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方法論記事

ゼブラフィッシュ幼生の発育中の骨芽細胞の2光子レーザー媒介アブレーション

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DOI:

10.3791/67279

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2024年9月6日

 , 
1CRTD - Center for Regenerative Therapies TU Dresden, 2Center for Healthy Aging, Faculty of Medicine, TU Dresden

この記事について

サマリー

このプロトコルは、ゼブラフィッシュの幼生で実施される 2 光子レーザー アブレーション アプローチについて説明しており、骨再生とアブレーションに対する免疫応答の影響を研究するためのモデルとして機能します。

要約

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、さまざまな臓器や付属肢を再生する優れた能力を持っています。ゼブラフィッシュの骨再生は、ヒレ切断、鱗摘採、頭蓋骨穿孔、顕微鏡的アプローチなど、さまざまな方法を用いて研究されてきました。2光子レーザーを搭載した共焦点レーザースキャニング装置を用いて、ゼブラフィッシュ幼生の発育中の骨形成細胞(骨芽細胞)をアブレーションする病変パラダイムとしてレーザーアブレーション法を開発しました。ここで説明する方法は、面積、形状、および深さを微調整できるため、正確な方法で細胞を切除することを可能にする。さらに、この方法では、アブレーションの前後の領域を画像化できるため、損傷の短期的な影響を分析できます。この実験装置では、損傷した領域の骨芽細胞のアブレーション後の免疫応答が研究されました。アブレーション後にマクロファージの動員の増加が観察され、骨再生中のマクロファージの存在の関連性が示されました。

概要

ゼブラフィッシュは、網膜、脳、心臓、膵臓など多様な臓器を再生します1。さらに、ゼブラフィッシュは骨格要素を再生するため、ヒレ、鱗、カルバリア(頭蓋骨)の再生の研究に利用されてきました2。組織および骨の再生を研究するために、ひれ切除術(切断)、ひれ骨折、頭蓋骨穿孔術3,4、凍結損傷5,6、または遺伝的切除7,8,9など、さまざまな実験パラダイムが使用されてきました。最近、レーザーアブレーションアプローチは、損傷後の治癒および再生応答を研究するためにゼブラフィッシュで広く使用されています10,11,12,13,14。

レーザー媒介アブレーションは、機械生物学、発生生物学、再生研究、腫瘍手術など、生物学的研究のさまざまな分野で使用されてきました10,11,12,15,16,17,18,19。レーザーアブレーションには、YAG(イットリウムアルミニウムガーネット)、UV(紫外線)、または2p(2光子)レーザー20を使用するなど、さまざまな方法論があります。レーザーアブレーションは、単一細胞または組織のより大きな部分を非常に正確な方法で除去することを可能にし、腫瘍アブレーション21に対する免疫系の応答やゼブラフィッシュの蓋再生中のさまざまなプロセスの研究を可能にする。後者の例では、アブレーションは、核および細胞質の蛍光色素シグナルの消失および壊死染色10,22によって確認された。

自然免疫応答とその制御された動態が適切な組織再生に不可欠であることはよく知られています。好中球とマクロファージは、損傷部位に動員される最初の細胞であり、サイトカインと成長因子の放出、細胞破片の除去、細胞外マトリックスのリモデリングなど、さまざまな役割を果たします23。この動員とその後のマクロファージの機能化は、切断されたゼブラフィッシュのヒレ24と、骨芽細胞アブレーション10につながるレーザー「ナノダイセクション」にかけられた発達中のオペクルでも観察されています。後者の実験では、UVレーザーと2光子レーザーを介したアブレーション10の後、骨芽細胞数の回復、正常な蓋形成、および損傷部位への自然免疫細胞(好中球、マクロファージ、破骨細胞様細胞)の動員が観察された。ゼブラフィッシュで、グルココルチコイドを用いて免疫系を薬理学的に抑制した実験では、免疫の誤調節による再生の障害が示され、組織修復における免疫系の機能的役割が支持された3,10,25,26。

ここでは、ゼブラフィッシュの骨の発達における骨再生の生物学を研究するための2光子レーザー媒介アブレーション法について説明します。特に、オペクルにおける骨芽細胞アブレーションアプローチの効果は、免疫応答の観点から示されており、これはアブレーション部位へのマクロファージの動員を監視することによって調査されます。

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プロトコル

この研究プロトコルは、Landesdirektion Sachsenから承認を受けました。許可番号は25-5131/564/2、DD25-5131/450/4、25-5131/496/56、DD25.1-5131/354/87です。使用されたゼブラフィッシュの系統は、国内法に従って、前述の27,28の標準化された条件下で維持されました。本試験で使用したすべての試薬および機器の詳細は、材料表に記載されています。

1. 材料と溶液の調製

  1. 胚を1x E3培地で維持します。1x E3培地を調製するには、60x E3ストック170 mLを10 Lの脱イオン水で希釈し、2 mLの0.1%メチレンブルーを加えます。
    1. 17.2 gのNaCl、0.76 gのKCl、2.90 gのCaCl2.2 H2O、4.90 gのMgSO4.7 H2Oを1 Lの脱イオンオートクレーブ水に混合して、60x E3培地ストックを調製します。
  2. 幼虫の包埋には、あらかじめ1%低融点アガロース(LMA)のアリコートを調製し、室温で保管してください。
    1. アリコートを調製するには、LMAを1x E3培地(例:500 mgのLMA、3x E3の50 mLに三角フラスコ)に溶解し、アガロースが完全に溶解するまで溶液を電子レンジで加熱し、1.5 mLチューブの1 mLアリコートに分注します。

2. ゼブラフィッシュの繁殖と胚採取

注:コミットされた骨芽細胞の存在を報告したダブルトランスジェニックゼブラフィッシュの幼生[osterix:nGFP = Tg(Ola.Sp7:NLS-GFP)zf132]29 およびマクロファージ[mpeg:mCherry = Tg(mpeg:mCherry)gl23]がここで使用されました30 （図1A)。

  1. 交配の前夜に、標準的な交配ケージに目的の単一導入遺伝子を持つ親ゼブラフィッシュをセットアップします。
    注:標準的な交配ケージでは、卵は親のゼブラフィッシュが到達できない下部コンパートメントに渡すことができます。
    1. 交配ケージの仕切りを使用して交尾するまで、オスとメスを分離しておきます。翌日の朝に仕切りを取り外して交配を開始します。
  2. 遅くとも正午には、親ゼブラフィッシュを繁殖水槽から取り出し、胚を採取し、交尾ケージから水をふるいにかけます。
    注:幼虫の正確な年齢が決定的な場合は、約30分の定期的な間隔で胚を収穫します。クラッチメイトは、さまざまな実験グループでの実験で使用する必要があります。
  3. 胚を直径100 mmのディッシュに1x E3培地を入れ、28°C31のインキュベーターに保管します。
  4. 実体顕微鏡の助けを借りてプラスチック製のピペットを使用して皿から未受精卵と死んだ胚を取り出し、毎日1x E3培地を交換します。
  5. 実験の前に、レポーター導入遺伝子に陽性の幼虫を蛍光実体顕微鏡で選別します。

3. 低融点アガロースへの幼虫の埋め込み

  1. LMAアリコートをサーモブロックまたはウォーターバスで65°Cで溶かします。 LMAが溶けたら、埋め込むまで42°Cに保ちます(図1B)。溶かした1 mLのLMAアリコートに0.4% MS-222 50 μLを加えて、麻酔用のMS-222濃度を0.02%にします。
  2. 4 dpf(受精後数日)の幼虫(またはそれ以上の幼虫)を0.02%MS-222 E3培地で麻酔します。
  3. 麻酔をかけた幼虫を3mLのプラスチック製パスツールピペットを使用してガラス底のマイクロウェル皿に移し、同じピペットで余分なE3培地を取り除きます(図1B)。幼虫の乾燥を避けてください。
    注:複数の幼虫を同時に皿に埋め込むことができます。配置に十分な時間を確保するために、3〜5匹の幼虫を埋め込むことをお勧めします。
  4. 溶かしたLMAアガロースをウォーターバス/サーモブロックから取り出し、皿に(冷却)滴のLMAを加え、幼虫が配置されたガラス底を覆います。LMAは熱すぎず、まだ液体であることに注意してください。
  5. 次に、アガロースが固まる前に、幼虫を目的の横方向の位置に置きます。ここでは、逆顕微鏡セットアップの準備として、オペルが皿のガラス底にできるだけ近づく横方向の位置を確保します(図1B)。
  6. アガロースを固化させてから、アガロースの乾燥を避けるために、E3培地(最大0.02%MS-222を含む)を皿に加えます(図1B)。

figure-protocol-1
図1:包埋手順の概略図。 (A) ダブルトランスジェニックTg(osterix:nGFP;mpeg1:mCherry)29,30 ゼブラフィッシュの幼生で、緑色で標識された手術性骨芽細胞と赤色で標識されたマクロファージを使用しました。(B)プロトコルのステップ3に記載されている埋め込み手順のワークフロー。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

4. 幼虫の in vivo イメージングとレーザーアブレーション

  1. トランスジェニックゼブラフィッシュTg(osterix:nGFP;mpeg1:mCherry)29,30、25x/0.95水対物レンズまたは同等のセットアップを備えた倒立型2光子レーザー走査型顕微鏡を使用します。
  2. 幼虫が埋め込まれた皿を倒立顕微鏡の顕微鏡ステージに置き、アブレーションの目的の領域を視野の中央に配置します。オペクルは、GFP蛍光シグナルの助けを借りて簡単に同定できます。
  3. オペクルが顕微鏡の視野の中心に集束し、中央に配置されたら、オペクルの全幅を画像化するために、zスタック設定(多くの場合、1〜2μmのz間隔が使用されます)を選択します。同時に、アブレーションする特定のz平面内の領域(通常はオペラクルの後部ゾーン)を選択します。2光子レーザーアブレーションは、この平面でのみ発揮されます。
    注:z次元の解像度が高いほど、イメージング時間が長くなりますが、後で取得したデータの体積分析が可能になります。
  4. アブレーション前の眼窩の関心領域を画像化します。GFP検出には、488 nmの白色光レーザーと、495 nmから550 nmまたは同等のハイブリッド検出器を使用します。555 nm(白色光レーザー)励起を使用してマクロファージをイメージングし、ハイブリッド検出器(または同等のもの)で595〜780 nmのmCherry検出範囲を使用します。
    1. 品質/時間比を良くするには、512 x 512の画像形式を使用します(高解像度または高速が必要な場合は、他の形式を使用できます)。
      注:顕微鏡に設置された温度制御インキュベーターを使用して、たとえば28°Cに調整できます。
  5. 選択した2D平面に直径25μm(実験に応じて他の形状やサイズも選択可能)の円形領域を描き、ROIツールを使用してオペルに焦点を合わせます。
  6. アブレーションを実行するには、450 mWでアブレーションパワー(目的なしで測定)を適用し、選択した領域を400 Hzのスキャン速度と合計10秒の持続時間で2光子レーザーにさらします。アブレーション中、401〜443 nmまたは同等の範囲のハイブリッド検出器を使用して領域を視覚化できます。
  7. アブレーション後、アブレーション前に使用したのと同じ設定で同じzスタックを再度イメージングすることにより、アブレーションを構造的に確認します。アブレーションされた領域には蛍光細胞が含まれなくなりました。

5. 幼虫の回収と免疫細胞の動員を監視するためのイメージング

  1. 免疫細胞の動員のイメージングを遅らせて実行する必要がある場合は、イメージングと麻酔から幼虫を回収します。鉗子または解剖針を使用して、幼虫をLMAから慎重に取り出します。
    1. まず、幼虫を覆っているアガロースの層を取り除きます。次に、幼虫と直接接触しているアガロースを取り除きます。免疫細胞の動員の即時イメージングが行われている場合は、この手順を省略します。
  2. 幼虫を純粋なE3培地を入れた皿に戻し、回復を確認します。回復は幼虫の泳ぎによって明らかです。
  3. 4 hplまたは6 hpl(病変後数時間)で、同じ顕微鏡で同じ設定を使用してオペクル領域を再度画像化し、マクロファージの動員に対するアブレーションの影響を確認します。これを行うには、埋め込み(ステップ3)と前に実行したようにイメージング(ステップ4)を繰り返します。
  4. イメージング後、LMAから幼虫を取り出します。幼虫の犠牲化は、法的要件に応じて、氷水でのインキュベーションまたはE3でのMS-222の過剰投与によって行うことができます。その後、検体はフォローアップ研究に使用したり、廃棄したりできます。

6. 画像解析・統計解析

  1. Fiji32などの画像処理ソフトウェアを使用して画像を処理します。取得したデータのz解像度に応じて、2Dまたは3Dで解析を実行できます。
  2. マクロファージは、主要な細胞体を識別するなど、明確に分離している細胞を含めるか、核標識で細胞を定量するか、細胞が重なっている場合に面積を測定することにより、手動で定量化します(次のステップ)。
  3. 領域を定量化するには、マクロファージを囲むマスクを作成します。これを行うには、 Image > Adjust > Threshold ツールを使用して、フィジーでROI(Analyze > Tools > ROI Manager > Add)を作成します。背景の小さな粒子を定量化のために除外します。
    1. 次に、面積を測定します(分析>測定)。細胞蛍光が重なる領域を測定に含める必要があるかどうかを検討します。
      注:ここでは、この領域では動員されたマクロファージを区別できないため、円形アブレーション領域は領域測定から省略されました。
  4. 適切なソフトウェアを使用して測定結果をプロットしたグラフを生成します。アブレーションの前後でデータを比較するには、適切な統計的検定を実行します (ここでは、対応のある片側 t 検定 が実行されました)。
    注:フィギュアは、写真編集およびグラフィックデザインソフトウェアを使用して作成できます。

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結果

レーザーアブレーションは、上記のプロトコルに示されているように実施されました。アブレーション領域の骨芽細胞のGFP信号は、アブレーション後すぐに消失した。骨芽細胞アブレーションの応答を免疫応答の観点から研究するために、6 dpl前と6 hplでの6 dpf幼虫のマクロファージの存在を画像化しました。アブレーション前は、オペラクル領域10 にマクロファージはほとんど観察されませんでした(図2)。6 hplでは、切除されたオペクル領域にマクロファージが強く蓄積し、オペクルとオペクルの周辺領域を含む視野内のマクロファージの数が増加したことが検出されました10 (図2)。

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ディスカッション

レーザーアブレーションは、生物学研究のさまざまな分野で応用されてきました。特に、組織再生を研究する方法として有用であった10,11,12。例えば、自然免疫細胞の動員および表現型の変化は、最近、UVレーザーまたは2光子レーザーアブレーションアッセイを用いて経時的に解析され、レーザーアブレーション部位10における骨芽細胞の回復も行われた。免疫細胞動員のライブイメージングは、病変後12時間(hpl)まで実施されました。ただし、麻酔の適切な調整と各当局からの承認により、より長いイメージング期間を想定することができます。Geurtzen et al. では、レーザー アブレーションの数日後まで分析が行われ、アブレーション部位の炎症環境を定義するのに役立ち、骨再生におけるマクロファージの支持的役割を確立するのに役立ちました

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

この研究は、ドイツ研究財団(DFG)のTransregio 67(プロジェクト387653785)、DFG SPP 2084μBone(プロジェクトKN 1102/2-1)からFKへの支援を受けました。この研究は、ドレスデン工科大学のCMCBテクノロジープラットフォームの中核施設である光学顕微鏡施設(DFGプロジェクト413875620)の支援を受けました。ドレスデン工科大学での作業は、ザクセン議会(Landtag)が合意した予算に基づいて税収と共同で賄われました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
塩化カルシウム二水和物、CaCl2·H2OCarl Roth5239.1
細胞培養皿、PS、100/20 mmGreiner Bio-one664160
Dumont #55 FocepsFST11295-51先端形状 ストレート、11 cm、0.05 x 0.02 mm
Falcon 6 ウェルプレートCorning353502
ガラス底マイクロウェル皿MatTekP35G-1.5-14-C35 mm ディッシュ、No. 1.5 カバースリップ、ガラス径 14 mm、コーティングされていない
Insight X3 多光子レーザーSpectra-Physics
Leica Application SuiteLAS X、ライカ マイクロシステムズ
低融点アガロース Biozyme840101Biozym Plaque Agarose
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2OSigma-AldrichM5921
嵌合ケージ多くの品種、例えば、Tecniplast
MethyleneblueCarl RothA514.1
MS-222SIGMA AldrichA5040
塩化カリウム、KClPanReac AppliChem131494
塩化ナトリウム、NaClカールロス3957.1
SP8 ファルコン ライカマイクロシステムInsight X3多光子レーザーとライカアプリケーションスイートソフトウェアを装備
ステンレススチール解剖ニードルBochem12010140 mm
実体顕微鏡システム SZX16オリンパスLED照明ベースを装備 SZX2-ILLTQ
サーモスタットキャビネット TS - WTW木部TS 608/2-iインキュベーション(胚)用
トランスファーピペット、3.5 mLSARSTEDT861171155 x 15 mm、LD-PE、透明
Zeiss SteREO Discovery.V12 バージョン 4.7.1.0。Axiocam MRmカメラとAxioVisionソフトウェアを搭載したZeiss
社

参考文献

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