 IBA1	富士フイルム 和光抗体	019-19741	Dilituion 1:1000
抗 IDH1 (R132H) マウス モノクローナル抗体	Dianova	DIA-H09
Anti-Ki67	BD Pharmingen™	556003	Dilituion 1:1000
アンチオリッグ1	R&Dシステムズ®	AF2417	Dulituion 1:300
Anti-OLIG2	Sigma-Aldrich	MABN50	Dilution 1:250
Anti-SOX9	Abcam®	EPR14335-78	希釈 1:100
B-27 サプリメント (50x)、ビタミン A を差し引いた	サーモフィッシャー サイエンティフィック	12587010
ウシ血清アルブミン (BSA)	CiteAb	A-421-100
シプロフロキサシン HCl	Sigma-Aldrich	PHR1044-1G
CoolCell	Corning®	432000	細胞凍結容器、12 x 1 mLまたは2 mL極低温バイアル用
スリップØ、13 mm	Karl Hecht™アシスタント&トレード;
ジメチルスルホキシド(DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
DMEM/F-12、グルタミン無し	Thermo Fisher Scientific	21331020
DNAse I	Sigma-Aldrich	10104159001
Dulbecco′リン酸緩衝生理食塩水(PBS)1x	Sigma-Aldrich	D8537
Falcon 100 mm TC処理細胞培養ディッシュ	コーニング®
Falcon 24ウェルクリアフラットボトム	コーニング®	353047	TC処理マルチウェル細胞培養プレート、蓋付き、滅菌
菌	InvivoGen	ant-fn-1
ゲンタマイシン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15750-037
ヘパリン	Sigma-Aldrich	H3149-100KU
HEPES	Sigma-Aldrich	H-3375
ヒト EGF	PeproTech	AF-100-15-1MG
ヒト FGF-basic	PeproTech	100-18B-1MG
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020
L-Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030-024
N-2 Supplement (100x )	Thermo Fisher Scientific	17502-048
PDL	Sigma-Aldrich	P7886
Serum acrodisc 37 mm syringe filter with GF/0.2 µm Supor	PALL Corporation	4525
トリプシン阻害剤	Thermo Fisher Scientific	17075-029
トリプシン-EDTA(0.05%)、フェノールレッド	サーモフィッシャーサイエンティフィック	25300054
ツァイスZ1 アポトーム3顕微鏡	ツァイス		ストレート広視野落射蛍光顕微鏡