光遺伝学的アロステリック制御によるタンパク質活性の時空間制御

サマリー

このプロトコルは、タンパク質活性の可逆的な時空間制御のための設計された青色光活性化アロステリックスイッチ(LightR)ドメインの適用について説明しています。この研究では、Srcチロシンキナーゼをモデルとして利用し、光制御Src(LightR-Src)を開発および特性評価するための精巧なプロトコルを提供します。これは、酵素クラス間でのこのアプローチの多様性を示しています。

要約

オプトジェネティクスは、酵素活性の複雑な時空間制御を細胞内分解能まで模倣する可能性を提供します。しかし、ほとんどのオプトジェネティクスアプローチは、さまざまな標的タンパク質に適用可能な単一のツールに複数の機能を統合するという大きな課題に直面することがよくあります。ON/OFFキネティクスの正確な制御、暗闇での漏れの最小化、細胞内精度での哺乳類細胞の効率的な性能の実証は、この分野で直面する最も一般的な課題の一部です。有望な解決策は、合理的に設計された光感受性ドメインを適用して、タンパク質活性をアロステリックに制御することにあります。その戦略を使用して、必要なすべての機能を組み合わせた光遺伝学的方法を生成しました。このアプローチでは、光制御アロステリックスイッチモジュール(LightR)を標的タンパク質に組み込み、青色(465 nm)光を使用して酵素活性を調節します。LightRドメインは、2つのVivid(VVD)光受容体ドメインをリンクすることによって生成され、酵素の触媒ドメイン内の小さな柔軟なループに組み込むことができる光感受性クランプを作成します。暗い状態では、LightRクランプは開いているため、酵素の触媒ドメインが歪んで不活性化されます。青色光にさらされると、LightRドメインは閉じて触媒ドメインの構造と酵素活性を回復します。この論文では、光制御プロテインキナーゼを作製するための設計戦略について議論し、ブルーライトによるその制御、可逆性、速度論、および細胞内レベルでの精密な制御を実証し、厳密な時空間精度を可能にします。Srcチロシンキナーゼをモデルとして、LightR-Srcキナーゼ活性を効果的に制御するためのプロトコールを展示します。また、さまざまな酵素クラス間でのLightRの適用性を実証し、さまざまな疾患におけるシグナル伝達経路のメカニズムの問題に対処するツールシステムの有用性を拡大します。

概要

細胞が外部シグナルを解釈し、生理学的または病理学的状況でそれらを特定の応答に変換する能力は、タンパク質の専用グループによって指示されます。このような複雑な応答に対するタンパク質の寄与は、多くの場合、その細胞内位置、発現レベル、および一過性、持続性、または振動性の活性化のタイミングによって定義されます。シグナル伝達の制御におけるこれらの個々のパラメータの役割を解剖するには、細胞内レベルでのタンパク質活性の複雑な時空間制御を再現できる方法が必要です。遺伝子操作や低分子阻害剤などの従来の技術は、この点で不十分です。対照的に、光遺伝学的手法は、生理学的および病理学的プロセスを操作または模倣することにより、生物学的プロセスの解剖の可能性を約束します。しかし、現在のツールは、広範な適用性や細胞内制御に欠けていることがよくあります。いくつかの既存の戦略は、タンパク質の局在と相互作用の厳密な制御を達成します。しかし、酵素活性に対する直接的な制御は欠^{如しています}1,2,3,4。他のものは酵素活性の調節を可能にするが、細胞内制御を欠いているか、または異なる酵素クラス間での適用性が限られている可能性がある5,6,7,8,9。このプロトコール論文では、オプトジェネティクスの利点を1つのツールに組み合わせた新しいタンパク質工学法、すなわち、厳密な時間調節、調整可能な速度論、細胞内制御、および広範な酵素の適用性¹⁰について説明します。私たちは、目的の標的タンパク質に挿入されるとアロステリックスイッチとして機能する光制御(LightR)ドメインを設計しました。この戦略により、生細胞における目的のタンパク質の活性化と不活性化を厳密に時空間的に制御することができます。

ここでは、いくつかの酵素クラスにわたるLightR光遺伝学ツールの設計と応用戦略について説明します。この研究では、光制御型チロシンキナーゼSrc(LightR-Src)の開発、特性評価、および応用のための段階的なプロトコールを提供します。この研究は、LightRスイッチの不活性化速度論の調整可能な可能性をさらに実証しています。低速不活性化LightRスイッチは、照明の頻度を減らしても酵素活性を維持できますが、高速サイクリングバージョンのFastLightRは、活性化のためにより頻繁な照明を必要としますが、照明をオフにすると急速に不活性化を示します。生細胞におけるFastLightR-Srcの活性化/不活性化は、細胞の拡散と収縮のサイクルを誘導します。FastLightR-Src誘導性細胞拡散は、Srcキナーゼ^11,12の生理学的役割と一致しています。FastLightR-Srcは、不活性化速度が速いため、細胞内レベルでも制御でき、局所的な突起の刺激と細胞分極をもたらします。LightRツールが他の種類の酵素に適用可能であることを実証するために、遺伝子操作された光制御キナーゼbRaf(LightR-bRaf、FastLightR-bRaf)と部位特異的DNAリコンビナーゼCre(LightR-Cre)による同様の成功について簡単に説明します。全体として、このアプローチは、多様な疾患の病態生理学を形成する複雑なシグナル伝達経路の理解を前進させる可能性を秘めています。

プロトコル

1. LightRの設計・開発(図1)

1. 戦略計画
   注:LightRドメインは、Neurospora crassaの2つのタンデム接続されたVivid(VVD)光受容体ドメインで構成されています^13,14,15,16.VVDは光の存在下でホモ二量体化し、このような二量体化には、あるVVDモノマーのN末端を別のVVDモノマーのC末端(図1A).2つのVVDドメインをフレキシブルリンカーで接続すると、暗闇では開き、青色光で照らされると閉じるクランプ状のドメインが作成されます。このクランプを酵素の触媒ドメインに組み込むことで、光を介した活性制御が可能になります。暗闇では、オープンクランプがドメインを歪め、酵素を不活性化します。ブルーライトで照らすとクランプが閉じ、酵素の活性が回復します(図1B).この概念は、プロテインキナーゼやDNAリコンビナーゼなど、さまざまなファミリーの酵素に適用できます¹⁰ (図1C).
   1. LightRのデザイン
      1. 2つのVVD分子を結合するには、各モノマー間に柔軟な22アミノ酸リンカー(GGS)4G(GGS)3を使用します。
         注:リンカーは、VVDモノマーの会合と解離に対応するのに十分な柔軟性と長さを提供します。
      2. GPGGSGGリンカとGSGGPGリンカをLightRドメインのN末端とC末端にそれぞれ追加します。
         注:リンカーの長さと組成は、特定のタンパク質に合わせて調整する必要がある場合があります。より厳しい規制が必要な場合には、より短いGSGリンカーとシングルGlyリンカーが日常的に使用されます。挿入ループのサイズと触媒残基への近接性も、制御のダイナミックレンジに影響を与えます。ループが短いほど、触媒活性の調節が厳しくなる可能性が高くなりますが、照明後の活性が低下する可能性があります。LightRドメインの配列は 、補足表1に示されています。
   2. LightRの挿入
      注:適切なLightR挿入部位は、その相互作用を立体的にブロックしたり、その生物学的役割に影響を与える不可逆的な構造変化を引き起こしたりすることなく、標的ドメイン機能の厳密な制御を可能にします。標的タンパク質の結晶構造は、LightRの挿入のためのこのような柔軟なループ領域の同定における理想的なガイドです。必要に応じて、近い同族体の結晶構造で十分です。考慮すべき一般的な基準を以下に示します。
      1. 挿入ループが酵素の重要な触媒要素に構造的に結合していることを確認します。選択した挿入ループがタンパク質の既存の結合部位ではなく、LightRの挿入が立体効果による機能的相互作用を潜在的に中断しないことを確認してください。
      2. 最初の戦略として、LightRを挿入するときに挿入ループ内の1つのアミノ酸を置き換えます。溶媒に曝露され、分子内相互作用に関与していない極性または低分子のアミノ酸(Glu、Arg、Lys、Glyなど)を含む挿入ループの中央を標的にします。
         注:1つのアミノ酸置換が機能タンパク質をもたらさない場合、LightRコンストラクトの最適化には、複数のアミノ酸または挿入ループ全体の置換が必要になります。定義されたループ内の LightR の複数の挿入サイトの機能を評価します。
      3. 標的酵素が内因性調節とは無関係に動作することを確認します。これを達成するには、挿入テンプレートに酵素の構成的に活性な変異体バージョンを使用します。
         注:野生型酵素はLightRコンストラクトの生成にも使用できますが、これにより、内因性メカニズムと光によって制御されるAND依存性システムが生じる可能性があります。
      4. ポジティブコントロールとネガティブコントロールは、LightR酵素活性解析に不可欠です。内因性タンパク質の構成的に活性な変異体をポジティブコントロールとして使用し、標的LightR酵素の触媒的に不活性な変異体バージョンをネガティブコントロールとして使用します。
         注:不活性化変異を選択する際には、LightR酵素フォールディングの不可逆性を乱さないように、変異がLightR挿入部位から十分に離れていることを確認することが重要です。以上の基準に基づき、SrcキナーゼのLightR挿入部位は、ATP結合Gループ/グリシンリッチループ領域の高度に保存されたGXGXXGモチーフとβ鎖を介して構造的に結合したフレキシブルループ領域で選択されます。重要なことに、それはATP結合ポケットおよび基質結合領域^10,17から離れた位置に配置されている(図1C(i))。
         注:キナーゼ間の構造的相同性により、bRafのLightR挿入部位は、Srcの挿入部位と同じ構造ループで選択されます(図1C(ii))。
         注:セクション1.1.2に記載されている原理に基づいて、非キナーゼであるCreリコンビナーゼのLightR挿入部位は、触媒コア、すなわちDNA結合部位から離れたフレキシブルループの1つで選択されます。しかし、挿入ループは依然としてαヘリックスを介してDNA結合ドメイン内の重要な触媒残基に構造的に結合しており、LightR-Creの機能を確実に成功させています(図1C(iii))。現在のプロトコルに記載されているさまざまな酵素のポジティブコントロールとネガティブコントロールを持つすべての挿入部位は、補足表2に詳述されています。
   3. FastLightRの開発。
      注:LightRの両方のVVDにI85V変異を導入すると、変異体のダーク状態への急速な変換に起因する、より高速な活性化-不活性化のダイナミクスが可能になります^18,19。FastLightR-SrcおよびFastLightR-bRafを高速不活化速度で生成することで、活性化と不活性化の厳密な時間的制御が可能になります。これにより、生細胞におけるLightR-Srcの細胞内制御が可能になります。
      注:Creリコンビナーゼ活性は不可逆的なDNA組換えをもたらします。したがって、LightR の可逆性特性は適用されません。
      注:LightRコンストラクトの検出を容易にするために、蛍光タンパク質または任意の他の適切なタグを標的タンパク質のN末端またはC末端に付加することができる。本研究では、LightR-SrcにmCherry-mycを、LightR-bRafにVenusを、LightR-CreリコンビナーゼにmiRFP670を使用しました。
2. クローニング戦略
   注:クローニングアプローチは、従来のアプローチとは異なり、特定の制限部位に依存しない部位特異的突然変異誘発に基づいています^10,20.
   1. 「メガプライマー」の生成
      1. LightR遺伝子をコドン最適化して、哺乳類細胞における真菌起源の2つのタンデムVVD DNA配列の安定した発現を確保し、PCRを使用したエラーのないクローニングのために配列を可能な限り異なるものにします。コドン最適化を実行するには、手順1.2.1.2-1.2.1.3に従います。
      2. VVDのアミノ酸配列と選択したリンカーを並べて、LightRの理論配列マップを作成します。
      3. コドン最適化のための高度なアルゴリズムを利用するオンラインコドン最適化プラットフォームに配列を貼り付けて、複雑さを最小限に抑えて最適な配列オプションを決定します。ターゲット生物が選択されていること、読み取りフレームが維持されていること、および最適化のためにVVD配列が選択されていることを確認します。
      4. カスタム合成フラグメント( 補足表1参照)として、または以前に公開されたLightRコンストラクト¹⁰からLightR DNAを取得する。
      5. LightR遺伝子を増幅して、図1Dに概説した^前述の20戦略を使用して「メガプライマー」を生成します。LightR「Megaprimer」を、特定のDNAポリメラーゼに関するメーカーの推奨に従い、以下のPCR反応混合物を使用してPCRで合成します。
         5x DNAポリメラーゼ適合バッファー:10 μL
         100 μM フォワードメガプライマー: 0.5 μL
         100 μM リバースメガプライマー:0.5 μL
         10 nM dNTPミックス:2 μL
         DNAポリメラーゼ(2000ユニット/mL):1μl(0.02U/μL)
         50 ng テンプレート DNA: 1 μL
         PCRグレードの水:35 μL
         注:ここでは、ユニバーサルプライマーアニーリング温度を備えた高忠実度のホットスタートDNAポリメラーゼが使用されます。
      6. 得られたメガプライマーをアガロースゲル電気泳動で分離します。生成物の長さは約1000ヌクレオチドです。アガロースゲルからメガプライマーを取り出し、ゲル抽出キットを使用して、メーカーの推奨に従うか、または類似の技術を使用して精製します。
   2. 部位特異的突然変異導入によるLightR遺伝子の挿入:LightRを挿入し、目的のアミノ酸またはアミノ酸の長さを置き換えます。テンプレートプラスミドは、LightRドメインが挿入されるものになります。以下の混合物を用いて、前述^した20 と同様にPCR反応を行う。
      5x DNA ポリメラーゼ適合バッファー:5 μL
      10 nM dNTPミックス:1 μL
      DNAポリメラーゼ(2000ユニット/mL):1μL(0.02U/μL)
      50 ng ターゲットテンプレート DNA: 1 μL
      抽出されたメガプライマー(計算質量):10 μL
      DMSO:2.5μL
      PCRグレードの水:2.5μL
      注:メガプライマーの質量(ng)=目的のインサート/ベクターモル比xベクトルの質量xインサートとベクトルの長さの比率。使用される目的のインサート/ベクターモル比は3/1です。
   3. PCR反応終了後、1 μLのDpnI(2000ユニット/ mL)酵素を加えて、過剰なメチル化DNAのみを選択的に消化し、混合物を37°Cで1〜1.5時間インキュベートします。これにより、変更されたコンストラクトの歩留まりが大幅に向上します。
   4. 1-2 μLのPCR反応液を、メーカーのプロトコールに従ってDH5αコンピテントセルに形質転換します。
   5. Luria Broth(LB)-寒天プレートで細菌をプレート化し、適切な抗生物質を選択して選択します。プレートを37°Cで一晩または室温(RT;25-30°C)で72時間インキュベートします。
      注:コロニーが成長したLBプレートは、4°Cで最大1ヶ月間保存でき、プロトコールを一時停止することができます。
   6. コロニースクリーニングPCR
      1. PCRベースのコロニースクリーニングでは、LightRインサートでアニーリングし、約400〜700 bpのフラグメントを生成するようにDNAを標的とするプライマーを設計します。
      2. LBプレートから少量のコロニーを以下に示すPCRミックスに添加し、特定のDNAポリメラーゼに関するメーカーの推奨に従ってサーモサイクリングに進みます。
         2x Taq RED Master Mix:5 μL
         PCRグレードの水:5μL
         100 μM フォワードプライマー : 0.5 μL
         100 μM リバースプライマー:0.5 μL
      3. アガロースゲル電気泳動により陽性コロニーを確認します。
      4. 目的のPCR産物サイズを生成したコロニーを選択し、プラスミド骨格の抗生物質耐性に一致するように、抗生物質を含む3 mLのLBブロスに個別に接種します。その後、インキュベートし、37°Cで一晩振とうします。
      5. プラスミドDNA抽出用のプラスミド精製キットの製造元の指示に従って、液体培養物からプラスミドDNAを抽出し、シーケンシングによりインサートの存在を確認します。
         注:クローニングプライマーは 、補足表3にまとめられています。

2. 細胞プレーティングとLightR酵素活性の生化学的解析(図2A)

1. LightR-キナーゼ(LightR Src、FastLightR Src、LightR bRaf)の生化学的解析には、各実験グループごとに3.5 cm細胞培養皿あたり1 x 10⁶ LinXE細胞をプレートします。 補足表4を参照してください。
2. 細胞を37°Cおよび5%CO₂ で16〜18時間インキュベートします。
3. 翌日、製造元の推奨に従って適切なトランスフェクション試薬を使用して、選択したDNAコンストラクトで細胞をトランスフェクションします(補足表4)。
   注:最適なトランスフェクション試薬は、使用する細胞の構成物、ベクター、およびタイプによって異なります。この研究では、トランスフェクション試薬を使用して、3.5 cmのディッシュに2 μgのDNAを使用しました。最適なトランスフェクション試薬を決定するために、経験的試験を実施する必要があります。トランスフェクションされたコンストラクトは、青色光によって制御されるタンパク質を発現するため、トランスフェクションされた細胞を取り扱う後続のすべてのステップは、赤色光の下で実行する必要があります。トランスフェクションした細胞でプレートをアルミホイルで包んでからインキュベーターに入れ、偶発的な照明を防ぎます。
4. トランスフェクションの16〜18時間後、細胞を青色光¹⁰にさらす。これを行うには、465 nmの発光ダイオード(LED)パネルランプシステムを組織培養インキュベーターに配置します。穴あきプレキシガラスパネルをランプの10cm上に置いて、3 mW / cm²の所望の照明を取得します(補足ファイル1)。インキュベーター内の空気循環を中断なく維持するためには、穴あきパネルが必要です。所望の期間、細胞を照らします。
5. LightR-SrcおよびLightR-bRafの活性化には、連続照明を使用してください。連続照明の場合は、LEDパネルを手動でオン/オフします。
6. FastLightR Srcのアクティブ化/非アクティブ化サイクルを維持するには、手動またはマイクロコントローラーによって制御されるオン/オフサイクルを使用してください。
   注: 必要なコードを記述およびアップロードするための統合開発環境 (IDE) を提供するいくつかのソフトウェア ツールキットを利用できます。これらのツールキットは、C/C++プログラミングをサポートし、パルス照明の制御に不可欠な汎用入出力(GPIO)アクセスを提供します。これらの目的で使用されるプロトコルとコードの詳細な説明は、 補足ファイル1に記載されています。
7. 実験のそれぞれの時点(補足表4)の終了時に、安全な赤色灯の下で細胞を採取します。培地を吸引し、細胞を冷たいPBSで洗浄します。
8. タンパク質を単離するには、500 μLの2x Laemmliサンプルバッファーに5% v/v 2-メルカプトエタノールを添加して細胞を溶解します。ライセートを100°Cで5分間インキュベートします。タンパク質ゲル電気泳動およびウェスタンブロッティング²¹による細胞溶解物の分析。
   注:2x Laemmli バッファーの組成は次のとおりです: 500 mL の場合: 5.18 g の Tris-HCL、131.5 mL のグリセロール、52.5 mL の 20% SDS、0.5 g のブロモフェノール ブルー、最終 pH 6.8。
9. Tyr249上の内因性p130casおよびTyrY118上のパキシリンのリン酸化レベルを評価することにより、LightR-Src活性を評価します^22,23(図2)。Ser217/221 の MEK1 と TyrY202/204 の ERK1/2 のリン酸化レベルを評価することにより、LightR-bRaf 活性を評価します^24,25。

3. LightR-Cre活性の機能解析

1. LightR-Cre活性の機能解析には、3.5 cm細胞培養皿あたり1 x 10⁶ LinXE細胞をプレート化します。細胞を37°Cおよび5%CO₂ で16〜18時間インキュベートします。
2. セクション2、 図2A、および 補足表5に概説されているプロトコルに従って細胞をトランスフェクションします。LightR-Cre-iRFP670とレポータープラスミドFloxed-STOP-mCherry²の比率1:9で、合計2 μgのDNAを共トランスフェクションします。
3. トランスフェクション後16-18時間後、細胞を照らします。LightR-Creを効率的に作動させるには、長時間の照明が必要です。したがって、光毒性を避けるために、セクション2および 補足ファイル1で詳述されているように、マイクロコントローラによって制御される465nm LEDパネルランプシステムを利用して、2秒のONサイクルと20秒のOFFサイクルで8時間のパルス照明を使用してください。
4. 落射蛍光顕微鏡と20倍エア対物レンズを使用してイメージングを行います。LightR-Cre-iRFP670の可視化にはCy5フィルタセットを、Floxed-mCherry発現からのmCherryの可視化にはRFPフィルタセットを使用します。
   注:イメージングには、Cy5 / RFPライトキューブを備えた落射蛍光顕微鏡が使用されます。

4. ライブセルイメージング用サンプルの調製

1. 細胞培養培地中の35 mm組織培養ディッシュあたり2 x 10⁵ HeLa細胞をプレートし、37°Cおよび5%CO₂で2時間インキュベートします。
2. 細胞が結合し、コンフルエンシーが約60%〜70%になったら、HeLa細胞を次のいずれかの混合物で共トランスフェクションします:(i)0.85 μgのFastLightR-Src-mCherry-myc/0.15 μgのStargazin-iRFP、または(ii)0.75 μgのFastLightR-bRaf-Venus/0.25 μgのmCherry-ERK2
   注:FastLightR-Src実験では、Stargazin-iRFPを使用して細胞拡散分析用の原形質膜を標識します。より高いFastLightR-Src発現が必要な場合は、stargazin-iRFPを省略し、代わりに1μgのFastLightR-Srcを使用することができます。このような場合、メンブレン色素を使用して細胞を視覚化する必要があります。原形質膜染色は、細胞膜の標識に日常的に使用されています。
3. 細胞の偶発的な照明を避けるために、皿をアルミホイルで覆い、37°Cおよび5%CO₂で16〜18時間インキュベートします。
4. 赤色光照明の下で次の手順をすべて完了して、コンストラクトが誤って活性化しないようにします。白色光への曝露は、LightR-キナーゼの活性化を誘導し、その後の結果に影響を与える可能性があります。
5. 同日、丸いガラスカバースリップ3枚(直径25mm、厚さ0.17mm)に5mg/LフィブロネクチンをPBS溶液で37°Cで一晩コーティングします。
6. トランスフェクション後16-18時間でカバースリップをPBSですすぎ、トランスフェクションしたHeLa細胞を~1 x 10⁵ 個ずつ各カバースリップにプレート化します。細胞培養培地で37°Cおよび5%CO₂で2時間インキュベートします。
   注:視野内のセルが互いに接触しないようにするには、低い播種密度が必要です。
7. LevobitzのL-15イメージングメディアにFBSを添加して、イメージングメディアを調製し、最終濃度を5%にします。溶液を0.22μmのフィルターでろ過し、37°Cに温めます。
8. 鉱油を37°Cに予温します。
9. 細胞を含むカバースリップをPBSで2回洗浄します。メンブレン色素を使用する場合は、カバーガラスを洗う前に、製造元の指示に従って細胞を染色してください。
10. カバーガラスを生細胞イメージングチャンバーに慎重に入れます。1 mLのL-15イメージングメディアをチャンバーに加えます。
11. 培地の上に1 mLの鉱油を加えて、イメージングプロセス中の蒸発を防ぎます。
12. イメージングの準備が整うまで、チャンバーを37°Cの光から保護してください。

5. FastLightR-Srcの全球活性化とイメージング(図3)

1. 青色LED顕微鏡リングライトを顕微鏡コンデンサーに取り付け、サンプルホルダーから約1.5cm上に配置します。リングライトのAC / DC制御リレーを顕微鏡コンピューターに接続します。
   注:この研究の実験では、照明はイメージングソフトウェアを介してトランジスタ-トランジスタロジック(TTL)インターフェースを介して制御されました。エピ蛍光照明は、外部照明源が利用できない場合にLightRコンストラクトを全球的に活性化するためにも使用できます。490/20 nm励起フィルターなどのGFP励起波長は、LightRの活性化に効果的です。
2. チャンバーを37°Cに予熱した顕微鏡ステージに置き、FastLightR-Src-mCherryおよびStargazin-iRFP(図3B)またはFastLightR-bRaf-VenusおよびmCherry ERK-2(図5B)を発現する細胞を選択します。
3. 全地球照明およびイメージング実験の研究には、アポクロマート補正、フラットフィールド補正、および高開口数を備えた顕微鏡互換の高性能対物レンズ(40倍)を使用します。
   1. Srcキナーゼの全球照明ベースの研究では、561/10 nm励起フィルターと595/40 nm発光フィルターを使用してFastLightR-Src-mCherryを可視化し、640/20 nm励起フィルターと655LP発光フィルターを使用してスターガジン-iRFPを可視化します。
   2. bRafキナーゼの全地球照明ベースの研究では、514/10 nm励起フィルターと540/21 nm発光フィルターを使用してFastLightR-bRaf-Venusを可視化し、561/10 nm励起フィルターと595/40 nm発光フィルターを使用してmCherry-ERK-2を可視化します。
   3. すべての蛍光イメージングチャンネルでマルチバンドポリグラフミラーを使用します。
4. 実験条件に応じて、次の推奨事項を検討してください。
   1. 照明の少なくとも10分前に細胞を画像化して、細胞のベースライン活性を確立します。
      注:このベースラインは、照明によるFastLightRキナーゼの活性化が細胞の挙動またはタンパク質の局在化に何らかの変化を誘発するかどうかを判断するために必要です。また、より長い期間の基礎イメージングを実行して、より大きな統計的有意性を提供することもできます。
   2. FastLightRsの急速な不活性化速度により、イメージング用の多くの細胞を含めると、ステージ位置間でSrc/bRafが不活性化され、その応答が弱まる可能性があります。このようなエラーを回避するには、記載されたプロトコルでFastLightR-Kinase活性を解析しながら4細胞/分を画像化し、選択した各細胞を毎分合計110分間画像化します(補足ファイル2)。
   3. 連続照明よりもパルス照明を使用して、青色光の潜在的な光毒性の影響を減らします。4つのセル/分ごとに12秒間の照明が効果的です(補足ファイル2、 図3A)。
      注:照明サイクルは、さまざまな構成物と照明源タイプについて経験的に決定する必要があります。
   4. 細胞イメージング中は、蛍光チャンネルのブリードスルーを避けるために、照明をオフにしてください。
      注:一度にイメージングする細胞が多すぎると、サンプルで利用可能な合計照明時間が短くなり、活性化が不十分なため反応が減衰します。
5. イメージング後、ムービーを.分析用のTIFスタックファイル形式。
   注:GFP落射蛍光法による照明はリング光に比べて均一性が低いため、GFP落射蛍光法を用いた実験では、より頻繁な照明が必要になります。これにより、実験ごとにイメージングされる細胞が少なくなります。

6. FastLightR-Srcの細胞内活性化とイメージング(図4)

1. チャンバーを37°Cに予熱した顕微鏡ステージに置き、FastLightR-Src-mCherryとStargazin-iRFPの両方を発現する単一の細胞を選択します。
2. 照らすセル内の特定の領域(ROI)を選択します。この研究では、選択した細胞の周辺にある小さな領域を選択します。
   注:局所照明には、FRAPモードのTIRFモジュールによって集光された445nmレーザー、またはイメージングソフトウェアを介してTTLインターフェースを介して制御されるマイクロミラーデバイスが使用されます。これらの実験には、パターン化された照明システムであれば、どのようなものでも機能します。スキャニングベースのシステムを使用する場合は、細胞に損傷を与えることなく十分な活性化を得るために、レーザー強度と均質性を決定します。
3. 選択した細胞を、照射前の基礎状態で20分間、局所的に照射しながら50分間、活性化後20分間、合計90分間、選択した細胞を画像化します(補足ファイル2)。
4. 活性化および不活性化については、LightRタンパク質を完全に不活性化できるように、標的タンパク質に適した適切な時間を与えてください。FastLightR-Srcの場合、残留活性をアブレーションするために少なくとも10分間の不活性化を許容し、局所照明の実証実験セットアップで20分間の不活性化を許可します。
5. イメージング後、ムービーを.分析用のTIFスタックファイル形式。

7. 細胞拡散解析

1. データ処理と分析のための画像を準備します。イメージが .TIF スタック形式。これらをイメージングソフトウェアから直接保存するか、オープンソースプログラムを使用して変換します。
2. 補足データ圧縮ファイル²⁶からCellGeoスクリプトパッケージをダウンロードします。
   注: CellGeo パッケージには、いくつかの異なるスクリプトが含まれています。プロトコルセクション7〜9で説明されている分析のタイプに基づいて、リストから目的のパッケージを選択します。
3. MovThresh というタイトルのスクリプトを開いて実行し、セルのマスクを作成します。
   1. [ファイル] > [インポート] (.tif) を選択し、セルの Stargazin-iRFP イメージを選択します。
   2. 左下隅のスクロールバーを使用してフレームをスキャンします。推奨されるしきい値が適切である場合は、ステップ 7.4 に進みます。
   3. 提案されたしきい値がセルの動作と一致しない場合は、[ カーブ選択]の下にあるスムージングカーブまたはカスタムカーブを選択します。カスタムカーブを作成するには、フレームをスクロールし、ウィンドウの右側でしきい値を調整します。
   4. [Re-Threshold] をクリックします。
   5. [ファイル] > [マスクとして保存] をクリックし、ファイルの名前を変更して、[名前を付けて保存] オプションを使用して保存します。
4. 新しく作成したスタックファイルをオープンソースの画像解析プログラムで開きます。
5. [画像] > [しきい値の調整] > [適用] > を選択します。
6. [解析]>[パーティクルを解析]>[表示結果を確認]->OKを選択します。
7. 各セルの面積の変化は、任意の時点での面積を青色光を照射する前の同じセルの平均面積で割ることにより計算します。
8. 面積の変化を折れ線グラフまたは棒グラフでプロットします。
9. 同じ条件下で処理されたすべての細胞の各時点の平均値と90%信頼区間を計算します。

8. 細胞エッジダイナミクス解析

1. プロトコルセクション7で説明されている手順を使用して、スタックファイルを準備します。
2. ProActiveというタイトルのスクリプトを開いて実行します。
   1. [ファイル] > [インポート マスク] > [マスク] (.tif) を選択し、MovThresh スクリプトを使用して作成したマスクを選択します。
   2. 右下隅で解析対象のアクティビティ(Protrusive、Retractive、 または Total)を選択します。
   3. 正規化のタイプを選択します。通常、これらの解析には面積正規化が使用されます。
   4. 左側のスライダーを使用して、参照の開始フレームを選択します。右側のラグ スライダーは、セルによって得られる面積と失われる面積を計測するために使用される 2 つの時間ポイント間のタイム ラグを決定します。
   5. 選択したフレームとラグ番号がムービーのフレーム数よりも加算が大きい場合、プレビュー画像は表示されません。これらの値をリセットして、フレームの合計数より小さくなります。
3. 突起または収縮のしきい値を変更するには、ResultsセクションのSmooth Curveのチェックボックスをオンにします。これにより、特定のウィンドウのしきい値が平均化されるため、小さな変動がアクティビティとして検出される問題を解決できます。
4. [範囲を実行] を選択して、フレーム スライダーとラグ スライダーで指定された時間にわたるアクティビティを計算します。
5. [ファイル] > [名前を付けて保存] >結果 (.mat)) を選択して数値データを保存し、それを使用して平均突出または収縮アクティビティを決定します。
6. 各時点の90%信頼区間を求めます。
   注:これにより、いくつかの異なる値の配列が保存されます。スクリプトに含まれている「ProActiveの使用方法」テキストファイルには、各値が何を表し、どのように決定されたかについての詳細な説明が提供されています²⁶。
7. アクティビティの視覚的表現を保存するには 、[ファイル] > [> イメージとして保存] (.tif) を選択します。

9. 重心シフト解析

1. 重心シフト解析には、重心座標を決定できるソフトウェアを使用します。
2. 解析ソフトウェアで、プロトコールセクション7に記載されているように、目的のセルのマスクされた画像スタックを開きます。
3. 「測定」>「統合形態測定解析」を選択し、「 プリファレンス」>「重心マークの描画」>「チェック」をクリックし、「 測定」を選択します。
   1. 移動前の重心座標を記録します (A)。
   2. 実験の終了時に重心座標を記録します (B)。
   3. 照明パターン(C)の中心の座標を記録します。
4. 3 つの点が収集されたので、角度 BAC⁸) を求めます。θ₁ は角度 ABC、θ₂ は角度 CBA に対応します (図 4Cii)。これは、次の式を使用して行います。
   cosθ = cos(θ₁ - θ₂) = cosθ₁cosθ₂ + sinθ₁sinθ₂
   注:計算機を使用して、使いやすいように座標から直接角度と距離を決定できます。
5. 重心の変位を求めるには、セルの重心がピクセル単位で移動した距離に、1 ピクセルが 0.4 μm に等しい変換係数を掛けます。ピクセルから距離への具体的な変換は、システムの倍率とカメラの設定によって異なります。
6. 重心シフトの角度と距離を決定したら、極座標の画像を生成できるグラフ作成ソフトウェアを開きます。
7. 重心シフト角度をθ測定値として挿入し、移動距離を半径として挿入します。分散分析を使用して、95%信頼区間を検定します。
8. 結果をプロットし、画像を保存します。

結果

LightR-Srcは、 図1A、Bで説明されている戦略に従って設計および生成されます。LightR-Srcの生化学的分析では、60分間の連続照明で青色光に応答する既知の内因性Src基質p130Cas(Y249)²² およびパキシリン(Y118)²³ のリン酸化にアクセスします(図2B)。特に、トランスフェクション後16-18時間の暗闇でのみLightR-Srcを発現させた場合、Srcキナーゼのバックグラウンド活性化は観察されません。さらに、D388R変異を有するLightR-Srcの触媒的に不活性な変異体は、Src基質のリン酸化を誘導せず、リン酸化が活性型LightR-Srcによって行われ、青色光照射の非特異的な影響によって引き起こされないことを示しています(図2B)。生細胞におけるSrc²⁷ キナーゼの振動活性の報告を認め、LightR-Srcが周期的な活性化を示すように調整できるかどうかを調べました。元のLightR-Srcは、ゆっくりとした不活性化速度を示し(図2C)、両方のVVDにI85V変異を持つ新しい変種であるFast-LightR-Srcの生成を促しました。 図2D は、Fast-LightR-Srcが著しく速い不活性化速度を示し、LightR-Srcが1時間以上光を消してから10分以内に完全に不活性化することを示しています。FastLightR-Srcを使用することで、活性化/不活性化のサイクルを繰り返すこともできました(図2E)。これらの結果は、LightRツールが生細胞内のSrc活性を特異的かつ厳密に制御する制御を達成する能力を総合的に示しています。

FastLightR-Srcの適用により、細胞の形態力学に対する一過性のSrc活性化の影響を評価することもできます。HeLa細胞でFastLightR-Srcが活性化されると細胞拡散が誘導され、FastLightR-Srcが不活性化されるとすぐにこのプロセスが停止します。活性化すると、FastLightR-Srcが核周囲コンパートメントから焦点接着および原形質膜への転座を観察しました。これは、野生型Srcキナーゼ^11,12が示す挙動です。触媒的に不活性な変異体D388RLightR-Srcを発現する照明細胞は、そのような拡散効果を示さない(図3B、C)。このことから、FastLightR-Srcは野生型と同様に機能することがさらに確認されています。細胞領域の局所的な照明は、局所的な蓄積によって示されるFastLightR-Srcの局所的な活性化をもたらし、焦点接着におけるLightR Srcの局所的な活性化をもたらし、局所的な膜突起の形成を伴います(図4B(i)、(ii))および細胞重心シフト(図4C(i)、(ii))その結果、細胞が光に向かって移動します。Srcキナーゼの制御のためのLightRツールのアプリケーションを確立した上で、bRafキナーゼとDNAリコンビナーゼCreの制御にまで及ぶLightRの幅広い有用性を紹介します。LightR-bRafの解析では、bRafの内因性基質であるMEK1の光誘起リン酸化、およびERK1/2キナーゼ^24,25の下流のリン酸化が、恒常的に活性なbRaf変異体(V600E)のリン酸化に匹敵するレベルで行われていることが示されています(図5A)。逆に、触媒的に不活性なD575RLightR-bRafは、非照明LightR-bRafサンプルに匹敵するMEK1およびERK1/2リン酸化を示さず、LightR-bRaf調節の特異性を確認しています。ライブセルイメージングは、FastLightR-bRafの活性化/不活性化のサイクルを繰り返すと、ERK2の核内外への反復的な転座が誘導されることを示し、bRaf活性化の既知の結果と裏付けています²⁸(図5B)。LightR-Creの活性化により、レポーターmCherry遺伝子の組換えが成功し、LightRのさまざまなクラスの酵素への適用性が実証されています(図5C)。

図1:LightRアプローチの開発戦略 (A)暗状態の2つのVividモノマー(PDB:2PD7)と点灯状態のダイマー(PDB:3RH8)の結晶構造。(B)LightRデザインの漫画表現。触媒ドメインに挿入された2つのタンデム結合VVD光受容体は、暗闇でのタンパク質の触媒活性を混乱させます。青色光に応答したVVDの二量体化は、タンパク質活性を回復させます。(C)(i)Src(PDB 1Y57)、および(ii)bRaf(PDB 4MNF)触媒ドメインの結晶構造。(ii) Creリコンビナーゼ(PDB 1MA7)の構造。黄色の矢印はLightR挿入部位を示し、置換されたアミノ酸を示します。(D)標的酵素配列¹⁹へのLightRドメイン挿入のためのクローニング戦略の模式図。ステップ1では、挿入部位の前後に標的遺伝子でアニーリングする部位に隣接するLightRフラグメントのPCR合成に、特別に設計されたプライマーを使用します。ステップ2では、このようにして作製されたLightRフラグメントが、Quick change部位特異的突然変異導入により、標的酵素遺伝子にLightRを挿入するための「メガプライマー」として使用されることが示された。パネルA-Cは、Shaayaらの許可を得て適応および変更されています¹⁰。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:遺伝子操作されたLightRタンパク質の生化学的特性評価 (A)LightR Srcの生化学的特性評価のための実験プロトコルの概略図 (B)C末端にmCherryとmycタグを持つLightR Srcコンストラクトを一過性に発現するLinXE細胞を、465 nm LEDセットアップを使用して60分間連続的に青色光で照射した。細胞ライセートをプローブして、Src基質、パキシリン、およびp130Casのリン酸化を調べました。ウェスタンブロットの結果は、生細胞におけるLightR-Srcの活性化に応答した内因性パキシリンおよびp130Casのリン酸化を示しています。(C,D)C末端にタンデムmCherry-mycタグを持つ示されたLightR-Srcコンストラクトを一過性に発現するLinXE細胞を、指定時間(0分および30分)連続的に青色光に曝露した後、指定された時間だけ暗所に置きました。細胞ライセートをSrc基質のリン酸化についてプローブし、(C)LightR-Srcと(D)FastLightR-Srcの間の活性化と不活性化の動力学の比較を示しました。(E)示されたLightR-Srcコンストラクトを一過性に発現するLinXE細胞を、C末端にタンデムmCherry-mycタグを付加し、青色光を20分間連続的に照射した後、暗所で10分間インキュベートし、光中で20分間インキュベートを繰り返した。細胞ライセートを採取し、Src基質のリン酸化についてプローブし、Srcキナーゼの活性化状態と不活性化状態の間のサイクリングの効率を示しました。すべての実験を少なくとも3回繰り返し、同様の結果を得た。各ウェスタンブロットパネルB-Eの横に表示されている数字は、タンパク質の分子量を表しており、キロダルトン(kDa)で測定されています。パネルB-Eは、Shaayaらの許可を得て適応および変更されています¹⁰。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:FastLightR-Srcの活動に対する全球的および時間的照明の制御と影響 (A)全球的および時間的周期的照明の実験スキームとその後のデータ解析の漫画表現。(B,C)広視野蛍光顕微鏡を用いたタイムラプスシリーズから得られたHeLa細胞の代表的な画像には、青色光による細胞形態の制御とFastLightR-Srcの局在が描かれています。これらの細胞は、Stargazin-iRFP670(原形質膜マーカー)とともに、FastLightR-Src-mCherry-myc(N = 10細胞)または触媒的に不活性なD388RLightR-Src-mCherry-myc(N = 9細胞)を一過性に共発現していました。生細胞イメージングは、細胞全体に青色光(青色の輪郭)を照射しながら、1分ごとに行われました。(B)黄色の矢印は、焦点接着に似た構造でのFastLightR-Srcの局在を示しています。画像は、広視野蛍光顕微鏡を用いたHeLa細胞のタイムラプスシリーズから得られたものです。(C)FastLightR-SrcとD388RLightR-Srcの活性化によって誘発される細胞領域の変化の定量化を各パネルに示します。イルミネーション ウィンドウは青い四角形で示されます。グラフは平均±90%の信頼区間を表します。パネルBとCは、Shaayaらの許可を得て改変・改変されたものです¹⁰。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:局所的な細胞内照明制御とFastLightR-Src活性への影響。 (A)局所的な細胞内照明制御の実験スキームの漫画表現。(B) (i) FastLightR-Src-mCherryを発現するHeLa細胞を青色光で局所的に照射したタイムラプスシーケンス(青色の円で示)。画像は、全反射蛍光顕微鏡(60倍対物レンズ)を使用して毎分撮影されました。画像は、指定された時間間隔で取得された反転コントラスト画像として表示されます。(ii)指定された時間間隔で形成された突起を示す細胞投影画像。実験のタイムライン上で細胞形態を閾値化し、マスキングすることは、細胞の拡散と細胞エッジのダイナミクスを解析するためのプラットフォームを表しています。セルの指定された照らされた領域は、青い円で囲まれています。(C) (i) 局所的な青色光照明に対する重心の移動距離 (d) と偏差角 (θ) を表すセルの極プロット。黒い点は、触媒的に不活性なD388RLightR-Src(N=6細胞)またはFastLightR-Src(N=10細胞)を発現する個々のHeLa細胞を表しています。(ii)局所的な青色光刺激の開始(1)から結論(2)まで細胞の重心が移動した重心シフト距離(d)を示す概略図。偏差角(θ)は、青色光の位置からのセルの重心移動の発散の程度を示します。薄い灰色の陰影は、局所的なFastLightR-Src刺激に応答して細胞が突出した領域を示しています。セルの指定された照らされた領域は、青い実線の円で示されます。パネルBおよびCは、Shaayaら¹⁰から適応および修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:LightRアプローチの幅広い適用性。 (A)LightR-bRafの制御。LightR-bRaf-Venus、触媒的に不活性なD575R LightR-bRaf Venus、または構成的に活性なbRaf(V600E)-Venusを一過性に発現するLinXE細胞を、指定された時間連続的に青色光に曝露した。細胞ライセートを、示されたタンパク質のリン酸化についてプローブしました。(B)広視野蛍光顕微鏡を用いた一連の生細胞イメージングのタイムラプスから得られた代表的な画像は、FastLightR-bRaf-VenusとmCherry-ERK2を一過性に共発現するLinXE細胞における全球的な青色光応答の制御を示しています。これらの細胞は、青色の輪郭で描かれた指定された時間、青色光(毎秒50ミリ秒のパルス、毎分50パルス)で全球的に照らされました。mCherry-ERK2の生細胞イメージングを毎分実施しました。黄色の矢印は、操作されたbRafの青色光活性化によって誘導される核ERK2局在の段階を示しています。(C)LinXE細胞をFloxed-stop-mCherryレポーターおよびLightR-Cre-iRFP670と一過性に同時トランスフェクトした。細胞は、暗い条件またはパルス状の青色光(2秒オン、10秒オフ)のいずれかに最大8時間さらされました。各チャンネルのすべての時点の画像は、広視野蛍光顕微鏡(10倍対物レンズ)を使用して同じ設定で取得し、サンプル間のタンパク質発現レベルの比較を容易にするために、一貫した輝度とコントラストレベルに調整しました。実験を少なくとも3回繰り返し、同様の結果を得ました。この図は、Shaaya et ^al.10から適応および修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足表1:LightR配列。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表2:LightR挿入部位の説明とLightR-Protein設計のチェックリスト。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表3:LightRクローニング用プライマー。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表4:LightR-Protein活性の生化学的分析のためのトランスフェクション条件。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表5:LightR-Protein活性のイメージングベースの分析のためのトランスフェクション条件。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:統合開発環境(IDE)を使用したパルス照明。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル2:顕微鏡の照明設定。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

私たちの研究は、多様なシグナル伝達経路の調査のための光遺伝学的アプローチを提示し、さまざまな生物学的問題に取り組む上でのその広範な適用性を示しています。LightRツールシステムは、(1)タンパク質活性のアロステリック制御、(2)活性化と不活性化の異なる動態を達成するために調整できる活性の厳密な時間制御、(3)細胞内レベルでの活性の空間分解能、(4)シグナル伝達調節と生物学的活性の特異性、(5)さまざまな標的タンパク質への幅広い適用性など、いくつかの重要な利点を提供します。特に、LightRはこれらすべての利点を1つのツールに独自に統合し、それによって大きな前進をもたらします。

アロステリックスイッチとしてのLightRの設計には、いくつかの利点があります。LightRは、小さなフレキシブルループに挿入したときにタンパク質活性を制御することができるため、さまざまな構造と機能を持つさまざまなタンパク質に適用するためのかなりの汎用性を提供します。アロステリックスイッチであるLightRは、目的のタンパク質の標的ドメインのみを調節し、タンパク質の他のドメインに影響を与えません。したがって、この方法では、結合パートナーとの相互作用や細胞内の天然な局在化など、タンパク質の本質的な機能を損なうことなく、活性を特異的に制御することができます。二成分光遺伝学システムは、ホモまたはヘテロ二量体化の光媒介制御を用いて、タンパク質の局在、相互作用、またはその他の重要な機能の調節にうまく適用されている 29,30,31,32,33,34,35.しかし、これらのシステムでは、2つのタンパク質の等モル発現を最適化する必要があることが多く、その適用はより困難になります。LightRシステムを使用したアロステリック制御は、単一のタンパク質内で達成されるため、細胞シグナル伝達の調査にはるかに汎用性の高いアプローチを提供します。

LightRスイッチの異なるタンパク質クラスへの幅広い適用性は、部分的には、LightRドメイン内の異なるモジュールの最適化によって達成されます。LightRを目的のタンパク質に接続するリンカーと、LightR内の2つのVVDドメインを接続するリンカー(VVD間リンカー)は、制御効率に影響を与える可能性があります。インターVVDフレキシブルリンカー(GGS)4G(GGS)3を選択することで、LightRドメイン内でのVVDモノマーの会合と解離を確実にするのに十分な柔軟性と長さが得られます。このリンカーは、これまでにすべての標的タンパク質の良好な制御を確実にしています。しかし、LightRドメインが暗所でタンパク質を十分に不活性化しない場合、より硬いリンカーを導入してVVDドメインをさらに離し、LightRクランプの開口部を強化し、酵素を不活性に保つことができます。リンカーは、VVDの二量体化と標的タンパク質の活性化を可能にするのに十分な柔軟性を保持している必要があります。LightRを目的のタンパク質に結合するために、LightRドメインのN末端とC末端に付加された短いフレキシブルリンカーGPGGSGGおよびGSGGPGを使用します。それらは接続に十分な柔軟性を提供し、したがって、標的タンパク質の不可逆的な破壊を防ぎます。しかし、それらは十分に短いため、暗闇で標的タンパク質を歪めながら、光の中でタンパク質機能の回復を促進します。これらのリンカーは、多くのタンパク質アプリケーションにおいてLightRによる制御をサポートします。しかし、これらのリンカーが暗所でタンパク質を十分に不活性化しない可能性がある特定のケースでは、リンカーを短縮することが有益である可能性があります。このようなリンカーの短縮は、柔軟性を低下させ、暗闇でのオープンLightRクランプによって引き起こされる歪みを増加させ、それによって漏れを最小限に抑えることができます。それにもかかわらず、この調整は、点灯状態での構造的歪みの可能性により、酵素の最大活性を損なう可能性があります。あるいは、挿入ループ内の複数のアミノ酸を置き換えることで、コンフォメーションの不安定性が大きな問題にならない場合に、バランスの取れた柔軟性という同様の利点が得られる可能性があります。

多くの重要なシグナル伝達プロセスは、過渡的に活性化されるか、または振動的に制御される36,37,38,39,40,41,42,43。LightRツールの調整可能な機能により、複雑なシグナル伝達パターンを模倣することができるため、時間的に制御された生物学的プロセスを調査するための強力なアプローチが提供されます。これは、両方のVVDドメインにI85V変異を導入することにより、LightRのオフキネティクスを調節することで実現します。この変異により、暗黒状態でのVVDダイマーの半減期が18,000秒から780秒に減少します¹⁹。これにより、FastLightR-Enzymeの不活性化が促進されます。

また、高速不活性化動態により、細胞内分解能でのタンパク質活性の調節も可能になります。LightR酵素は、スローオフ速度論を持つため、活性化されたコンストラクトの細胞内拡散による細胞内活性化の影響を観察することが困難になる可能性があります。ファストオフキネティクスでは、局所照明ゾーンを超えて拡散するFastLightR酵素は、すぐに不活性化されます。特定の細胞内領域を選択的に活性化することにより、研究者はタンパク質の局所的な機能に関する洞察を得て、複雑な細胞経路やシグナル伝達ネットワークへのタンパク質の寄与をより深く理解することができます。

FastLightRは、細胞内のタンパク質活性を空間的および時間的に限定的に光学的に制御するために非常に貴重ですが、スローオフキネティクスが望ましいアプリケーションはまだあります。スローオフキネティクスを持つLightRは、持続的かつ強化されたブルーライト誘導活性が必要な研究で実装できます。これらのアプリケーションでは、連続的な光遺伝活性を維持するために必要な照明パルスはまれであるため、光毒性などの問題も最小限に抑えられます。異なるシナリオに対して、広範囲の運動学的修飾^10、18を単独で、または互いに並行して実装して、LightRの性能を調整して特定の実験のためのアプリケーションを最適化するための有望な解決策を提供することができる。

LightR酵素の適用性は、内因性の対応物の生物学的機能を模倣する能力によって決まります。そのため、それらの基質特異性、下流のシグナル伝達、および細胞内局在を評価することが重要です。LightR-Src活性の特異性は、パキシリンやp130CasなどのSrc基質のリン酸化によって確認されます^22,23。FastLightR-Srcは、周期的な照明下で核周囲領域と焦点接着の間を往復し、細胞の拡散をもたらします。このような現象は、天然のSrcキナーゼを用いて行われた以前の観察と見事に類似しており、Src生物学11,12,44,45,46,47の探索における本ツールの有効性をさらに確認している。LightR-bRafは、MEKキナーゼやERKキナーゼなどのシグナル複合体を標的とする特異性も示しています^24,25。さらに、FastLightR-bRafは、bRaf活性化²⁸の既知の結果である青色光に応答してERK原子力シャトルの周期振動を示す。LightR酵素が内因性タンパク質の機能を厳密に模倣する能力は、その機能を調べるための非常に貴重なツールを提供します。

上記の議論は、定義された細胞コンパートメント内で正確な細胞シグナル伝達経路を複製するLightRキナーゼの能力を示しています。このようなキナーゼの成功と同様に、LightR-Creは、P1バクテリオファージに由来する元のCreリコンビナーゼの機能性を示す実例モデルとして機能します。Creリコンビナーゼは、部位特異的リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーに属し、標的DNA上のloxPと呼ばれる2つの認識部位間の組換えを促進することによって機能します。このような組換えは、クロスオーバーイベントを通じてDNA再配列をもたらします。標的DNA上のloxP部位の方向性に基づいて、クロスオーバーイベントは、染色体要素の欠失、重複、または転座のいずれかをもたらし得る⁴⁸。Creリコンビナーゼは、誘導性遺伝子調節のin vivoモデルの生成に広く使用されています^49,50。しかし、他の自発的、化学的に誘導可能な、または光遺伝学的に誘導可能なcreリコンビナーゼシステムでは、動物モデルでDNA組換えがいつ、どこで誘導されるかの制御が限られています。LightR-Creは、DNA組換えの時間的および空間的な厳密な制御を可能にすることにより、これらの制限を克服します。さらに、LightRのチューニング性により、不要な漏れ活動を排除し、Creのレギュレーションを高精度で行うことができます。これらの能力は、疾患の病理学のモデリングと新しい治療法の開発に新たな機会をもたらします。

キナーゼおよびDNAリコンビナーゼにおけるLightRの正確な制御は、このツールが同じ戦略でいくつかのタンパク質に適用できることをさらに証明します。LightRは、さまざまな酵素クラスを活性化するだけでなく、他のタンパク質タイプにも結合できる可能性があり、アロステリック調節を利用して、タンパク質を特定細胞内領域に局在させたり、タンパク質間相互作用を誘導したり、ブルーライト誘導性バイオセンサーを設計したりすることができます。特定のドメインターゲティングのアロステリックな利点により、LightRsは、同じタンパク質内の他の化学遺伝学的および光遺伝学的アプローチと組み合わせて、生物学的プロセスを研究するための高度な調整性を達成することもできます。

私たちは、LightRを他の複数のタンパク質(準備中の原稿)に適用することに成功しています。この成功にもかかわらず、機能的なLightRタンパク質の開発は、特に適切な挿入部位を選択し、標的タンパク質の生物学的機能を正確に模倣する上で、潜在的な課題に直面する可能性があります。結晶構造が利用できない場合、研究者は予測された構造やアミノ酸配列情報に頼らざるを得ず、複数の挿入部位やアミノ酸置換を持つタンパク質を操作するためには、より多くのトラブルシューティングが必要になります。さらに、遺伝子操作されたタンパク質の活性は、細胞内の生物学的機能を正確に複製するために微調整する必要があります。これらの実験が成功するかどうかは、遺伝子操作されたタンパク質の正確な機能模倣にかかっており、その内因性相同体は、多くの場合、厳密なトラブルシューティングを必要とし、細胞の種類、標的タンパク質のクラスと種類、および青色光活性化の強度と持続時間によって異なる可能性があります。

結論として、LightRシステムは、タンパク質機能の正確な時空間制御を達成するための強力なツールを表しています。その堅牢性、調整性、および汎用性により、複雑な細胞プロセスの研究、シグナル伝達経路の解明、および遺伝子調節メカニズムの解明に非常に役立ちます。LightRシステムは、研究者にタンパク質活性に対する前例のない制御を提供することにより、基本的な生物学的プロセスの理解を前進させ、革新的な治療介入への道を開くことを約束します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
#1.5 ガラスカバースリップ 25 mm 丸	型 ワーナーインスツルメンツ	〒64-0715
1.5 mLチューブ	USAサイエンティフィック	cc7682-3394
2x Laemmli バッファー			500 mL用 5.18 g of Tris-HCL、グリセロール 131.5 mL、20% SDS 52.5 mL、ブロモフェノールブルー 0.5 g、最終 pH 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Buffer	サーモサイエンティフィック	F538L
60 LED顕微鏡リングライト	ボリ光学系	ML46241324	青色LED、直径60mm、5W
アガロース	GoldBiotech	A-201
Anti-Erk 1/2 抗体	細胞シグナル伝達	9102
抗 GAPDH 抗体	invitrogen	AM4300
抗 GFP	Clontech	632380
抗 mCherry 抗体	invitrogen	M11217
抗 MEK	細胞シグナル伝達	9122
抗 p130Cas	BD Biosciences	610271
抗パキシリン	細胞シグナル伝達	2542
抗リン酸化細胞 1/2 T202/Y204 抗体	細胞シグナル伝達	9101
抗リン酸化-pY249 p130Cas	細胞シグナル伝達	4014
抗リン酸化Y118 パキシリン	細胞シグナル伝達	2541
アントリン酸化-S217/221 MEK	細胞シグナリング	9121
Arduino 互換電源	企業コンピュータ	LJH -186
Arduino Uno Rev3	Arduino	‎
Attofluor Cell Chamber	invitrogen	A7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS)	ジェミニバイオプロダクツ	100-106	熱不活性化トリプル0.1&マイクロ;m 滅菌フィルター
bRaf-V600E-Venus			O'Bryan博士からの贈り物、MUSC
BSA	ゴールドバイオテック	A-420
カルベニシリン(二ナトリウム)	ゴールド	バイオテクノロジーC-103-25
CellMaskディープレッド原形質膜染料	invitrogen	c10046
コロニースクリーンマスターミックス	ジェネシー	42-138
DH5a コンピテントセル	NEB	C2987H
DMEM	コーニング	15-013-CV
DNAラダー	ゴールドバイオ	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
Dpn1酵素	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-ジチオスレイトール、クレランド試薬
EGTA	アクロス
FastLightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162155
ウシ血漿由来フィブロネクチン	シグマ	F1141
FuGENE(R) 6トランスフェクション試薬	Promega	E2692	トランスフェクション試薬
ゲルグリーン核酸染色	GoldBio	G-740-500
ゲルローディング染料パープル6x	NEB	B7024A
GeneJETゲル抽出キット	サーモサイエンティフィック	K0692	ゲル抽出キット
GeneJETプラスミドミニプレップキット	Thermo Scientific	K0502
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 mL
HEK 293T細胞	ATCC	CRL-11268
HeLa細胞	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	フィッシャー	BP310-500
IoTリレー	デジタルロガーDLI	705020645490	AC / DC制御リレー、照明用
カナマイシンモノサルフェートゴールド		バイオテクノロジーK-120-25
KCl	シグマ	P-4504
L-15 1x	コーニング	10-045-CV
LBアガー	フィ	ッシャーBP1425-2
LEDグローライトシステム	HQRP	884667106091218	LEDパネルランプシステム
LightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162154
LightR-iCre-miRFP670	Addgene	#162158
MATLAB	Mathworks	R2024a	CellGEOスクリプト実行ソフトウェア
Metamorph	Molecular Devices		イメージング解析ソフトウェア
MgCl2	フィッシャーケミカル	M33-500
ミネラルオイル	シグマ	M5310
ミニプレップキット	遺伝子の選択	96-308
Mini-PROTEAN TGX プレキャストゲル 12 ウェル	Bio-Rad	4561085
Molecular Biology Grade Water	コーニング	46-000-CV
マルチバンドポリクロイックミラー	89903BS	Chroma
NaCl	フィッシャーケミカル	S271-3
PBS w/o CaおよびMg	コーニング	21-031-CV
pCAG-iCre	Addgene	#89573
pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherry	Addgene	#122963
pCEFL-ERK2			Gift from Dr. Channing Der's Lab, UNC
PCR Tubes	labForce	1149Z65	0.2 mL 8 ストリップチューブおよびキャップ、硬質ストリップ個別取り付けドームキャップ
Phusion Plus DNAポリメラーゼ	Thermo Scientific	F630S
pmiRFP670-N1	Addgene	#79987
ポリゴン400パターンイルミネーター	Mightex	DSI-G-00C
プライマー	IDT
PVDF メンブレン	BioRad	1620219	免疫ブロット PVDF/フィルターペーパーサンドイッチ
T0.25% トリプシン、2.21 mM、eDTA、1x [-] コーニングナトリウム		25-053-CI
トリス-アセテート-EDTA (TAE) 50x	フィッシャー	BP1332-1	電気泳動用
UPlanSApo 40x 顕微鏡対物レンズ	オリンパス	1-U2B828
USB TTL ボックス	National Instruments	6501	TTL インターフェース
用β-メルカプトエタノール	フィッシャー ケミカル	O3446I-100