方法論記事

機械的に安定な自己組織化ペプチドハイドロゲルの調製

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DOI:

10.3791/67267

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2024年9月6日

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1The First Affiliated Hospital of Nanchang University, 2The National Engineering Research Center for Bioengineering Drugs and the Technologies, Institute of Translational Medicine, Nanchang University

この記事について

サマリー

このプロトコールでは、環境条件を利用してペプチドのヒドロゲルへの自己組織化を誘発する3つの迅速でシンプルな調製方法を紹介します。さらに、ペプチドハイドロゲルの特性評価についても説明し、機械的に安定したペプチドハイドロゲルがこれらの単純な条件下で形成できることを示しています。

要約

ペプチドハイドロゲルは、ナノファイバーまたはポリマーの自己組織化によって形成される親水性の高い三次元ネットワークゲルであり、水ロックネットワークを形成します。その形態は細胞外マトリックスの形態と非常によく似ているため、ペプチドの生物学的機能と応答性ゲル化特性の両方を示すことができます。これらのユニークな特性は、組織工学、三次元細胞培養、がん治療、再生医療、その他の生物医学分野での広範な応用につながっています。この記事では、環境応答性ゲル化プロセスを持つ自己組織化ペプチドを使用してECF-5ペプチドハイドロゲルを調製するための3つの方法について説明します:(1)pH応答性ゲル化:さまざまなpHレベルはアミノ酸残基のプロトン化または脱プロトン化を誘導し、ペプチド分子間の静電相互作用を変化させ、ヒドロゲルへの自己組織化を促進します。(2)金属イオン付加:多価金属イオンは、負に帯電したアミノ酸残基とキレート化され、ペプチド間の架橋として機能してネットワークヒドロゲルを形成します。(3)溶媒交換:疎水性ペプチドは、最初に非極性有機溶媒に溶解され、その後、極性水性環境に移行すると、ヒドロゲルへの自己組織化を誘導します。これらの方法は、従来の実験手順を利用して、ペプチドのハイドロゲルへの自己組織化を促進します。特定のゲル化誘導条件に適合するようにペプチド配列を設計することで、微細なマイクロ/ナノ構造と生物学的機能を達成することが可能となり、生物医学領域におけるペプチドハイドロゲルの大きな可能性が浮き彫りになります。

概要

ペプチド配列の設計を通じて、ペプチド間の非共有結合的相互作用が自己組織化を誘導し、ナノチューブ、ナノリボン、ナノファイバー、球状構造1などの規則的なマイクロおよびナノメートル構造の形成につながります。マイクロメートルおよびナノメートルの繊維/リボンに自己組織化すると、これらの構造は巨視的にハイドロゲル特性を示します。ペプチド自己組織化ヒドロゲルは、非共有結合相互作用を介して自己組織化し、ゲル形態が可逆的であり、溶液相とゲル相2の間の遷移に対して特定の条件に容易に応答するという点で、ポリマーハイドロゲルとは異なる。例えば、芳香族アミノ酸ペプチドは、溶媒スイッチング3,4,5に基づいて糊化するように誘導することができ、RADA16ペプチドは、カチオン性およびアニオン性の静電相互作用を通じてゲルを形成し6、E1Y9ペプチドは、Ca2+イオン7を介してヒドロゲルを形成するように誘導することができる。天然アミノ酸は人体で代謝され、高分子ハイドロゲルでは達成できない優れた生体適合性を提供します8。タンパク質は生物学的機能を実行する分子であり、ペプチド配列の違いが特定の生物学的機能を生み出します。したがって、特定の生体機能ペプチド配列を埋め込み、それらに自己組織化特性を付与することで、独自の生物学的機能と形態9,10,11を持つペプチド自己組織化ヒドロゲルを設計することができる。この記事では、環境応答性によってゲル化プロセスが引き起こされるペプチドハイドロゲルの調製方法を3つ紹介します。また、ペプチドハイドロゲルの機械的特性と形態を特徴付ける方法についても簡単に説明します。

pHはアミノ酸の電荷を調節し、一部のペプチドのゲル化を引き起こします。例えば、正に帯電したアミノ酸(アルギニン、リジン、ヒスチジンなど)は、pHによって調節され、正または中性の状態になります。負に帯電したアミノ酸は、pHによって制御されて負または中性の状態を達成し、等電点から離れて移動し、それによって水溶液中での親水性を変化させます。したがって、ペプチド間の静電相互作用と疎水性相互作用を制御することで、ペプチドの秩序ある自己組織化が容易になります。Zhangらは、両親媒性pH応答性自己組織化ペプチドであるメトトレキサート共役KKFKFEFEFを設計し、in vitroおよびin vivoの両方でわずかに酸性の環境に応答し、ゾルからゲルへの相転移を可能にしました。これにより、細胞の効率的な取り込みとエンドサイトーシスがもたらされ、抗がん剤が送達され、化学療法の有効性が向上します12。Shenら13 は、pH 9.4を超えると繊維に容易に自己組織化するFF8(KRRFFRRK)ペプチドを設計しました。中性条件下では、微生物は負に帯電したリン脂質膜との静電相互作用により正電荷を中和し、リン脂質分子と協調して自己組織化し、膜の破裂を引き起こし、殺菌効果を高めます13。

配位金属を用いてペプチド超分子の自己組織化をハイドロゲルに引き起こすことは、比較的まれな方法である14。金属イオンがペプチドと静電的に相互作用すると、ペプチド分子をつなぐ塩架橋が形成され、非共有結合相互作用と自己組織化が起こり、ゲル化特性が得られます。例えば、Abul-Haijaら15 は、銅イオンを添加すると液体からハイドロゲルに遷移するトリペプチドFFDを設計しました。Taoら16 は、亜鉛イオンの存在下で繊維状ヒドロゲルに自己組織化し、前立腺の薬物送達に使用されるグルタミン酸およびフェニルアラニンに富むペプチドE3F3を開発しました。

ペプチドハイドロゲルの溶媒交換形成は、最も一般的な超分子自己組織化の引き金となる条件です。疎水性ペプチドが有機溶媒に溶解した後、その疎水性基は完全に露出します。水相に移行すると、疎水性基が互いに接近し、水分子がペプチド水素結合の形成を促進し、迅速な自己組織化とハイドロゲルの形成が容易になります。例えば、Zhangら17 は、極性有機溶媒に高濃度で安定に溶解し、水で希釈すると自己組織化してβシート構造に自己組織化し、ペプチド繊維ハイドロゲルを形成するペプチドを設計しました。Shenら13 は、還元性ペプチドECF-5(ECAFF)を設計し、ジメチルスルホキシド(DMSO)にあらかじめ溶解した後、水相に注入して還元性ヒドロゲルを形成し、虚血再灌流によって生成された活性酸素種の標的除去に使用され、その後、スカベンジング後に溶液に分解されました。

この研究では、以前の経験に基づいて、3つのシンプルで迅速、かつ高度に一般化可能なペプチドハイドロゲル調製戦略を選択しました:(1)pH応答法:ペプチドを等電点から遠く離れたpHの溶液に溶解し、その後、pHを等電点付近に調整します。この変更により、特定の自己組織化ペプチドが繊維を形成し、ペプチドハイドロゲルを生成することができます。(2)金属イオン添加法:水溶性の負に帯電した自己組織化ペプチドに配位カチオンを添加します。ペプチド間の金属配位キレート化は、ペプチドがヒドロゲルに自己組織化することにつながります。(3)溶媒交換法:高濃度のペプチドを有機溶媒に溶解した後、水相に希釈することでゲル化挙動を誘導します。

プロトコル

この試験で使用したプラスミド、試薬、および機器の詳細は、 材料表に記載されています。

1. pHレスポンス法

  1. 5 mg の ECF-5 ペプチドを 400 μL の脱イオン水に加えます。40kHzで30分間超音波処理し、十分に混合します。
  2. 40 μLの水酸化ナトリウム(1 M、0.22 μmフィルターでろ過)をペプチド溶液に加えます。渦を巻き、よく混ぜます。溶液が完全に明確になるまで15分間超音波処理を続けます。
  3. 塩酸60μLを加えます。すばやくボルテックスし、完全に混合します。混合物を室温で30分以上放置して、ハイドロゲルの形成を促進します。
    注:必要に応じて、脱イオン水を目的の緩衝液と交換します。固体粒子が大きい場合は、あらかじめ粉砕してください。液体中の均質な粒子混合物を達成するために超音波処理する。ペプチドがアルカリ性条件に耐えられない場合は、最初に1 M塩酸溶液を加え、上記の手順を繰り返します。必要に応じて酸と塩基の量を調整して、等電点または目的のpHに近づくようにし、ゲル形成特性が保持されるようにします。

2. 金属イオン添加法

  1. 材料の準備
    1. 0.15 MのTrisと0.1 MのNaClバッファーをpH 7.4で調製します。0.22 μmフィルターでろ過し、4°Cで最大1週間保存します。
    2. ステップ1.1.1で調製したバッファーを使用して、ECF-5自己組織化ペプチド溶液を10 mg/mLの濃度で調製します。超音波処理により溶解し、4°Cで保存する。
    3. 脱イオン水を使用して50 mg / mLの塩化カルシウム溶液を調製します。.4°Cで保存してください。
  2. 金属イオン付加誘起ペプチドハイドロゲル形成
    1. ECF-5ペプチド溶液460μLに塩化カルシウム溶液40μLを加えます。渦を巻き、よく混ぜます。混合物を室温で2時間以上放置します。
      注:リン酸緩衝液の使用は、カルシウムイオンの沈殿につながる可能性があるため、避けてください。

3. 溶媒交換方法

  1. 材料の準備
    1. 10 mgのECF-5ペプチド凍結乾燥粉末を秤量します。100 μLのDMSOに加えます。超音波を用いて十分に混合し、4°Cで保存する。
    2. 10 mMのPBS緩衝液を調製します。ろ過して滅菌します。4°Cで保存し、1週間以内にご使用ください。
  2. 溶媒誘起ペプチドハイドロゲル形成
    1. 1 mLのPBSをDMSO可溶化ペプチドに迅速に導入します。渦を巻き、よく混ぜます。室温で5分間放置します。
    2. PBSを500μL加え、15分間放置し、上清を捨て、底のゲルを保持します。このプロセスを 3 回繰り返して、DMSO を削除します。
      注:DMSOがその後の実験に影響を与える場合は、その影響を最小限に抑えるために、ペプチドを高濃度のDMSOに溶解することを検討してください。

4. ハイドロゲルのレオメカニカル特性評価

  1. レオロジー分析
    1. ハイドロゲルを25mmのアルミニウム平行プレートにスプーンで入れます。レオメータ18を使用して、ペプチドハイドロゲルの動的時間スイープレオロジー分析を実行します。
  2. 周波数スイープ解析とひずみスイープ解析
    1. 周波数およびひずみスイープ解析18 を、0.3%の制御ひずみと10rad/sの周波数を使用して体系的に実施します。温度制御が25°Cに設定されていることを確認してください。

5. 原子間力顕微鏡(AFM)による繊維形態のキャラクタリゼーション

  1. 材料の準備
    1. 95%エタノールの溶液を調製し、5%APTESを添加します。-20°Cで保存し、1ヶ月以内にご使用ください。
    2. 両面接着剤を塗布して、マイカの層を取り除きます。APTES溶液を使用してマイカ表面を接着し、5分間放置します。使用前に純水で十分にすすいでください。
    3. ハイドロゲルを希釈し、完全に混合します。改質したマイカ表面に落下させ、5分間静電気を吸着させます。表面を純水ですすぎ、乾燥させてからご使用ください。
  2. 検出方法
    1. スキャナーを搭載したマルチモードAFMを使用して、ペプチド繊維またはヒドロゲルの形態を調べます。公称ばね定数が48N/mのシリコンカンチレバーを使用してください。
    2. 針を配置するように装置を初期化します。 タッピング モードを選択してサンプルをスキャンし、画像を取得します。

結果

この記事で説明したペプチドハイドロゲルの調製方法3つにより、迅速で手頃な価格の簡単な製造が可能になります。ヒドロゲルの機能は、そのペプチド配列に関連しています。ここでは、ECF-5ペプチドを代表例として、微視的な形態や機械的特性などの物理的特性を実証しています。

図1Aおよび補足図1に示すように、ECF-5ペプチドにはグルタチオン様配列とフェニルアラニルジペプチド配列が含まれており、これによりグルタチオンの還元特性と自己組織化能力が付与されます。ECF-5ペプチドをDMSOにあらかじめ溶解し、その後水溶液と迅速に混合しました。この段階で、ペプチドは急速な自己組織化を受け、数分以内に固体ゲルを形成しました。最終的なペプチド濃度が1%を超えると、ピンセットでゲルを拾うことができます。

ゲル表面の原子間力顕微鏡(AFM)イメージングにより、水を閉じ込める密集した細孔を持つ多数のペプチド繊維のネットワークが明らかになりました。希釈すると、 図1Dに示すように、個々の繊維の形態は約3.5nmの高さを示し、非常に一貫性のあるより広い繊維バンドを形成します。これは、ゲルネットワークで観察された繊維形態と一致しています。さらに、中性条件下では、カルシウム金属イオンもペプチドを誘導してヒドロゲルを形成することができますが、このプロセスは比較的遅く、より柔らかいゲルになります。

3つの方法(pH応答、金属添加、溶媒交換)を使用して調製したハイドロゲルの巨視的な挙動を 図2Aに示します。脱イオン水と比較して、すべてのハイドロゲルは半固体特性を示しました。レオロジーは、ハイドロゲルとゾルを区別するために一般的に使用されます。

これら3つのゲル化法で得られたECF-5ハイドロゲルの巨視的粘弾性をレオロジー技術を用いて比較しました。 図2に示すように、ECF-5ハイドロゲルは、一般的なハイドロゲルの粘弾性特性を示しました。0.3%のひずみでは、異なる周波数での貯蔵弾性率(G')と損失弾性率(G'')の関係が示されています。ECF-5ハイドロゲルは、周波数と弱い相関を示しました。3つの方法によって得られたハイドロゲルの貯蔵弾性率(G')は約10 kPaであり、これは損失弾性率(G'')の約10倍であり、典型的な半固体ハイドロゲルの特性を示しました(図2B)。このことは、ECF-5ハイドロゲルが、調製方法にかかわらず、典型的なヒドロゲルの粘弾性を示すことを示しています。

10 rad/s でのひずみレベルに対する貯蔵弾性率 (G') と損失弾性率 (G'') のプロット (図 2C) は、G' と G'' の両方が 0.1% から 10% のひずみ範囲でほぼ一定であり、G' は G'' の約 10 倍であることを示しました。このことは、ECF-5ハイドロゲルが応力に耐えることができる典型的な粘弾性ハイドロゲルであることを示唆しています。

figure-results-1
図1:ECF-5ペプチドハイドロゲル(A)ECF-5の化学構造。(B)1%濃度でのECF-5ペプチドハイドロゲルの巨視的形態。(C)ヒドロゲル表面の微細構造。(D)ECF-5ペプチド繊維の顕微鏡的形態。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:ハイドロゲルの巨視的形態とレオロジー特性評価。 (A)3つの異なる誘導ヒドロゲル条件下でのヒドロゲルの巨視的形態、すべてECF-5ペプチドの最終濃度が3 mg / mL。1%濃度の3つの誘導条件下でのECF-5ヒドロゲルの貯蔵弾性率(G')と損失弾性率(G'')の周波数(B)とひずみ(B)依存性。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足図1:ペプチドECAFFのLC-MS分析。 (A)保持時間13.238分でのピークが製品のピークです。カラム溶出液を 220 nm で、流速 1 mL/分で、100% アセトニトリル中の 0.1% トリフルオロ酢酸でモニターしました。ECF-5の利回りは97.33%です。(B)ESI/質量分析により、ECF-5の分子量は616.1であることが確認されました。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

過去数十年の間に、アミロイドタンパク質に由来する自己組織化ペプチド配列の発見に続いて、多数の自己組織化ペプチドがその特性に基づいて設計され、生物医学および材料科学における応用の大きな可能性が示されている19。ペプチドハイドロゲルは、組織培養、薬物送達、および腫瘍治療において独自の生体機能化能力を示しています20。

この記事では、pH応答、金属イオン添加、溶媒交換の3種類のペプチドハイドロゲルの簡単で迅速な調製方法について説明します。自己組織化ペプチドは、その配列特性に基づいて異なる非共有結合性相互作用を生じ、疎水性相互作用が主な力となり、その後に静電相互作用が続きます。これらの相互作用により、さまざまな自己組織化特性が生じ、可溶性状態から不溶性状態への移行が促進されます。例えば、アミノ酸とペプチドはどちらも、その溶解度が最小となる特定の等電点を持っています。pHが等電点から大きく逸脱すると、溶解度が増し、自己組織化が可能になります。したがって、溶液のpHを調整すると、特定のペプチド13の自己組織化が引き起こされる可能性があります。しかし、極性の高い等電点を持つペプチドは不安定な構造を示す可能性があり、脱アミド化や加水分解を起こしやすくなります。

金属イオンによって誘導されるペプチドハイドロゲルの形成において、ペプチドは通常、グルタミン酸やアスパラギン酸などの負に帯電したアミノ酸を含んでいます。これらのペプチドは、二価金属イオンの影響下で金属イオンを架橋として使用して結合できるため、自己組織化が引き起こされます。あるいは、ヒスチジン残基を有するペプチドは、特定の二価金属カチオンと配位結合を形成し、自己組織化を誘導することができます。金属イオンは、ペプチド間の静電反発を減少させ、それらの相互引力を増強することにより、ペプチドの自己組織化を促進し、ペプチドハイドロゲルの形成をもたらす14。この方法は、特定の金属イオンを必要とするアプリケーションに適していますが、ほとんどの生理学的条件下では必要なく、金属イオンを簡単に除去することはできません。

一部の疎水性ペプチドは、最初に水溶性有機溶媒に溶解し、次に元々不溶性だった水相に添加してペプチドハイドロゲルを迅速に形成します。しかし、多くの有機溶媒は、特に高濃度では、生物学的用途に悪影響を及ぼす可能性があります。本明細書に記載の方法は、特に自己組織化ペプチドに適用される。ペプチドは、前述のトリガーメカニズムに基づいて設計されており、悪影響を最小限に抑えながら目的の生物学的機能を達成します。

開示事項

著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

本研究は、中国国家自然科学基金会(No.11674344および22201026)およびKey Research Program of Frontier Sciences, CAS(GRANT NO. QYZDJ-SSW-SLH019)の支援を受けて行われました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
3-アミノプロピル)トリエトキシシランアラジンA107147/
原子間力顕微鏡ブルカーマルチモードナノスコープVIII/
CaCl<サブ>2< / サブ>アラジンC290953/
ジフェニルアラニン(FF)中国ペプチドカスタマイズ可能な純度>95%
DMSOSigma-aldrich34869/
ECF-5ペプチド中国語ペプチド配列:ECAFF純度>95%
塩酸アラジンH399657 /
マイカシグマアルドリッチAFM-71856-02/
リン酸緩衝生理食塩水アラジンP492453/
レオメーターアントンパールGmbHMCR302/
シリコンカンチレバーMikroMaschXSC11/
塩化ナトリウムアラジンC111549/
水酸化ナトリウムアラジンS140903
TRIS塩酸塩アラジンT431531/

参考文献

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