IDH1変異体びまん性低悪性度神経膠腫の外植片培養のためのプロトコール

サマリー

IDH1変異体びまん性低悪性度神経膠腫は、培養が困難な希少腫瘍です。私たちは、IDH1変異タンパク質の発現を保持し、数ヶ月間培養を維持するシンプルな非酵素的外植片法を紹介します。重要なことに、この技術は凍結保存された腫瘍に作用し、神経膠腫の研究に貴重なリソースを提供します。

要約

最も多い原発性脳腫瘍であるびまん性神経膠腫は、病理組織学的基準と遺伝子変異に基づいて低悪性度と高悪性度に分類されます。びまん性低悪性度神経膠腫はサブセットを構成し、主に若年成人を苦しめ、高悪性度神経膠腫の素因となります。びまん性低悪性度神経膠腫には、星状細胞腫と乏突起膠腫の2つの主要なタイプがあり、それぞれが異なる遺伝的および組織学的特徴によって定義されます。これらの腫瘍は、代謝酵素IDH1の変異変異体を特徴的に示し、細胞分化を阻害します。それらは不均一であり、増殖性幹細胞とより分化した静止性グリア細胞の両方で構成されています。

患者特異的なin vitro腫瘍モデルは、発がんメカニズムを解明し、個別化治療のための薬剤選択を調整する大きな可能性を秘めています。しかし、IDH1変異体低悪性度神経膠腫に特化した信頼性の高いin vitroモデルがないため、基礎研究やトランスレーショナル研究が妨げられています。ここでは、酵素解離を必要とせずに、IDH1変異腫瘍を既定培地の外植片として培養する簡単な方法を紹介します。これらの外植片は、IDH1変異タンパク質の発現を維持するとともに、ASCL1(MASH1)、OLIG1、OLIG2などのオリゴデンドロサイト前駆細胞やアストロサイト(GFAP、SOX9)のマーカーとして、長期間維持することができます。また、DMSOの凍結腫瘍からも確立できます。これらの培養物は、薬物スクリーニング、ビデオ顕微鏡検査、および遺伝子研究のための貴重なプラットフォームとして機能し、したがって、これらの困難な腫瘍の理解と治療の進歩を促進します。また、IDH1変異細胞株を作製する可能性も秘めています。

概要

びまん性神経膠腫は、最も頻度の高い原発性脳腫瘍です。これらの腫瘍は、非常に強力な治療(手術、放射線、化学療法)にもかかわらず、現在不治の病です¹。神経膠腫形成は、脳に存在する成体幹細胞またはグリア前駆細胞に由来するという仮説を支持する証拠が増え²。膠芽腫は最も侵攻性の高いタイプですが、びまん性低悪性度神経膠腫(DLGG、悪性度2の腫瘍)も蔓延しています(びまん性神経膠腫の15%)^1,3。DLGGはゆっくりと成長し、白質路に沿って移動しますが、これはこの「びまん性」新生物の特徴です⁴。これらのDLGGは、治療にもかかわらず再発することが多く、最終的には高悪性度(グレード3および4)^5に進行します。

DLGGは、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ1または2遺伝子(IDH1またはIDH2)のミスセンス変異を特徴とし、その結果、腫瘍代謝産物である2-ヒドロキシグルタル酸(2HG)の異常な産生を引き起こします。これにより、エピジェネティックな調節不全^{6による細胞分化が阻害されます}。IDH1変異グリオーマはさらにサブタイプに分類されます:星状細胞腫は通常、ATRXとP53に変異を持っていますが、乏突起グリオーマは1p19q欠失^{7によって特徴付けられ}ます。これらの腫瘍は、腫瘍細胞の不均一性を示します。シングルセルRNAシーケンシングと免疫特性評価により、腫瘍細胞の多様な集団が明らかになり、これらの腫瘍内で幹細胞様、星状細胞様、およびオリゴデンドロサイト様の表現型が見られます^8,9。

膠芽腫が容易に入手できる長期培養と細胞株の恩恵を受けているのとは対照的に、IDH1変異腫瘍の調査に特化した細胞ツールが著しく不足しています¹。これは、治療法の開発を進め、IDH1変異体神経膠腫の発症と疾患の進行についての理解を深める上で大きな障害となります。従来の血清増殖細胞株は、長期間利用されてきたものの、元の腫瘍の複製が不十分で、転写プロファイルの変化が見られます。あるいは、2Dまたは3D腫瘍様モデルのいずれであっても、無血清培養条件では、腫瘍細胞の転写プロファイルとそのin vivo表現型(正常な脳組織への浸潤など)をより効果的に保存することができます^10,11。

さらに、患者の手術標本に由来する短期の細胞培養は、腫瘍の分子プロファイルと細胞の多様性を保持し、それにより細胞株と比較して腫瘍の生物学的特性をよりよく表現します¹²。ここでは、神経膠腫の研究と治療法開発のための改良されたin vitroモデルの必要性に対処することを目的として、新鮮または凍結患者の切除に由来する外植片としてIDH1変異変異びまん性低悪性度神経膠腫培養を培養するための簡単な非酵素的方法を紹介します。また、IDH1変異細胞株を作製する可能性も秘めています。

プロトコル

本プロトコルで使用した腫瘍断片は、患者の同意を得て、十分に特性解析され、倫理的承認を受けたコレクションから取得した。本研究は、以下のプロジェクト名の下で実施された。 Gliomacult：低グレードグリオーマの特性解析および初代培養 （プロジェクト番号 RECH/P722/1-5）であり、2023年8月28日に腫瘍バイオバンクの科学評議会によって承認された。

1. 培養プレートの調製

注：これらの手順は、無菌的な組織培養用ラミナーフローフード内で行ってください。

1. 培養の少なくとも1時間前に、ポリ-D-リシン（PDL）およびラミニンでコートした24ウェルプレートを用意する。
   1. 10 mgのPDL粉末を100 mLのホウ酸緩衝液（pH 8.4）に溶解し、最終濃度を100 µg/mLにする。溶解後、溶液をフィルター（0.22 µm）でろ過し、滅菌する。PDLはこれで使用可能である。3 mLずつ分注し、-20 °Cで保存する。
   2. ゲルの形成を避けるため、1-2 mg/mLのラミニンチューブを4 °Cで解凍する。50 µLずつ分注し、-20 °Cで保存する。
      注意：凍結融解の繰り返しは避けること。
   3. プレートのコーティング
      1. 任意の手順：細胞培養ディッシュに適した滅菌済みカバーガラス（Ø 13 mm）を、1ウェルにつき1枚ずつ24ウェルプレートに配置する。
         注意：この手順は、後にグリオーマ外植出片の免疫染色を行うためのものである。
      2. ウェルのコーティングのため、3 mLのPDL溶液を9 mLの1x PBSに混ぜ、50 µLのラミニンを加える。この溶液を各ウェルに500 µLずつ加え、コーティング濃度を1-2 µg/cm²とする。コートしたプレートを室温で、なるべく緩やかな揺動（15 RPM）を加えながら、少なくとも1時間インキュベートする。
      3. 培養の直前に、PDL-ラミニン溶液を取り除き、滅菌済み1x PBSで2回洗浄する。
         注意：ウェルを乾燥させないこと。

2. 培地

1. L-グルタミンを添加したDMEM/F12、およびビタミンAを含まないN2およびB27からなる血清代替混合液を含む限定培地で、IDH1変異外植片を培養する。細菌および真菌による汚染を防ぐため、シプロフロキサシン、ゲンタマイシン、およびファンギンを含む抗生物質を使用する。さらに、増殖因子のヘパリン、EGF、およびFGF2を培地に加え、ろ過（0.2 µm）し、4 °Cで最大2週間保存する。
   注：培地成分および調製に関する詳細は、表1および材料表を参照すること。

3. 外植体（エクスプラント）の調製

1. 図1Aに示すように、サンプル処理の前にワークスペースと滅菌済み器具を準備します。保冷剤に70% ethanolをスプレーして消毒します。ハサミとピンセットを70% ethanolに浸し、PBSで洗浄して滅菌します。
2. 腫瘍切除組織を速やかに氷上で培養に回します。理想的には外科的摘出後2時間以内に行います(図1B)。
   注：より良い結果を得るために、腫瘍サンプルの直径は最小9-10 mmである必要があります。組織学的な目的にはこの方法が好まれるため、組織は培地なしで輸送します。液体がないことで、急速凍結時の氷結晶形成を防ぎ、必要に応じてその後の組織学的検査のための組織整合性を維持できます。
3. 腫瘍検体の入った培養皿を保冷剤の上に置き、1X PBSで静かにすすいで過剰な血液を除去します。
4. 切除された腫瘍は、腫瘍塊、浸潤組織、非腫瘍成分で構成されており、しばしば顕著なサイズ差や不均一性を示します(図1C)。腫瘍細胞の単離には、腫瘍細胞をより多く含む傾向がある、灰色で柔らかい、あるいはゼリー状の質感を呈する部位を選択します。逆に、培養に適した腫瘍細胞が少ない可能性がある硬く白い領域(図1D)や、電気焼灼の結果である可能性が高く、分析において信頼性の高い結果が得られないと考えられる黒色化した領域は避けてください。
5. 選択したサンプルを、微小片化のために1.5 mLマイクロチューブまたはクライオバイアルに移します。1.5 mLマイクロチューブまたはクライオバイアルに1 mLの滅菌培地を加え、滅菌ハサミでサンプルを細切し、小さな断片（1-2 mm³）になるまで切断します。
   注：通常1-2 mm³サイズの微小な断片を得るには、約1-2分間の切断が必要です(図1E)。
6. 滅菌ハサミを用いて、青色の1,000 µLピペットチップの先端を慎重に切り取り、直径約3-4 mmの広い開口部を作ります。この改造チップを用いて、微小片化された組織断片を50-200 µLピペットし、各ウェルに均等に分配します。小さな断片は急速に沈殿する傾向があるため、各ウェルの懸濁液を静かに再均質化し、均一に分布させます。
   注：過密状態を避け、各ウェルに断片を導入しすぎないようにバランスを維持してください(図1F)。
7. 腫瘍断片を、37°C、5% CO2、湿度100%のインキュベーター内で培養します。腫瘍の代謝活性（培地の急速な黄色化で示される）や各ウェルの断片数に応じて、毎日培地を交換します。培地交換の際は、200 µLチップを装着したピペットを用いて培地を慎重に吸引し、付着している腫瘍断片を乱さないように注意してください。

図 1: 腫瘍外植片培養の手順。 WHO 2021分類に基づきグレード II 星細胞腫と診断された44歳の患者から、びまん性低悪性度グリオーマの切除組織を入手した。この腫瘍は IDH1 変異（Exon 4 c.395 G>A, p.Arg132His）および TP53 変異（Exon 8 c.843_844delinsGT, p.Asp281_Arg282delinsGluHis）を示し、ATRX 染色は陰性であった。TERT 遺伝子の Ets/TCF 結合部位（C250T および C228T）に 変異は検出されなかった。(A) 作業面には保冷剤が配置されており、サンプルの分解を最小限に抑え、生物学的成分の生存能を維持する環境を提供している。これらの予防措置は、組織の品質と完全性を保持するために重要である。(B) 病院から研究室へのサンプルの輸送は、氷上で行う必要がある。(C) 腫瘍切除断片。矢印は培養に最も適した部位を示している。(D) 腫瘍の解剖を行い、細切するのに最も適切な部位を選択する。我々の経験では、一般的に白質は外植片の作成に成功する可能性が低い。(E) ハサミで機械的に細切した後、15 mL チューブに入れた直径約 1-2 mm³ の腫瘍断片。(F) 適切な播種に必要な腫瘍片の数を、24ウェルプレートのウェルに対して示している。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

4. 腫瘍微小片の凍結保存および融解

注：凍結保存を行うことで、コンタミネーションや外植体培養の喪失に備えたバックアップを確保できるほか、後日腫瘍サンプルを処理することが可能になります。

1. 凍結保存： 2 mLのDMSOを8 mLの細胞培養培地に加え、凍結保存液（20% v/v DMSO溶液）を調製する。
2. 細切した腫瘍懸濁液1体積と、同体積の20% DMSO凍結保存液を混合し、DMSOの最終濃度を10%にする。混合液をピペッティングして十分に混ぜ合わせ、約1 mLずつクライオバイアルに分注する。
3. クライオバイアルを速やかに緩慢凍結容器に移して段階的に温度を下げ、-80 °Cで一晩インキュベートした後、液体窒素で最終保存する。
   注：DMSOなどの特定の凍結保護剤は、室温で必要以上に細胞にさらされると有害となる可能性があるため、この手順は細胞を凍結保存液に入れた直後に行わなければならない。
4. 融解： クライオバイアルを液体窒素から取り出し、直ちに37 °Cのウォーターバスに入れ、細胞の約80%が融解するまで加温する。
5. DMSOを除去するため、懸濁液をあらかじめ温めておいた5 mLの1x PBSを含む15 mL遠心チューブに速やかに移し、300 × g で5分間遠心分離する。
6. 上清を除去し、1x PBSによる洗浄と遠心分離（ステップ4.5）を繰り返す。ペレットを乱さないように注意しながら上清を吸引し、適切な量の培地を加えて、あらかじめPDL-Lamininコーティングを施した24ウェルプレートに移してインキュベーターに設置する。
7. 24時間後、細胞が付着していることを確認する。数日後、培養液を交換して非付着片を除去する。

5. 培養細胞の継代

注：組織片（エクスプラント）が定着した後、ビデオ顕微鏡観察や免疫染色に使用できます。あるいは、腫瘍細胞が組織片から遊出し、健全な状態であれば、酵素的解離による継代を行い、さらなる実験のためにウェルに再播種することも可能です。ただし、本プロトコルは反復的な継代を目的として設計されていないことに注意してください。通常、腫瘍細胞が老化または死滅するまでに、試行できる継代は1回のみです。すべての組織片培養において、継代が成功するとは限りません。

1. 継代を行うには、古い培地を除去し、1X PBSで洗浄した後、ウェルに(125 µL) 0.05% trypsin-EDTAを加え、37 °Cで3～4分間インキュベートする。続いて、6.5 µLのTrypsin Inhibitor、12 µLの20 mM CaCl₂（最終濃度2mMまで希釈）、および1 µLのDNAse Iを添加する。
   注：解離に必要なインキュベート時間は、培養物によって異なる場合がある。少なくとも3分後には、細胞が剥離しているか確認することが重要である。通常、外植片は完全に単一細胞懸濁液まで解離せず、小さなクラスターが残ることが多いが、これにより新たな外植片培養を形成できる。
2. p1000ピペットを500-600 µLに設定し、穏やかにピペッティングして外植片を分散させる。気泡の形成を避けること。
3. 5 mLの1x PBSを加え、300 × gで5分間遠心分離する。上清を吸引し、あらかじめ加温した新鮮な培地でペレットを再懸濁させ、播種のために細胞数をカウントする。
4. 位相差顕微鏡下で分裂細胞を観察し、細胞株を形成する可能性のある培養物を特定する。これらの分裂細胞は、図2Aに示すように、通常、円形の形態をしており、染色体が確認できる。

結果

数日後、一部の腫瘍断片がウェル表面に接着し、外植片からの細胞の増殖が始まります。初期播種から腫瘍細胞の増殖が認められるまでの期間は、サンプルによって異なります。初期培養では大量の細胞残渣が含まれていることが多く、生存細胞の有無を判断することが困難な場合があります。そのため、培養は最低4週間維持する必要があります。細胞の増殖が始まると、二極性または多極性の形態を持つ細長い細胞が観察されます (図 2B,C)。

凍結保存された分砕腫瘍を融解して使用する場合、外植え（エクスプラント）培養の成功率がわずかに低下することがあります。凍結保存による影響を正確に定量化したわけではありませんが、成功率の低下は軽微であると考えられます。以下に示す3つの症例で示されている通り、新鮮な腫瘍由来の細胞と凍結保存腫瘍由来の細胞との間で、細胞形態に有意な差は認められませんでした。 図 2D凍結保存された試料においても、通常、腫瘍外植片から細胞の顕著かつ広範な...

ディスカッション

IDH1変異低グレードグリオーマのin vitroおよび前臨床モデルの開発は、これらの腫瘍の増殖速度が遅いこと、およびIDH変異によって引き起こされる広範なゲノムおよびエピゲノムの変化を再現することが困難であるため、特に困難です。さらに、これらの浸潤性腫瘍細胞は、免疫細胞、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞などの周囲の細胞と積極的に相互作用しており、生存のためにそれらに依存している可能性があります。このような複雑な相互作用を研究室レベルで再現することは困難です。

IDH1変異を有する低悪性度グリオーマに関する新たな生物学的知見を明らかにし、革新的な治療法の開発を促進するためには、ヒトの疾患の複雑さを忠実に再現したモデルを構築することが不可欠です。膠芽腫などの高悪性度グリオーマと比較して、IDH変異グリオーマで利用可能なin vitroモデルは現状では比較的少数です。IDH1変異細胞株の多くは、快調細胞腫（例：BT260およびBT237）などの高悪性度グリオーマに由来しており、これらは追加の変異を有しているため、IDH1変異を伴うびまん性低悪性度グリオーマの特徴を部分的...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Anti-ASCL1	BD Pharmingen™	556604	希釈 1:500
抗 ATRX	Sigma-Aldrich	HPA001906	希釈 1:100
抗 CD68	Agilent	M081401-2	希釈 1:500
抗 GFAP	Aves Labs	AB_2313547	希釈 1:500
抗 IBA1	富士フイルム 和光抗体	019-19741	Dilituion 1:1000
抗 IDH1 (R132H) マウス モノクローナル抗体	Dianova	DIA-H09
Anti-Ki67	BD Pharmingen™	556003	Dilituion 1:1000
アンチオリッグ1	R&Dシステムズ®	AF2417	Dulituion 1:300
Anti-OLIG2	Sigma-Aldrich	MABN50	Dilution 1:250
Anti-SOX9	Abcam®	EPR14335-78	希釈 1:100
B-27 サプリメント (50x)、ビタミン A を差し引いた	サーモフィッシャー サイエンティフィック	12587010
ウシ血清アルブミン (BSA)	CiteAb	A-421-100
シプロフロキサシン HCl	Sigma-Aldrich	PHR1044-1G
CoolCell	Corning®	432000	細胞凍結容器、12 x 1 mLまたは2 mL極低温バイアル用
スリップØ、13 mm	Karl Hecht™アシスタント&トレード;
ジメチルスルホキシド(DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
DMEM/F-12、グルタミン無し	Thermo Fisher Scientific	21331020
DNAse I	Sigma-Aldrich	10104159001
Dulbecco′リン酸緩衝生理食塩水(PBS)1x	Sigma-Aldrich	D8537
Falcon 100 mm TC処理細胞培養ディッシュ	コーニング®
Falcon 24ウェルクリアフラットボトム	コーニング®	353047	TC処理マルチウェル細胞培養プレート、蓋付き、滅菌
菌	InvivoGen	ant-fn-1
ゲンタマイシン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15750-037
ヘパリン	Sigma-Aldrich	H3149-100KU
HEPES	Sigma-Aldrich	H-3375
ヒト EGF	PeproTech	AF-100-15-1MG
ヒト FGF-basic	PeproTech	100-18B-1MG
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020
L-Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030-024
N-2 Supplement (100x )	Thermo Fisher Scientific	17502-048
PDL	Sigma-Aldrich	P7886
Serum acrodisc 37 mm syringe filter with GF/0.2 µm Supor	PALL Corporation	4525
トリプシン阻害剤	Thermo Fisher Scientific	17075-029
トリプシン-EDTA(0.05%)、フェノールレッド	サーモフィッシャーサイエンティフィック	25300054
ツァイスZ1 アポトーム3顕微鏡	ツァイス		ストレート広視野落射蛍光顕微鏡

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