方法論記事

Dynamin様GTPaseアトラスチンのコンフォメーションダイナミクスを観察するための1分子FRETイメージング

DOI：

10.3791/67263

⸱

2025年1月24日

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology, College of Life Sciences, Frontiers Science Center for Cell Responses, Nankai University, 2National Laboratory for Condensed Matter Physics, Institute of Physics, Chinese Academy of Sciences, 3University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ダイナミンスーパーファミリータンパク質の機能は、GTP加水分解と組み合わせたコンフォメーション変化に依存します。1分子FRET(smFRET)技術を用いて、異なるヌクレオチド負荷状態におけるダイナミン様GTPaseアトラスチンのコンフォメーションダイナミクスをモニターするシステムについて記述します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ダイナミン様タンパク質アトラスチン(ATL)のGTPaseドメインに対する3ヘリカルミドルドメイン(3HB)の剛体回転は、小胞体(ER)内の同型膜融合の重要な推進力です。このプロセスの混乱は、神経変性疾患である遺伝性痙性対麻痺(HSP)に関連しています。構造的および生化学的研究は、ATLのコンフォメーション変化がGTP加水分解に関連していることを示唆していますが、GTP加水分解サイクル中のこれらのコンフォメーションダイナミクスのリアルタイムな可視化は依然として困難です。ATL機能の背後にある機械的メカニズムをよりよく理解するために、単一分子フェルスター共鳴エネルギー移動(smFRET)が利用されました。ヒトATL1のN末端細胞質ゾル領域(ATL1cyto)をストレプトアビジンでコーティングされたマイクロ流体チャンバーに固定するために、3つの特定の戦略が採用され、分子内および分子間smFRETイメージングの適用が容易になりました。これにより、さまざまなヌクレオチド負荷状態におけるタンパク質のコンフォメーションを正確にモニタリングすることができ、個々の分子の挙動に関する直接的な洞察を得ることができました。この方法は、他のメカノケミカルタンパク質の研究にも適用できます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

真核細胞では、ダイナミンスーパーファミリータンパク質が、膜チューブ化、分裂、融合などの生体膜のリモデリングを媒介します1,2,3。これらのタンパク質の突然変異は、神経変性疾患などのさまざまなヒトの病気を引き起こします。ダイナミンスーパーファミリーのメンバーには、通常、GTPaseドメイン、らせん状束からなる中間ドメイン、膜結合のモチーフ、およびGTPaseエフェクタードメイン(GED)が含まれます。そのようなダイナミン様GTPアーゼの1つがアトラスチン(ATL)であり、これは小胞体(ER)のホモタイプ膜融合を触媒してネットワークを形成します4,5,6,7,8,9,10。哺乳類には3つのATL(ATL1-3)があります。ATL分子は、GTPaseドメインと3ヘリックス中間ドメイン(3HB)を含むN末端細胞質領域(ATL細胞)と、それに続く2つの膜貫通領域で構成されていますが、典型的なGEDを欠いています。あるいは、ATLには、膜融合11,12,13で重要な役割を果たすC末端テールが含まれています。

効率的な膜融合は、ATL細胞14,15,16,17,18,19,20におけるGTP加水分解依存性ドメイン再配列に依存することが報告されています。しかし、コンフォメーション変化からのフォールディングエネルギーを使用してヘテロタイプ膜融合21を促進するSNARE複合体と比較すると、ATLおよび他の融合特異的ダイナミン様タンパク質22によって媒介される同型膜融合プロセスは依然としてとらえどころのないままである。ヒトATL1細胞の3つの結晶構造は、異なるヌクレオチド負荷条件14,15,16,23で決定されている。この構造では、二量体中の2つの3HBが異なる方向を指していますが、ATL細胞のコンフォメーションダイナミクスとそのGTPase活性がどのように結合しているかを説明する包括的なモデルはまだ欠落しています。

前のモデルでは、単量体のATL分子がGTP依存的に異なる膜間で二量体を形成し、膜融合を促進していました。ここでは、単一分子のフェルスター共鳴エネルギー移動(smFRET)を適用して、個々のATL1細胞分子の挙動を直接観察し、正確に検出するための3つの戦略について説明します。smFRETは、GPCRを介したβ-アレスチン活性化24、Snf2によるクロマチンリモデリング25、GTP加水分解サイクル26と組み合わせたダイナミン様タンパク質MxAのドメイン再構成など、個々の生体分子のコンフォメーションダイナミクスと相互作用をリアルタイムで調査するために広く利用されている強力な技術です。smFRETは~3 nmから~8 nmまでの距離の変化しか効果的に検出できないため、各ヌクレオチドローディング状態におけるATL1細胞のコンフォメーションを包括的に解析するには、分子間および分子内の両方のsmFRET実験が必要です。我々は、すべての天然システインをアラニンとK400(ATL1cyto-K)またはT51/K400ペア(ATL1cyto-TK)をシステインに変異させたATL1細胞の3つの構築物を作製し、蛍光色素の標識を行った。分子間または分子内smFRET実験のために、ストレプトアビジン被覆マイクロ流体チャンバー(図1A)でATL1細胞二量体または単量体を固定化するための戦略を図1B-Dに示します。この方法では、GTP加水分解の各ステップにおけるダイナミン様タンパク質のコンフォメーションダイナミクスについて、より詳細な情報が得られます27。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 材料表に記載されています。

1. タンパク質固定化チャンバー用改変カバースリップの作製

  1. 準備
    1. ピラニア溶液(濃硫酸と過酸化水素を3:1の割合で構成)を、濃硫酸に過酸化水素をゆっくりと加えて50mL調製し、過度の温度を防ぎます。ドラフトに慎重に入れてください。
    2. ナトリウムエトキシド溶液を調製します。15mLのddH2Oに2gのNaOHを溶解し、35mLの無水エタノールを加えて完全に混合します。室温で放置してください。
    3. 高塩溶液(0.1 MのNaHCO3 および0.6 MのK2SO4)を調製します。完全に溶解し、500 μL/チューブを分注します。-20°Cで保存してください。
    4. SVA-mPEGおよびSVA-mPEG-ビオチンをチューブあたり約30 mg、チューブあたり約3 mgに分注します。-20°Cで保存してください。
    5. 顕微鏡スライド(75mm×26mm×1mm)を6組の直径1.2mmの穴でカスタマイズします。
  2. カバースリップの表面の清掃
    1. ピンセットを使用して8枚のカバーガラスを拾い上げ、染色瓶に入れます。アセトン(~50 mL)をカバーガラスに添加し、染色ジャーを超音波洗浄機に30分間入れてから、カバーガラスをddH2Oで3回すすいでください。
    2. ステップ1.2.1のように、カバーガラスをメタノールで洗います。
    3. ピラニア溶液(ステップ1.1.1)を染色ジャーに加え、95°Cのウォーターバスケトルで2時間加熱します。染色ジャーが室温まで冷えたら、カバーガラスをddH2Oで少なくとも6回すすいでください。
    4. ナトリウムエトキシド溶液を染色ジャーに加え、超音波洗浄機に15分間入れてから、ddH2Oで3回すすいでください。
    5. ddH2Oを染色ジャーに加えてカバーガラスを覆い、超音波洗浄機に15分間入れ、続いてddH2Oで3回すすぎます。
  3. カバーガラス表面のアミノシラン化修飾。
    1. カバースリップを清潔なベンチの染色ジャーにクランプし、窒素で乾燥させ、別の染色ジャー(事前に乾燥)に入れます。
    2. 染色ジャーを乾燥オーブンで120°Cで30分間焼き、デシケーターで室温まで冷却します。
    3. ビーカー(あらかじめ乾燥)にメタノール47.5mL、酢酸2.5mL、3-アミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)0.5mLを加え、均一に混合して染色ジャーに加え、10分間インキュベートします。
    4. カバースリップを染色ジャー内でddH2Oで少なくとも3回すすぎ、5分間超音波処理します。
    5. カバースリップを1枚ずつ取り出し、ddH2Oですすぎ、窒素でブロードライし、10cm径のペトリ皿に入れてPEG改質の準備をします。
      注意: APTESの変更は、乾燥した環境で実行する必要があります。
  4. SVA-mPEG-ビオチンおよびSVA-mPEGによるカバースリップ表面の改質
    注:カバースリップ表面のビオチン修飾は、ストレプトアビジン を介して ビオチン化タンパク質(またはビオチン抗Hisに結合するタンパク質)を保持するのに役立ちます。
    1. 包装されたSVA-mPEGとSVA-mPEG-ビオチンを高塩溶液(10μLの高塩溶液に相当1mg)に完全溶解します。SVA-mPEG-ビオチン溶液をSVA-mPEG溶液に1:100の比率で添加します。
      注:ボルテックスを使用して溶液を振とうし、SVA-mPEGまたはSVA-mPEG-ビオチンが完全に溶解していることを確認します。SVA-mPEGまたはSVA-mPEG-ビオチン水溶液は、使用前に調製する必要があります。
    2. 調製した混合溶液をカバースリップに落とし、別のカバースリップで覆います。このプロセスにより、気泡の発生を防ぐことができます。カバースリップを適切な湿度で2時間以上または一晩中完全にインキュベートします。
    3. 改質完了後、カバースリップを分離し、ddH2Oですすぎ、窒素でブロードライします。SVA-mPEGおよびSVA-mPEG-ビオチンで改質されていないカバーガラスの表面に印を付けます。
    4. 改質したカバースリップを50mLの微量遠心チューブに慎重に入れます。掃除機をかけた後は-20°Cで保管してください。
      注:変更されたカバースリップは、真空下で1か月間保存できます。

2. タンパク質固定化チャンバー用顕微鏡スライドの作製

  1. ステップ1.2のカバースリップの説明に従って、顕微鏡スライドを洗浄します。
  2. 顕微鏡のスライドを窒素で乾燥させ、50 mLの微量遠心チューブに入れます。
  3. 顕微鏡のスライドは、ステップ1.4.4の説明に従って保管します。

3. タンパク質の発現と精製

  1. 準備
    1. プラスミド:目的のアトラスチンファミリーメンバーまたは目的の病原性変異をpET-28aなどの細菌発現ベクターにクローン化し、Avitag27を添加します。部位特異的突然変異誘発(例えば、T51CおよびK400C27)により、関連する位置にシステインを導入します。
    2. 次のバッファーを準備します。
      1. Luria-Bertani(LB)培地:10 gのトリプトン、5 gの酵母抽出物、および10 gの塩化ナトリウムを1 LのddH2Oに混合します。
      2. 溶解バッファー:25 mMのHEPES(pH 7.4)、150 mMのKCl、5 mMのMgCl2、1x完全EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル、10 mMのイミダゾール、および0.5 mMのTCEPを混合します。4°Cで保存してください。
      3. 洗浄バッファー:25 mMのHEPES(pH 7.4)、150 mMのKCl、5 mMのMgCl2、30 mMのイミダゾール、および0.5 mMのトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP)を混合します。4°Cで保存してください。
      4. 溶出バッファー:25 mMのHEPES(pH 7.4)、150 mMのKCl、5 mMのMgCl2、150 mMのイミダゾール、および0.5 mMのTCEPを混合します。4°Cで保存してください。
      5. 精製バッファー:25 mMのHEPES(pH 7.4)、150 mMのKCl、5 mMのMgCl2、0.5 mMのTCEP。4°Cで保存してください。
  2. タンパク質精製
    1. プラスミド27 を細菌形質転換熱ショック法を用いてRosetta(DE3)(Biomed) 大腸菌 細胞に移します。移管した細胞をLB培地に懸濁し、最終濃度50 μg/μLのカナマイシンを添加します。
      1. 600 nmでの培地の吸光度が0.6〜0.8になるまで、37°Cで培養します。イソプロピル-β-D-チオガラクトシド(IPTG)を最終濃度50μMで添加し、16°Cで20-24時間タンパク質発現を誘導します。
        注:細菌または他の微生物細胞培養物の増殖速度は、600nmでの細胞増殖培養物の光学濃度(吸光度)を測定することによってモニターすることができる。
    2. 細胞を4000 × g で室温で20分間遠心分離して細胞を回収します。上清を捨てます。
    3. 細胞ペレットを30 mLの溶解バッファーで再懸濁します。高圧セルクラッシャーを使用して細胞を3回破壊します。
    4. 超遠心分離ローターを使用して、2,00,000 × g 、4°Cで1時間遠心分離することにより、ライセートを清澄化します。
    5. Ni-NTAカラムを使用してタンパク質を単離します。Ni-NTAカラムを洗浄バッファーで5カラム分洗浄します。溶出タンパク質と溶出バッファー(容量1カラム分)。溶出液を回収し、遠心フィルターを使用して~500 μLまで濃縮します。
    6. さらに、サイズ排除クロマトグラフィー27によりタンパク質を精製する。溶出液を回収します(チューブあたり500 μL)。
    7. ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)27により決定された分子量により、標的タンパク質を確認します。さらなる修飾のために標的タンパク質を回収します。

4. タンパク質のビオチン化

  1. 準備
    1. 以下のストック溶液をご用意ください。
      1. 酢酸マグネシウム四水和物(MgOAc・4H2O)を25 mMのHEPES緩衝液(pH 7.7)に100 mM(10×)の濃度で溶解します。チューブあたり100μLを分注し、-20°Cで保存します。
      2. アデノシン5-三リン酸二ナトリウム塩(ATP)をddH2Oに100 mM(10×)の濃度で溶解します。NaOHを使用してpHを7.4に調整します。チューブあたり100μLを分量し、-80°Cで保存します。
      3. d-ビオチンをddH2Oに500 μMの濃度で溶解し、チューブあたり100 μLを分量し、-20°Cで保存します。
      4. ストレプトアビジンをddH2Oに1 mg / mLの濃度で溶解します。.チューブあたり20μLを分注し、-20°Cで保存します。
    2. タンパク質ビオチン化バッファー:25 mMのHEPES(pH 7.7)、200 mMのL-グルタミン酸カリウム、および0.5 mMのTCEPを添加します。4°Cで保存してください。
    3. BirAビオチンリガーゼを精製し、-80°Cで保存します。
  2. タンパク質のビオチン化
    1. タンパク質バッファーをタンパク質ビオチン化バッファーに変更します。ビオチン化には、100 μL の 100 mM ATP、100 μL の 100 mM MgOAc、100 μL の 500 μM d-ビオチン、100 μL の 100 μM BirA ビオチンリガーゼ、50 μM のタンパク質を最終容量 1 mL まで混合し、4 °C で一晩インキュベートします。
    2. 遊離d-ビオチンは、10 K MWCO遠心フィルターを用いて除去します。
    3. 20 μL のビオチン化タンパク質を 20 μL の 15 μM ストレプトアビジンと共に氷上で 20 分間インキュベートします。タンパク質のビオチン化の効率をSDS-PAGE27で検出します。

5. タンパク質フルオロフォアの標識

  1. 準備
    1. 蛍光色素LD555(ドナー)およびLD655(アクセプター)をジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し、最終濃度5 mMにします。-20°Cで保存してください。
    2. 標識緩衝液を調製する:25 mMのHEPES(pH 7.4)、150 mMのKCl、および5 mMのMgCl2を混合します。4°Cで保存してください。
    3. タンパク質バッファーを標識バッファーに変更します。
  2. 蛍光色素の標識
    1. 分子内smFRETアッセイでは、ATL1cyto-TK をLD555およびLD655と1:1.2:1.2の比率で混合し、最終容量100 μL(蛍光色素の総容量は1 μLを超えないようにしてください)で、4°Cで5時間インキュベートします。
    2. 分子間smFRET実験では、ATL1cyto-K またはATL1cyto-T をLD555と1:1.2の比率でインキュベートし、同時にビオチン化ATL1cyto-K とLD655を1:1.2の比率で4°Cで5時間インキュベートします(5.2.1と同じインキュベーション量)。
      注:タンパク質と色素の共インキュベートにより、LD555(ドナー)およびLD655(アクセプター)の標識位置に柔軟性を持たせることができます。LD555がT51CまたはK400Cに標識されているという事実は、FRET実験の結果に影響を与えません。T51Cサイトで標識されるドナーの概略図が提供されています(図1C、D)。
    3. 7 K MWCOスピン脱塩カラム27を使用して、余分な遊離蛍光色素を除去します。
    4. TCEPをフルオロフォア標識タンパク質に最終濃度0.5 mMで添加します。
    5. 分光光度計を使用してタンパク質の標識効率を検出します。280 nmでタンパク質吸光度、555 nmでLD555吸光度、655 nmでLD555吸光度を測定し、それぞれ吸光係数を使用してモル濃度を計算します。タンパク質標識効率=(蛍光色素のモル濃度/タンパク質のモル濃度)×100%。

6. 1分子FRETイメージング

  1. 準備
    1. インキュベーションバッファーを調製する:25 mMのHEPES(pH 7.4)、150 mMのKCl、および5 mMのMgCl2を混合します。4°Cで保存してください。
    2. タンパク質の固定化のために、1 mg/mL ストレプトアビジン(ddH2O に溶解)と 1 mg/mL ビオチン化抗 His 抗体を調製します。
    3. 25 mM安息香酸(pH 7.4;7.1.1に記載されているバッファーに溶解)と100 mMのプロトカテク酸3,4-ジオキシゲナーゼ(PCD)(40%グリセリン溶液に溶解)を調製して、smFRET実験中の光退色を最小限に抑えます。
    4. 100 mMのグアノシン5'-二リン酸ナトリウム塩(GDP)、グアノシン5'-O-[γ-チオ]三リン酸(GTPγS)、およびAlCl3ストック溶液をddH2Oに溶解して調製します。
    5. 真空保存したカバースリップと顕微鏡スライドを取り出し、清潔なベンチに特注の両面テープで丁寧に貼り付けます。ホースとチップを取り付けて、6つのチャネル27を備えたマイクロ流体チャンバーを形成します。
      注意: 改造したカバースリップを長時間空気にさらさないでください。smFRET実験を開始する前に、マイクロ流体チャンバー27 を準備します。
  2. マッピングの修正
    注:実験中、蛍光シグナルはドナーチャネルとアクセプターチャネルからそれぞれ収集されます。顕微鏡の使用により、ドナーチャネルとアクセプターチャネルのモニタリングフィールドにわずかな偏差が生じる場合があります。モニタリングフィールドの偏差を減らすために、実験を開始する前にマッピングキャリブレーションを行う必要があります。
    1. 10%ポリスチレン粒子(直径3μm)を十分に混合し、顕微鏡スライド(改質しない)に10μLの粒子を加え、カバースリップ(改変しない)で覆います。
    2. できるだけ多くのポリスチレン粒子を含む視野を選択します。全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を使用して、明視野下でビデオを撮影します。
      注:高解像度イメージングには、高開口数油浸対物レンズ(100倍)を使用しました。smFRET実験では、EMCCDカメラを使用して30ミリ秒のフレーム間隔で信号を捕捉しました。
    3. カスタム スクリプトを使用して、ドナー チャネルとアクセプター チャネルの同じポリスチレン パーティクルの中心位置を位置合わせし、マップ ファイルを txt ファイルとして保存します。このスタディで使用したカスタム MATLAB コードは、https://github.com/yangchenguang-1994/HMM-FRET) から入手できます。
  3. チャンバー内のタンパク質を固定化
    1. 分子間smFRET実験では、LD555標識ATL1cyto-K またはATL1cyto-T とLD655標識ATL1cyto-K-biotinを1:1の比率で混合し、最終濃度1 mMのGTPγSまたはGDP/AlF4-を混合し、氷上で1時間インキュベートしてタンパク質を二量体化します。
    2. ATL1cyto-T およびATL1cyto-K 分子間smFRET実験では、LD555標識ATL1cyto-T およびLD655標識ATL1cyto-K-ビオチンを1:1の比率で混合し、最終濃度1 mMのGTPγSまたはGDP/AlF4-で、氷上で1時間インキュベートして二量体化タンパク質を得ます。
    3. 分子内smFRETアッセイでは、LD555およびLD655標識ATL1細胞TK を1 mMのGDPで氷上で1時間インキュベートしてから、GDP条件下でsmFRET実験を実施します。
    4. 分子間smFRET実験では、10 μg/mLのストレプトアビジン(200 μLインキュベーションバッファーで希釈)を10分間インキュベートして、タンパク質を固定化します。分子内smFRETアッセイでは、10 μg/mLのビオチン化抗His抗体(200 μLインキュベーションバッファーで希釈)を添加し、10分間インキュベートしてタンパク質を固定化します。各溶液を添加する前に、インキュベーションバッファーでチャネルを一度フラッシュします。
    5. 200 μLインキュベーションバッファーでATL1ダイマーを~0.3 nMに希釈するか、モノマーを~1 nMに希釈し、10分間インキュベートしてチャネル内のタンパク質を固定化します。インキュベーションバッファーでチャネルを2回フラッシュします。安息香酸とPCDを最終濃度2.5 mMでチャネルに添加します(200 μLバッファーで希釈)。
      注:GTP加水分解プロセスにおけるATL1細胞 分子のさまざまな段階をシミュレートするために、ヌクレオチド(GDP、GTPγS、およびGDP/AlF4-)を最終濃度1 mMでチャネルにタンパク質を固定化した後、各ステップでバッファーに添加しました。GTPγS付加はGTP結合を模倣し、GDP/AlF4- 付加はGTP加水分解を模倣し、GDP付加はPi放出を模倣し、アポセートはGDP放出を表します。
  4. smFRETイメージング
    1. 焦点面を調整します。粗いフォーカスノブと細かいフォーカスノブを使用し、焦点面を調整してサンプルにシャープな焦点を合わせます。ここでは、最適なフォーカスを実現するために、自動フォーカスシステムを使用しました。
    2. 励起ソースを設定します。励起光源として532nmレーザーを使用します。レーザー出力を適切なレベルに調整して、蛍光色素を励起します。ここでは、20〜40mWのレーザー出力を使用しました。
    3. EMCCDカメラを顕微鏡に接続します。カメラを30ミリ秒のフレーム間隔で記録するように設定します。高解像度データ用に16ビットモードで画像をキャプチャするようにカメラが設定されていることを確認します。
    4. ムービーを録画し、取得中も焦点が定まらないようにします。532nmのレーザー照射時間を、蛍光シグナルを記録する際にほとんどの蛍光分子が消光されるまで、できるだけ長くしてください。
    5. 録画したムービーを16ビットTIFF形式で保存して、さらに分析します。

7. データの取得と分析

  1. マップtxtをロードします file 録画した動画からFRET軌道を抽出する前に、修正のために。FRET軌道を選択し、すべてのFRET軌道データをtxt形式で保存して、さらに分析します。
  2. txtファイルからデータを抽出し、Matlab2022aの自家製スクリプトを使用してFRET値を計算します。カスタム MATLAB コードは https://github.com/yangchenguang-1994/HMM-FRET で入手できます。
    注:FRET値は、式ILD655 /(γILD555 + ILD655)を使用して計算されます。ILD555 と ILD655 は、それぞれ LD555 と LD655 の蛍光強度を表します。γは、式γ = FA / FDによって得られるパラメータです。F A はアクセプター強度の減少を表し、F D はドナー強度の増分です。
  3. Origin 2022でGaussAmpによるsmFRETデータを適合させ、分布ヒストグラムを取得します。
    (注)複数のFRET状態のデータ(分子間smFRETのGTPγS条件のデータ、またはGDPまたはApo条件の分子内smFRETのデータ)には、マルチピークフィッティングが使用できます。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

smFRET実験は、30ミリ秒ごとに蛍光色素の蛍光強度を捕捉することにより、TIRF顕微鏡で行われました。LD555(ドナー)および/またはLD655(アクセプター)標識ATL1細胞分子の、異なるヌクレオチドの非存在下または存在下での代表的な画像を図2A-Cに示します。個々の粒子に対する2つの蛍光色素の蛍光強度を記録し、典型的な単一分子の特徴を示す数百のFRET軌道を抽出しました。代表的なトレースを図2D-Fに示します。GDPの非存在下または存在下で、ATL1細胞モノマーは、4つのFRET状態(図2D)で動的なFRET軌道を示し、ATL1のGTPアーゼドメイン-3HB領域がこれらの状態で柔軟であることを示しているが、GDP結合ATL1細胞は密接なコンフォメーショ...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FRET技術は、2つの蛍光色素(ドナーとアクセプター)間のエネルギー移動に基づいています。それらが互いに近接している場合(通常は1〜10 nm)、励起されたドナーはそのエネルギーをアクセプターに伝達し、その結果、ドナーの蛍光強度が低下し、アクセプターの蛍光強度が増加します。

smFRET実験では、分子を非常に低濃度に希釈してスライド上に固定化し、個々の分子のFRETシグナルをTIRF顕微鏡で検出します。ドナー蛍光色素とアクセプター蛍光色素は分子内の特定の位置に共有結合しており、FRETの効率は、タンパク質が立体構造変化を受けたり、他の分子と相互作用したりする際の蛍光色素間の距離と反相関します。したがって、アクセプターとドナーの蛍光強度の比率を測定して、個々の生体高分子のコンフォメーションダイナミクス、フォールディングカイネティクス、ポリマーの形成と解離に関する重要な情報を提供できます。

現在のアッセイでは、タンパク質中のシステインを使用して、マレイミド残基で蛍...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

X.B.は、中国国家自然科学基金会(32371287)、中央大学基礎研究費(63223043・63233053)、南開大学人材育成プロジェクト(035-BB042112)の支援を受けています。Y.L.は、中国国家自然科学基金会(12022409およびT2221001)およびCASフロンティアサイエンスの主要研究プログラム(ZDBS-LY-SLH015)の支援を受けています。L.M.は、中国国家自然科学基金会(32271274および31770812)の支援を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
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10 K遠心フィルターAmiconUFC901096
3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) Sigma-Aldrich440140
45 Ti ローター
532 nm レーザーオリンパス
640 nm レーザーオリンパス
7 K MWCO スピン脱塩カラムThermo Scientific89882
アデノシン 5-三リン酸二ナトリウム塩 (ATP)ロシュ11140965001
安息香酸Sigma-Aldrich242381
Biotin-PEG-SVA-5000Laysan Bio170-124
ビオチン化抗 His 抗体Bioss 抗体bs-0287R-bio
d-biotinSigma-AldrichB4501
EDTA-free protease inhibitor cocktailRoche11873580001
EMCCD cameraAndorIX897
グアノシン5′-二リン酸ナトリウム塩(GDP)Sigma-Aldrich G7127
グアノシン 5'-O-[γ-チオ]三リン酸 (GTP&γ;S)Roche10220647001
High Numerical Aperture Oil Immersion ObjectiveNikonNikon, 100x, N.A. 1.49, 油浸
ImageJNIH
https://imagej.net/ij/ Isopropyl-Β-D-チオガラクトシドSigma-AldrichI5502
LD555-MALLumidyne4
LD655-MALルミダイン10
L-グルタミン酸カリウムSigma-AldrichG1501
酢酸マグネシウム四水和物Sigma-AldrichM0631
MatlabThe MathWorks, Natick, MA
https://www.mathworks.com/ 顕微鏡カバーガラスFisherbrand18834 (24 mm ×60 mm)
顕微鏡スライドカスタマイズ、(75 mm × 26 mm × 1 mm) 直径 1.2 mm の 6 ペアのスルーホール
mPEG-SVA-5000Laysan Bio170-106
Ni Sepharose 6 Fast FlowCytiva17531802
OriginOrigin ソフトウェア
https://www.originlab.com/ ポリスチレン粒子QDSphereAG1265
Protocatechuate 3,4-dioxygenaseSigma-AldrichP8279
StreptavidinSangon BiotechA610492
Superdex 200 増加 (10/300 GL)Cytiva28990944
TIRF 顕微鏡NikonTi2
Tris(2-carboxyethyl)ホスフィン塩酸塩 (TCEP)Thermo75259

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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