腸間膜虚血再灌流障害後の腸間小静脈における好中球細胞外トラップの生体内顕微鏡による可視化

サマリー

このプロトコルは、腸間膜虚血再灌流障害を誘発し、生体内顕微鏡を使用して腸間小静脈の好中球細胞外トラップ(NET)を視覚化する方法を提示します。上腸間膜動脈の血流を1時間制限し、その後再灌流を行ったため、白血球の接着とNETosisを直接定量化することができました。

要約

腸管虚血再灌流(I / R)損傷は、腸間膜血管への血流の制限に起因する組織損傷を特徴とする急性疾患であり、予後不良の局所および全身の病状を引き起こします。虚血と再灌流はどちらも一連の細胞および分子反応を引き起こし、炎症細胞は病理の主要な調節因子として機能します。虚血性内皮とのこれらの相互作用は、複数の接着受容体によって媒介されます。この病理を模倣し、関与する分子経路を調査するために、いくつかの動物モデルが確立されています。この研究では、I/R 損傷の顕微手術モデルを生体内顕微鏡法と組み合わせて、白血球の転がり、接着、および好中球の細胞外トラップ (NET) 形成を視覚化します。このモデルは、内皮PAR1(F2r)を欠損したトランスジェニックマウスに適用され、虚血の1時間後および再灌流直後の白血球ローリングおよびNET形成に対するPAR1の影響を評価します。 In vivoでは、Acridine Orange白血球染色法を使用し、核酸染色を用いてNETsを可視化しました。興味深いことに、白血球接着の減少とNET形成は、内皮PAR1受容体を欠損したマウスで観察されました。このモデルにより、I/R損傷に関与する主要なレギュレーターの in vivo 分析が可能になります。

概要

急性腸間膜虚血 (AMI) は、^{死亡リスクが高い}まれな病理¹ であり、腹腔軸の血栓による腸間膜の血流の減少、または上腸間膜動脈または下腸間膜動脈の減少を特徴としています。症例の60%〜70%では、血栓症または塞栓術による上腸間膜動脈の急性閉塞が急性腸虚血の原因です³。対照的に、症例の5〜15%で、腸間膜静脈血栓症は、上腸間膜静脈、まれに下腸間膜静脈が関与する腸間膜虚血の原因^{となります4。}虚血から生じる低酸素症と栄養失調は、細胞レベルでのエネルギー代謝障害につながります⁵。例えば、ミトコンドリアの機能障害は、複数のシグナル伝達経路を活性化し、細胞死メカニズムを開始します⁶。迅速な再灌流により好気性代謝の回復が可能となりますが、虚血領域への血流の回復は、活性酸素種(ROS)産生⁷、カルシウム過剰⁸、内皮機能障害⁹、炎症反応¹⁰により、しばしば広範な組織損傷を引き起こします。

虚血再灌流(I/R)損傷時の分子機構を解明するために、上腸間膜動脈の一時的な血管閉塞を用いた実験動物モデルが多数確立されている¹¹。このようなモデルを生体内顕微鏡(IVM)と組み合わせて使用することは、根底にある細胞相互作用と疾患の進行に関する洞察を得るための基本です¹¹。腸管バリア機能障害は虚血の直後に観察され¹²、上皮の完全性が失われ¹³、腸間膜リンパ節、脾臓、肝臓、腎臓などの腸外部位への細菌の転座を引き起こします ^12,14。再灌流は粘膜損傷をさらに悪化させる¹⁵。細動脈の炎症反応は、L-セレクチン¹⁶、P-セレクチン(CD62P)¹⁷、血小板GPIIb/IIIa、フィブリノーゲン¹⁸などの分子に依存する内皮細胞層上の白血球の転がり固い接着によって現れます。興味深いことに、腸間小静脈への白血球の接着は、腸内細菌叢¹⁹およびToll様受容体4シグナル伝達¹⁰の存在によって影響を受ける。I/R損傷は、好中球の細胞外トラップ(NET)形成も引き起こします¹⁰。好中球などの活性化白血球に由来する細胞外DNAの治療的標的化は、腸内I/R損傷の転帰を改善する²⁰。肝臓では、I/R損傷は常在するマイクロファージ²¹によって発火し、マイクロRNAの阻害は特にアポトーシスを弱める²²。注目すべきは、腸間膜のI/R損傷は腸内細菌叢症を引き起こし、これは可逆的であり、血行再建術²³の後に解消されます。

内皮は、I / R損傷の損傷の影響も受け、ROSはそのプロセスにおいて極めて重要な役割を果たします²⁴。白血球の内皮細胞層への接着、内皮損傷、および一酸化窒素(NO)代謝の変化が観察されます⁹。しかし、関与する分子経路はまだ完全には解明されていません。

プロテアーゼ活性化受容体1(PAR1、 F2r)は、内皮細胞を含む様々な細胞によって発現される膜受容体であり、炎症状態中に活性化される²⁵。その活性化は、セリンプロテアーゼがN末端で受容体を切断し、つながれたリガンドを露出させ、分子の2番目の細胞外ループに結合することによって受容体を活性化するときに発生します²⁶。内皮タンパク質C受容体(EPCR)-PAR1シグナル伝達経路は、内皮NO恒常性に影響を与え、末梢虚血における血流の回復を促進する²⁷。

本研究では、内皮細胞特異的なPAR1欠損を特徴とする遺伝マウスモデルにI/R損傷を適用し、白血球の転がり、接着、NET形成を可視化した。I/Rマイクロサージェリー後の遺伝的マウスモデルと生体内顕微鏡法の組み合わせは、疾患の進行に関与する特定の細胞タイプを強調することにより、貴重な洞察を提供します。I/R損傷を遺伝的マウスモデルに適用することは、疾患の経過を改善するために使用できる潜在的な治療標的を特定するのに役立ちます。さらに、NETosisにおける内皮PAR1の重要性が示されました。

プロトコル

マウスを含むすべての手順は、動物の立法に関する地元の委員会(Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz、Koblenz、Germany;G21-1-041)。生後6-8週齢のオスとメスのB6。FVB-F2rtm1a(EUCOMM) Tg/Cdh5-cre)7Mlia/Tarcマウスを用いた。F2r(PAR1)の内皮細胞特異的な調節は、VE-Cadherin Creプロ^{モーター28}を介して起こる。本研究では、flox-F2r x VE-Cadherin Cre⁺ (F2R^ΔEC) は内皮細胞上での F2r (PAR1) 発現の低下を示し、flox-F2r x VE-Cadherin Cre^- (WT) は正常な内皮 F2r (PAR1) レベルを発現しました。本試験で使用した試薬および装置の詳細は、材料表に記載されています。

1. 手術の準備

1. 必要な手術器具(極細ハサミストレート、鉗子、血管クランプなど)を滅菌します。
2. 酸素とイソフルランベースの麻酔システムをノーズコーンと加熱プレートで準備します。

2.動物の調理

1. 動物の体重を量ります。
2. 麻酔の実施: ミダゾラム (5 mg/kg)、メデトミジン (0.5 mg/mL)、およびフェンタニル (0.5 mg/kg) を含む溶液の腹腔内 (i.p.) 注射 により マウスに麻酔をかけます (施設で承認されたプロトコルに従います)。
3. 首と腹部の手術部位の毛を小動物用の電動シェーバーで取り除きます。
4. マウスを加熱パッドの背側横臥位に配置し、ノーズコーン を介して 酸素システムに接続します。マウスの手足をサージカルテープで加熱されたパッドに固定します。ラテックスノーズコーンメンブレンがマウスの頭にしっかりとフィットしていることを確認します。げっ歯類専用の体温計を使用して、動物の体温を直腸で監視します。
5. 脱毛クリームを塗って首の手術部位に残った毛を取り除き、手術部位の皮膚を70%エタノールで拭きます。
6. つま先つま先つまみテスト(ペダル反射)を実施して、動物が完全に麻酔をかけられていることを確認します。

3. 外科的処置

1. 頸静脈へのカテーテル留置術
   1. 気管を横切開(~0.5cm)し、首を覆っている皮膚を取り除き、右頸静脈を分離します。
   2. 約5cmの絹糸を使用し、静脈の遠位端を閉じ、外科用鉗子で固定します。静脈の約2 cm下に3本の絹糸を置きます:1本は頸静脈の遠位端に近く、2本は近位端に近くます。外科用結び目を結びますが、血管を閉じないでください。
   3. 0.9% NaCl を充填し、1mL シリンジで塞いだポリエチレン カテーテル (内径 0.28 mm、外径 0.61 mm) を準備します。ハサミを使って2番目と3番目の結び目の間に穴を開け、カテーテルを頸静脈に埋め込みます。シリンジを吸引して、カテーテルに血液が存在することを確認します。
   4. 絹糸を結んでカテーテルを静脈に固定し、しっかりと固定されていることを確認します。医療用テープを使用してシリンジを固定します。
   5. アクリジンオレンジを調製する:1 mLシリンジで滅菌生理食塩水(最終濃度0.5 mg / mL)で2 mg / mLストック溶液を1:4で希釈します。.シリンジを暗所に置き、マウスに50μLを注入します。
   6. 核酸色素を調製する:1 mLシリンジで、滅菌生理食塩水(最終濃度5 μM)を含む5 mMストック溶液を1:1000に希釈します。シリンジを暗所に置き、マウスに50μLを注入します。
   7. 頸静脈カテーテル を介して in vivoのアクリジンオレンジ(50 μg/μL、マウスあたり50 μL)を注入して、好中球細胞外トラップ(NET)を染色するのと同様に、染色された白血球と細胞外DNA蛍光色素を視覚化します(マウスあたり5 μM、50 μL)。NETと白血球を同時に画像化します。
2. 腸間膜I/R損傷モデル
   1. 腹部の皮膚を70%エタノールで消毒します。
   2. 手術用ハサミを使用して、 alba線 に沿って3〜5cm開腹術を行います。
   3. 生理食塩水で湿らせた2つのコットンチップを使用して、腸をそっと取り除き、脂肪被覆が最小限に抑えられた場所を特定します。小さな腸の枝を黒い生地の上に配置して、バックグラウンドシグナルを減らします。
   4. I/R(虚血前)の前に動画を取得してください。
   5. NaClで水分を圧縮し、その中に腸を置きます。ステップ5.6では、腸が湿布に囲まれ、水分が維持されていることを確認します。
   6. 小さな血管クランプで上腸間膜動脈を閉塞します。
   7. 生理食塩水で湿らせた綿棒を使用して腸を腹腔内にそっと押し戻し、7-0縫合糸を使用して腹壁を閉じ、水分と温度の損失を防ぎます。虚血を60分間維持し、少なくとも20分ごとに麻酔をチェックします。
   8. 1時間後、クランプを取り外して再灌流を開始します。
      注:虚血手順を適切に実行すると、目に見える変化が生じます。最初は、血流が不足しているため、患部は青白くまたは白く見えます。クランプを取り外すと、血流は徐々に虚血領域に戻り、虚血領域は正常な色に戻り、閉塞が成功したことを意味します。虚血段階を通じてマウスを連続的に観察することが不可欠です。
   9. 虚血期の後、クリップされた領域に生理食塩水を数滴塗布し、クリップアプライヤーを使用して微小血管クリップをそっと取り外します。
   10. 生理食塩水で湿らせた綿の先端を使用して、腸を再び穏やかに取り除き、静脈の小さな枝を黒い生地に配置し、50μLのアクリジンオレンジを再度注入し、同じ場所で同じ静脈のビデオをキャプチャします(虚血後)。

4. Intravital High-speed Video Epifluorescence Microscopy(生体内高速ビデオ落射蛍光顕微鏡)

1. 長距離コンデンサー、モノクロメーター、10倍水浸対物レンズ、電荷結合デバイスカメラを搭載した高速広視野蛍光顕微鏡で、白血球とNETを可視化します。画像取得は、30 msの露光時間とAlexa Fluor 488(495/519)およびRhodamine Red(570/590)フィルターを使用して行いました。
2. 画像の取得と分析には、イメージングソフトウェアを使用します。
3. 0.06 mm²の関心領域内の細胞動員を定量化します。
4. 付着性白血球を、20秒間の観察期間、静止したまままたは内皮の内層に付着した細胞として定量化します。
5. NETは、白血球と細胞外核酸蛍光色素の両方で標識された細胞外構造として同定します。
6. 実験の最後に子宮頸部脱臼によって動物を安楽死させます(制度的に承認されたプロトコルに従います)。

5. 肝臓内皮細胞(LEC)の単離と定量的RT-PCR

1. 磁気セルソーティング(MACS) による LECの単離²⁹.
2. 全RNAを単離します。
3. 2 μgの全RNAを2 μLのRT Buffer、0.8 μLのdNTP Mix、2 μLのRT Random Primers、1 μLの逆転写酵素、および4.2 μLの滅菌蒸留H₂Oと混合することにより、相補的DNA(cDNA)合成²⁷を実行します。
4. cDNA転写は、25°Cで10分間、37°Cで120分間、85°Cで5分間の条件を適用して行いました。
5. qPCRには20 ngのcDNAを使用します。
6. 次のプライマーを使用してください: F2r (フォワード):TGAACCCCCGCTCATTCTTTC、 F2r (リバース):CCAGCAGGACGCTTTTTTTTT、 L32 (フォワード):CCTCTGGTGAAGCCCAAGATC、 L32 (リバース):TCTGGGTTTCCGCCAGTTT。次の条件を使用します:95 °C 30 s、45 サイクル (95 °C で 10 秒、60 °C で 25 秒)、60 °C から 95 °C で 6 秒、ΔΤ 1 °C で。

結果

白血球のローリングと接着、およびNET形成に対する内皮細胞依存性の影響を研究するために、最初に、VE-Cadherin Cre誘導性 F2r欠損症の有効性を内皮細胞で調べました。磁気細胞ソーティングを用いて、肝内皮細胞を単離した。続いて、RNAを単離し、続いて定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)を行った。VE-カドヘリンプロモーターの制御下で発現したCre組換え酵素が存在しない F2r^ΔEC マウスは、WTコントロールと比較して F2r (PAR1)mRNAレベルが有意に減少(約3分の1)しました(図1)。

マウス系統の欠損を確認した後、腸間膜I/R損傷を行い、血管内皮細胞によって発現されるPAR1が白血球のローリングと接着に及ぼす影響を調べ、生体内顕微鏡で可視化しました(図2A、B)。虚血の1時間後、クランプを取り外し、血管を再灌流させた。白血球の転がりと接着が観察され、記録されました(緑色に染色され、白い矢印で示されています)。両群ともI/R損傷後に付着性白血球数の増加を示したが、内皮 F2r (PAR1)の欠損により、I/R活性化腸間膜内皮への白血球接着は著しく減少したが、有意ではなかったことから、虚血性腸間膜細静脈への白血球動員における内皮PAR1活性化の積極的な役割が示唆された(図2C)。

次の目的は、内皮性PAR1の発現がI/R損傷によるNET形成を制御しているかどうかを調べることでした。そこで、細胞外核酸を細胞不透過性色素³⁰で染色し、生成されたNETを生体内顕微鏡(黒矢印で示)を用いて可視化した(図2A,B)。I/R損傷後、NETは、内皮細胞上でPAR1の正常レベルを発現するWTグループでのみ観察され、NETosisにおけるPAR1の調節的役割を示しています(図2C、D)。特に、内皮F2rの発現が抑制された場合、I/R損傷した腸間膜細静脈にはNETは存在しませんでした。

図1:F2r(PAR1)mRNA発現。 L32ハウスキーピング遺伝子に対するWT(n=6)およびF2r^ΔEC(n=9)マウスのF2r肝臓内皮細胞の発現。データは、95%の信頼区間を持つ中央値として表示されます。マンホイットニー検定は、2つの独立したグループ、*p<0.05を比較するために使用されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:内皮PAR1は、I/R損傷した腸間小静脈における白血球の接着とNET形成に影響を与えます。I / R損傷の前(前)および後(後)のI / R損傷(A)10倍および(B)20倍の倍率。スケールバー:A、50μm;(C)白血球接着性および(D)WT(n=7)およびF2rΔEC(n=4)マウスのmm当たりの純数(1mm^あたり)(n=7)およびI/R損傷前(前)および後(後)のマウス。すべてのデータは、95%信頼区間の中央値として表されました。統計的比較は、二元配置ANOVA検定、**p< 0.01、およびSídákの多重比較検定を使用して実行され、各時点(虚血前と虚血後)の異なる遺伝子型の平均を比較しました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

腸間膜I/R損傷と生体内顕微鏡検査を併用し、内皮細胞のF2r(PAR1)欠損の遺伝子マウスモデルに適用し、虚血1時間後の白血球およびNETのin vivo解析を行った。腸間膜I/R損傷モデルは、虚血と再灌流の両方の時間が数分から数時間^23,31まで変化するげっ歯類で頻繁に使用され、炎症結果³²および死亡率³³に影響を与える。このモデルは、微生物^叢19,34、免疫受容体10,35,36,37、性別^38,39、³⁵歳など、いくつかの要因にも依存します。I/R 時間の変化は別として、このモデルの別の変数は、損傷に対する腸のさまざまな部分の異なる応答であり、小腸は結腸よりも大きな粘膜損傷を示しています⁴⁰。虚血領域に影響を与える微小血管クリップの位置は、方法^32,33の再現性にとって重要である。重要なことに、上腸間膜動脈閉塞と側副血流の中断を組み合わせると、虚血の持続期間に一貫して関連する死亡率が得られます⁴¹。

本研究では、マウスに1時間の虚血を投与し、再灌流直後に in vivo の白血球接着とNET形成を可視化することで、内皮 F2r 発現がない場合の虚血状態によって引き起こされる初期の炎症反応を検討しました。これらの手法をマウスの遺伝的モデルに適用することで、特定の標的分子が虚血後と再灌流中の両方で細胞の挙動や炎症反応にどのように影響するかを調べることができます。

このプロトコルには、腸の完全性の維持など、いくつかの重要なステップがあります。腸の取り扱いは、組織の損傷を避けるために穏やかに行う必要があります。この目的のために、湿った綿棒は、腹腔から腸を一時的に取り外すための適切なツールです。腸が腹部に再配置されるまで、腸が湿ったままであることが重要です。軽微な取り扱いによる怪我は、血小板や内皮細胞などのさまざまな細胞タイプの活性化を引き起こし、結果に影響を与える可能性があります。

一貫性を保つためには、虚血の前後で腸管の同じ部位を視覚化することが重要です。虚血後に腸が腹腔内に再配置されるため、これは困難な場合があります。この問題に対処するための1つのアプローチは、虚血の前に視覚化された腸の部分に湿った湿布の小さな部分を置くことです。

in vivoで白血球のローリングと接着、およびNET形成を可視化するために、マウスに白血球と核酸蛍光色素の両方を頸静脈経由で注入しました。白血球色素(材料表参照)は、白血球には結合するが赤血球には結合しない細胞透過性の異染性蛍光色素であり、in vivoで白血球の染色に広く使用されている^17,42。この色素は静脈内投与され、数秒で強力な白血球染色を実現します。ただし、特異性は、内皮細胞などの他の有核細胞も染色するため、制限になる可能性があります。それにもかかわらず、循環細胞はウォッシュアウト効果⁴³により染色をより長く保持する。核酸蛍光色素(材料表参照)は、NET形成を可視化するために一般的に使用される細胞不透過性の核酸染色剤である30,44,45。また、静脈内投与も可能で、高い親和性で結合し、素早く簡単に使用できます。繰り返しになりますが、特異性は欠点であり、色素は無傷の膜を持つ任意の細胞に結合します。理想的には、特異性を高めるために、好中球マーカー(CD15、CD11bなど)またはNETosisマーカー(抗citH3抗体など)と組み合わせる必要があります。これらの色素は、実験動物の腸間膜細静脈における白血球のin vivoイメージングを可能にします。

この技術の主な制限は、腸の毛細血管の視覚化を制限し、画像取得を大幅に妨げる内臓脂肪の存在です。この合併症を避けるためには、内臓脂肪の形成が減少した若い実験動物(生後6〜8週齢)を使用する必要があります。さらに、 ex vivo 組織学的解析は、 in vivo 染色の使用によって妨げられます。別の制限は、腸内細菌叢と食事がこのモデルに与える影響であり、これはマウスの飼育によって大きく異なる可能性がある⁴⁶。この制限に対処するために、gnotobioticマウスモデルの研究を考えることができます¹⁰。

本研究では、虚血後の即時の細胞応答を調べ、活性化した腸間皮への白血球沈着の減少とNET形成がin vivoで観察されました。虚血の1時間後にDNaseの静脈内投与によるNET分解は、初期の炎症誘発性反応を減少させ、腸バリア破壊を改善します⁴⁷。注目すべきは、トロンビン活性を阻害する膜貫通型糖タンパク質であるトロンボモジュリンによる治療⁴⁸は、重度の腸内I/R損傷を受けたマウスの生存率を改善し、内皮機能障害の炎症反応を弱め、遠隔臓器における激しいヒストン蓄積を減少させた⁴⁹。ここでは、内皮トロンビン受容体がI/Rの結果に影響を与えることが示され、遺伝子操作マウスで腸内I/R損傷モデルと生体内顕微鏡法を組み合わせて、疾患の病理の重要なメディエーターを調査することの重要性が強調されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アクリジンオレンジ	Sigma-Aldrich	A-6014
96ウェルプレート乗算型PCR-プラッテン	Sarstedt	721977202.00
げっ歯類のための麻酔システム	GROPPLER medizintechnik	Uni Vet -Porta T-8
Aqua ad injectabilia IVM	B Braun Melsungen	53402101
黒い生地	Staedtler		モデリング粘土
CD146 Microビーズ、マウス	Miltenyi Biotec	130-092-007
cellSens	オリンパス	オリンパス cellSense Dimension Desktop 2.3	ソフトウェア
電荷結合デバイス カメラ	浜松ホトニクス	ORCA-R2	カメラ
綿棒	Böttger	09-119-9100
カーブ止血 125mm/5インチ	インディゴインスツルメンツ	22466
脱毛クリーム	バレア	該当
Dorbene Vet	zoetis
Dumont 鉗子	ファイン サイエンス ツール	11251-35
エタノール p.a. 99,5 %	Roth	5504.20
エクストラ ナロー ハサミ –ストレート/シャープシャープ/10.5	FST	14088-10
フェンタニル	ヤンセン-Cilag GmBH
鉗子 "Dumont #5" (Inox、先端 0.1mm、長さ 11 cm)	FST	11251-20
GentleMACS C チューブ	Miltenyi Biotec	130-093-236
Graphpadprism	Graphpad	Prism 10	ソフトウェア
イソフルラン	Piramal	4150097146757.00
iTaq UniversalSYBRグリーンSupermix 10x5ml	BioRad	1725125.00
Leukofix医療テープ	BSNMedical	0213600
肝臓解離キット、マウス	Miltenyi Biotec	130-105-807
LS分離カラムMACS	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACSスマートストレーナー100 & マイクロ;m	Miltenyi Biotec	130-098-463
マイクロシール B シール シール	Biorad	MSB1001
Midazolam	hameln	5918501.00
NaCl	Braun	2350748
ニードル ホルダー	FST	12001-13
非吸収性編組シルク縫合糸、サイズ: 7/0、91 メートル	ファインサイエンスツール	18020-70
オリンパス BX51WI 蛍光顕微鏡	リンパス		顕微鏡
チューブストリップ用 PCR	サーシュテット	72985002.00
PCR チューブ蓋	サーシュテット	65989002.00
プライエチレンカテーテル	スミスメディカル ドイツ GmbH	800/100/100
プロレン (8648G)、ポリプロピレン 6-0、ナートマテリアル	ジョンソン&ジョンソンメディカルGmbH	8695H
Relia Prep RNA Miniprep Systems	Promega	Z6112
Reverse Tanscription Kit (High Capacity cDNA)	Applied Biosystems	4368813.00
学校規模	カーン&SOHN GmbH	EMB 500-1
スプリングハサミ - 側面への角度	FST	15006-09
実体顕微鏡	ライカ	M50
ストレート止血剤 135mm/5.5"	インディゴインスツルメンツ	22468
シリンジ1 mL	ブラウン	9166017V
SYTOXオレンジ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	S11368
温度コントローラーTC-1000	FMI Föhr Medical Instruments GmbH	該当
組織鉗子 - 1x2 歯	FST	18057-14
血管クランプ	ファインサイエンスツール	18055-02
ベティバミニ	WAHL	1584-0480