ゼブラフィッシュ幼生の発育中の骨芽細胞の2光子レーザー媒介アブレーション

Summary

このプロトコルは、ゼブラフィッシュの幼生で実施される 2 光子レーザー アブレーション アプローチについて説明しており、骨再生とアブレーションに対する免疫応答の影響を研究するためのモデルとして機能します。

Abstract

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、さまざまな臓器や付属肢を再生する優れた能力を持っています。ゼブラフィッシュの骨再生は、ヒレ切断、鱗摘採、頭蓋骨穿孔、顕微鏡的アプローチなど、さまざまな方法を用いて研究されてきました。2光子レーザーを搭載した共焦点レーザースキャニング装置を用いて、ゼブラフィッシュ幼生の発育中の骨形成細胞(骨芽細胞)をアブレーションする病変パラダイムとしてレーザーアブレーション法を開発しました。ここで説明する方法は、面積、形状、および深さを微調整できるため、正確な方法で細胞を切除することを可能にする。さらに、この方法では、アブレーションの前後の領域を画像化できるため、損傷の短期的な影響を分析できます。この実験装置では、損傷した領域の骨芽細胞のアブレーション後の免疫応答が研究されました。アブレーション後にマクロファージの動員の増加が観察され、骨再生中のマクロファージの存在の関連性が示されました。

Introduction

ゼブラフィッシュは、網膜、脳、心臓、膵臓など多様な臓器を再生します¹。さらに、ゼブラフィッシュは骨格要素を再生するため、ヒレ、鱗、カルバリア(頭蓋骨)の再生の研究に利用されてきました²。組織および骨の再生を研究するために、ひれ切除術(切断)、ひれ骨折、頭蓋骨穿孔^術3,4、凍結損傷^5,6、または遺伝的切除^7,8,9など、さまざまな実験パラダイムが使用されてきました。最近、レーザーアブレーションアプローチは、損傷後の治癒および再生応答を研究するためにゼブラフィッシュで広く使用されています10,11,12,13,14。

レーザー媒介アブレーションは、機械生物学、発生生物学、再生研究、腫瘍手術など、生物学的研究のさまざまな分野で使用されてきました10,11,12,15,16,17,18,19。レーザーアブレーションには、YAG(イットリウムアルミニウムガーネット)、UV(紫外線)、または2p(2光子)^{レーザー20}を使用するなど、さまざまな方法論があります。レーザーアブレーションは、単一細胞または組織のより大きな部分を非常に正確な方法で除去することを可能にし、腫瘍アブレーション²¹に対する免疫系の応答やゼブラフィッシュの蓋再生中のさまざまなプロセスの研究を可能にする。後者の例では、アブレーションは、核および細胞質の蛍光色素シグナルの消失および壊死染色^10,22によって確認された。

自然免疫応答とその制御された動態が適切な組織再生に不可欠であることはよく知られています。好中球とマクロファージは、損傷部位に動員される最初の細胞であり、サイトカインと成長因子の放出、細胞破片の除去、細胞外マトリックスのリモデリングなど、さまざまな役割を果たします²³。この動員とその後のマクロファージの機能化は、切断されたゼブラフィッシュのヒレ²⁴と、骨芽細胞アブレーション¹⁰につながるレーザー「ナノダイセクション」にかけられた発達中のオペクルでも観察されています。後者の実験では、UVレーザーと2光子レーザーを介したアブレーション¹⁰の後、骨芽細胞数の回復、正常な蓋形成、および損傷部位への自然免疫細胞(好中球、マクロファージ、破骨細胞様細胞)の動員が観察された。ゼブラフィッシュで、グルココルチコイドを用いて免疫系を薬理学的に抑制した実験では、免疫の誤調節による再生の障害が示され、組織修復における免疫系の機能的役割が支持された3,10,25,26。

ここでは、ゼブラフィッシュの骨の発達における骨再生の生物学を研究するための2光子レーザー媒介アブレーション法について説明します。特に、オペクルにおける骨芽細胞アブレーションアプローチの効果は、免疫応答の観点から示されており、これはアブレーション部位へのマクロファージの動員を監視することによって調査されます。

Protocol

この研究プロトコルは、Landesdirektion Sachsenから承認を受けました。許可番号は25-5131/564/2、DD25-5131/450/4、25-5131/496/56、DD25.1-5131/354/87です。使用されたゼブラフィッシュの系統は、国内法に従って、前述の^27,28の標準化された条件下で維持されました。本試験で使用したすべての試薬および機器の詳細は、材料表に記載されています。

1. 材料と溶液の調製

1. 胚を1x E3培地で維持します。1x E3培地を調製するには、60x E3ストック170 mLを10 Lの脱イオン水で希釈し、2 mLの0.1%メチレンブルーを加えます。
   1. 17.2 gのNaCl、0.76 gのKCl、2.90 gのCaCl_2.2 H₂O、4.90 gのMgSO_4.7 H₂Oを1 Lの脱イオンオートクレーブ水に混合して、60x E3培地ストックを調製します。
2. 幼虫の包埋には、あらかじめ1%低融点アガロース(LMA)のアリコートを調製し、室温で保管してください。
   1. アリコートを調製するには、LMAを1x E3培地(例:500 mgのLMA、3x E3の50 mLに三角フラスコ)に溶解し、アガロースが完全に溶解するまで溶液を電子レンジで加熱し、1.5 mLチューブの1 mLアリコートに分注します。

2. ゼブラフィッシュの繁殖と胚採取

注:コミットされた骨芽細胞の存在を報告したダブルトランスジェニックゼブラフィッシュの幼生[osterix:nGFP = Tg(Ola.Sp7:NLS-GFP)^zf132]²⁹ およびマクロファージ[mpeg:mCherry = Tg(mpeg:mCherry)^gl23]がここで使用されました³⁰ （図1A)。

1. 交配の前夜に、標準的な交配ケージに目的の単一導入遺伝子を持つ親ゼブラフィッシュをセットアップします。
   注:標準的な交配ケージでは、卵は親のゼブラフィッシュが到達できない下部コンパートメントに渡すことができます。
   1. 交配ケージの仕切りを使用して交尾するまで、オスとメスを分離しておきます。翌日の朝に仕切りを取り外して交配を開始します。
2. 遅くとも正午には、親ゼブラフィッシュを繁殖水槽から取り出し、胚を採取し、交尾ケージから水をふるいにかけます。
   注:幼虫の正確な年齢が決定的な場合は、約30分の定期的な間隔で胚を収穫します。クラッチメイトは、さまざまな実験グループでの実験で使用する必要があります。
3. 胚を直径100 mmのディッシュに1x E3培地を入れ、28°^C31のインキュベーターに保管します。
4. 実体顕微鏡の助けを借りてプラスチック製のピペットを使用して皿から未受精卵と死んだ胚を取り出し、毎日1x E3培地を交換します。
5. 実験の前に、レポーター導入遺伝子に陽性の幼虫を蛍光実体顕微鏡で選別します。

3. 低融点アガロースへの幼虫の埋め込み

1. LMAアリコートをサーモブロックまたはウォーターバスで65°Cで溶かします。 LMAが溶けたら、埋め込むまで42°Cに保ちます(図1B)。溶かした1 mLのLMAアリコートに0.4% MS-222 50 μLを加えて、麻酔用のMS-222濃度を0.02%にします。
2. 4 dpf(受精後数日)の幼虫(またはそれ以上の幼虫)を0.02%MS-222 E3培地で麻酔します。
3. 麻酔をかけた幼虫を3mLのプラスチック製パスツールピペットを使用してガラス底のマイクロウェル皿に移し、同じピペットで余分なE3培地を取り除きます(図1B)。幼虫の乾燥を避けてください。
   注:複数の幼虫を同時に皿に埋め込むことができます。配置に十分な時間を確保するために、3〜5匹の幼虫を埋め込むことをお勧めします。
4. 溶かしたLMAアガロースをウォーターバス/サーモブロックから取り出し、皿に(冷却)滴のLMAを加え、幼虫が配置されたガラス底を覆います。LMAは熱すぎず、まだ液体であることに注意してください。
5. 次に、アガロースが固まる前に、幼虫を目的の横方向の位置に置きます。ここでは、逆顕微鏡セットアップの準備として、オペルが皿のガラス底にできるだけ近づく横方向の位置を確保します(図1B)。
6. アガロースを固化させてから、アガロースの乾燥を避けるために、E3培地(最大0.02%MS-222を含む)を皿に加えます(図1B)。

図1:包埋手順の概略図。 (A) ダブルトランスジェニックTg(osterix:nGFP;mpeg1:mCherry)^29,30 ゼブラフィッシュの幼生で、緑色で標識された手術性骨芽細胞と赤色で標識されたマクロファージを使用しました。(B)プロトコルのステップ3に記載されている埋め込み手順のワークフロー。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

4. 幼虫の in vivo イメージングとレーザーアブレーション

1. トランスジェニックゼブラフィッシュTg(osterix:nGFP;mpeg1:mCherry)^29,30、25x/0.95水対物レンズまたは同等のセットアップを備えた倒立型2光子レーザー走査型顕微鏡を使用します。
2. 幼虫が埋め込まれた皿を倒立顕微鏡の顕微鏡ステージに置き、アブレーションの目的の領域を視野の中央に配置します。オペクルは、GFP蛍光シグナルの助けを借りて簡単に同定できます。
3. オペクルが顕微鏡の視野の中心に集束し、中央に配置されたら、オペクルの全幅を画像化するために、zスタック設定(多くの場合、1〜2μmのz間隔が使用されます)を選択します。同時に、アブレーションする特定のz平面内の領域(通常はオペラクルの後部ゾーン)を選択します。2光子レーザーアブレーションは、この平面でのみ発揮されます。
   注:z次元の解像度が高いほど、イメージング時間が長くなりますが、後で取得したデータの体積分析が可能になります。
4. アブレーション前の眼窩の関心領域を画像化します。GFP検出には、488 nmの白色光レーザーと、495 nmから550 nmまたは同等のハイブリッド検出器を使用します。555 nm(白色光レーザー)励起を使用してマクロファージをイメージングし、ハイブリッド検出器(または同等のもの)で595〜780 nmのmCherry検出範囲を使用します。
   1. 品質/時間比を良くするには、512 x 512の画像形式を使用します(高解像度または高速が必要な場合は、他の形式を使用できます)。
      注:顕微鏡に設置された温度制御インキュベーターを使用して、たとえば28°Cに調整できます。
5. 選択した2D平面に直径25μm(実験に応じて他の形状やサイズも選択可能)の円形領域を描き、ROIツールを使用してオペルに焦点を合わせます。
6. アブレーションを実行するには、450 mWでアブレーションパワー(目的なしで測定)を適用し、選択した領域を400 Hzのスキャン速度と合計10秒の持続時間で2光子レーザーにさらします。アブレーション中、401〜443 nmまたは同等の範囲のハイブリッド検出器を使用して領域を視覚化できます。
7. アブレーション後、アブレーション前に使用したのと同じ設定で同じzスタックを再度イメージングすることにより、アブレーションを構造的に確認します。アブレーションされた領域には蛍光細胞が含まれなくなりました。

5. 幼虫の回収と免疫細胞の動員を監視するためのイメージング

1. 免疫細胞の動員のイメージングを遅らせて実行する必要がある場合は、イメージングと麻酔から幼虫を回収します。鉗子または解剖針を使用して、幼虫をLMAから慎重に取り出します。
   1. まず、幼虫を覆っているアガロースの層を取り除きます。次に、幼虫と直接接触しているアガロースを取り除きます。免疫細胞の動員の即時イメージングが行われている場合は、この手順を省略します。
2. 幼虫を純粋なE3培地を入れた皿に戻し、回復を確認します。回復は幼虫の泳ぎによって明らかです。
3. 4 hplまたは6 hpl(病変後数時間)で、同じ顕微鏡で同じ設定を使用してオペクル領域を再度画像化し、マクロファージの動員に対するアブレーションの影響を確認します。これを行うには、埋め込み(ステップ3)と前に実行したようにイメージング(ステップ4)を繰り返します。
4. イメージング後、LMAから幼虫を取り出します。幼虫の犠牲化は、法的要件に応じて、氷水でのインキュベーションまたはE3でのMS-222の過剰投与によって行うことができます。その後、検体はフォローアップ研究に使用したり、廃棄したりできます。

6. 画像解析・統計解析

1. Fiji³²などの画像処理ソフトウェアを使用して画像を処理します。取得したデータのz解像度に応じて、2Dまたは3Dで解析を実行できます。
2. マクロファージは、主要な細胞体を識別するなど、明確に分離している細胞を含めるか、核標識で細胞を定量するか、細胞が重なっている場合に面積を測定することにより、手動で定量化します(次のステップ)。
3. 領域を定量化するには、マクロファージを囲むマスクを作成します。これを行うには、 Image > Adjust > Threshold ツールを使用して、フィジーでROI(Analyze > Tools > ROI Manager > Add)を作成します。背景の小さな粒子を定量化のために除外します。
   1. 次に、面積を測定します(分析>測定)。細胞蛍光が重なる領域を測定に含める必要があるかどうかを検討します。
      注:ここでは、この領域では動員されたマクロファージを区別できないため、円形アブレーション領域は領域測定から省略されました。
4. 適切なソフトウェアを使用して測定結果をプロットしたグラフを生成します。アブレーションの前後でデータを比較するには、適切な統計的検定を実行します (ここでは、対応のある片側 t 検定 が実行されました)。
   注:フィギュアは、写真編集およびグラフィックデザインソフトウェアを使用して作成できます。

Results

レーザーアブレーションは、上記のプロトコルに示されているように実施されました。アブレーション領域の骨芽細胞のGFP信号は、アブレーション後すぐに消失した。骨芽細胞アブレーションの応答を免疫応答の観点から研究するために、6 dpl前と6 hplでの6 dpf幼虫のマクロファージの存在を画像化しました。アブレーション前は、オペラクル領域¹⁰ にマクロファージはほとんど観察されませんでした(図2)。6 hplでは、切除されたオペクル領域にマクロファージが強く蓄積し、オペクルとオペクルの周辺領域を含む視野内のマクロファージの数が増加したことが検出されました¹⁰ (図2)。

図2:6 dpfゼブラフィッシュの幼生における6 hplでのマクロファージの動員。 アブレーションなしの手術領域と6 hpl。手術性骨芽細胞は緑色で、マクロファージはマゼンタでラベル付けされ、破線の円はレーザーアブレーションされた領域を示します。スケールバー:50μmこの 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

マクロファージの動員は、4 dpfの幼虫でも解析され、4 hplのオペルクルははるかに小さく、同様の結果が観察されました(図3)。マクロファージ数(即時レーザーアブレーション部位外)の定量化は、調査された時間枠内での増加を示しました(アブレーション前のマクロファージは4.00±2.37マクロファージ対4hplでは7.00±2.76マクロファージ)( 図3B)。同様に、マクロファージ面積(アブレーション前はμm²、785.8 μm² ± 723.1 μm² で測定 vs 4 hpl で 1553 μm² ± 869.9 μm² ) が増加しました(図 3C)。マクロファージは見分けがつかない場合があるため、ここで行ったように、マクロファージの数ではなくマクロファージの面積を測定することをお勧めします。

図3:4 dpfゼブラフィッシュの幼生における4 hplでのマクロファージの動員。 (A)アブレーションなしおよび4 hplのオペクル領域。手術性骨芽細胞は緑色で、マクロファージはマゼンタでラベル付けされ、破線の円はレーザーアブレーションされた領域を示します。スケールバー:50μm.(B)アブレーションの直前(0hpl)とアブレーション後(4hpl)のオペラクル領域のマクロファージの数の定量化。(C)マクロファージ領域の定量化(レーザーアブレーションの部位は除く)。対応のある片側 t検定。各ドットは 1 匹の幼虫のデータを表し、SD ±の平均 n = 6 が示されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

レーザーアブレーションは、生物学研究のさまざまな分野で応用されてきました。特に、組織再生を研究する方法として有用であった10,11,12。例えば、自然免疫細胞の動員および表現型の変化は、最近、UVレーザーまたは2光子レーザーアブレーションアッセイを用いて経時的に解析され、レーザーアブレーション部位¹⁰における骨芽細胞の回復も行われた。免疫細胞動員のライブイメージングは、病変後12時間(hpl)まで実施されました。ただし、麻酔の適切な調整と各当局からの承認により、より長いイメージング期間を想定することができます。Geurtzen et al. では、レーザー アブレーションの数日後まで分析が行われ、アブレーション部位の炎症環境を定義するのに役立ち、骨再生におけるマクロファージの支持的役割を確立するのに役立ちました¹⁰。骨組織における細胞死時に放出される活性酸素種³³の役割の研究など、他の多くの応用が考えられる。

2光子レーザー媒介細胞アブレーションを使用する利点の1つは、共焦点イメージングと組み合わせることができることです。ここで使用するソフトウェア( 資料表参照)は、イメージングとアブレーションを連続して行うモード(ライブデータモード)に設定することで、処理を高速化することができます。この技術のもう一つの利点は、アブレーションの精度です。アブレーションのサイズと形状は、ソフトウェアで非常に正確な方法で簡単に調整できます。ここで提示した実験環境では、アブレーション用に直径 25 μm の円形領域が選択されました。しかし、 ショウジョウバエ における他のアブレーション実験では、隣接細胞接合部³⁴を切断することにより胚上皮の組織張力を軽減するために、25μmの線形アブレーションが採用された。この精度により、特定の制御された数の細胞、単一細胞、さらには細胞膜のアブレーションが可能になります。

特に、2光子レーザーで行われる病変の種類は、自然に発生する損傷や細胞死とは似ていないため、再生研究だけでなく、他の分野でも留意する必要があります。特に、レーザーアブレーションは、周囲の組織における損傷を最小限に抑えながら、関心領域²⁰の細胞を完全に破壊(燃焼)することにより、非常に集中的な病変を生じさせるが、一方、機械的または他の種類の損傷は、より広いスケールでいくつかの組織タイプおよび層に影響を与える傾向がある。これは、さまざまな種類の細胞死(壊死、アポトーシス、オートファジーなど)³⁵および異なる再生結果を含む多様な結果につながる可能性があります。さらに、レーザーアブレーションに対する反応は、細胞および分子の用語で異なる場合があります。例えば、レーザー病変部位を囲む細胞は、原形質膜の完全性を失うかもしれないが、損傷を生き延び、完全性を回復することができることが示された³⁶。レーザーアブレーションはまた、損傷した細胞外マトリックスの領域を生じさせるが、これは、適用されたレーザービームのまさに中心における「熱爆発」および直接隣接する細胞における強い熱曝露から生じる可能性がある^10,37。それにもかかわらず、レーザーアブレーション部位を囲む細胞は、レーザーアブレーションされた心臓組織³⁸で示されるように、アポトーシス体の数の増加を示し、ここに示すように免疫応答が引き起こされる。説明した違いに加えて、レーザー支援アブレーションアッセイの別の制限は、損傷を実施できる深さと標本のサイズが限られていることである可能性があります。厚い試料に隠れた構造は、適切にアブレーションされず、イメージングが困難になります。ただし、これは、使用する顕微鏡とレーザー、および対物レンズと埋め込みに大きく依存します。

プレクルが皿のガラス底に近接して配置されるように幼虫を埋め込むことは、提示されたプロトコルのように逆さまのセットアップを使用する場合に不可欠です。さらに、高温のアガロースは幼虫に損傷を与えるため、LMAを幼虫に覆うために適用する前にLMAの温度をテストすることが非常に重要です(ステップ3.4)。これを回避するには、ガラス底皿から残ったE3メディアを取り外すなどして、サーモブロックからLMAアリコートを早期に取り出し、手首の皮膚などの温度をテストします。LMAは暖かく、暑くはないはずです。

幼虫がLMAで覆われたら、LMAが固まり始める前に、幼虫を正しい位置に素早く配置することが重要です。横方向の位置は、最も簡単に実現できます。提示された研究では、望ましい位置は横方向で、腹側にわずかに傾いていました。幼虫が正しく配置される前にLMAが固化した場合は、LMAを取り外して(ステップ5.1のように)、埋め込みを繰り返すことができます。同様に、画像化(およびレーザーアブレーション)する領域は、最大の画質と細胞アブレーションのために、皿のガラス底にできるだけ近づけることが重要ですが、これは対物レンズの作動距離にも依存します。

イメージングのために、同じ皿に複数の幼虫を埋め込むことが可能です。これにより、時間を節約し、LMAをより有効に活用できます。埋め込むことができる幼虫の数は実験者の経験によって異なりますが、3〜5匹の幼虫をお勧めします。

レーザーアブレーションは、ディッピングレンズを使用した直立顕微鏡のセットアップでも行うことができます。この場合、幼虫をわずかに腹側から(上から)見て埋め込むことが重要であり、良好なイメージング品質とオペラクルのレーザーアブレーションの成功を可能にする。さらに、LMAの薄い層のみが幼虫を覆う必要があります。これにより、蛍光シグナルの良好な励起と検出が可能になります。

このプロトコルでは、骨芽細胞の 2 光子レーザー媒介アブレーション セットアップが、骨、特に蓋骨の発達中の病変を実行する方法論として説明されています。この方法は、発育中のゼブラフィッシュの他の骨の細胞を切除するために適応させることができます。さらに、それは一般に、損傷した組織の再生を研究するための有用なアプローチである^11,12。アブレーションやさまざまなサイズや形状の組織カットを簡単に行うことができるため、さまざまな実験装置や研究分野での使用が可能になります15,17,18,19,21,34。全体として、2光子レーザー媒介アブレーションは、さまざまな組織、生物、さらにはin vitroの設定に対しても非常に適応性の高い方法であり、生物学研究における重要なツールを表しています。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
塩化カルシウム二水和物、CaCl2·H2O	Carl Roth	5239.1
細胞培養皿、PS、100/20 mm	Greiner Bio-one	664160
Dumont #55 Foceps	FST	11295-51	先端形状 ストレート、11 cm、0.05 x 0.02 mm
Falcon 6 ウェルプレート	Corning	353502
ガラス底マイクロウェル皿	MatTek	P35G-1.5-14-C	35 mm ディッシュ、No. 1.5 カバースリップ、ガラス径 14 mm、コーティングされていない
Insight X3 多光子レーザー	Spectra-Physics
Leica Application Suite	LAS X、ライカ マイクロシステムズ
低融点アガロース	Biozyme	840101	Biozym Plaque Agarose
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O	Sigma-Aldrich	M5921
嵌合ケージ			多くの品種、例えば、Tecniplast
Methyleneblue	Carl Roth	A514.1
MS-222	SIGMA Aldrich	A5040
塩化カリウム、KCl	PanReac AppliChem	131494
塩化ナトリウム、NaCl	カールロス	3957.1
SP8 ファルコン	ライカマイクロシステム		Insight X3多光子レーザーとライカアプリケーションスイートソフトウェアを装備
ステンレススチール解剖ニードル	Bochem	12010	140 mm
実体顕微鏡システム SZX16	オリンパス		LED照明ベースを装備 SZX2-ILLTQ
サーモスタットキャビネット TS - WTW	木部	TS 608/2-i	インキュベーション(胚)用
トランスファーピペット、3.5 mL	SARSTEDT	861171	155 x 15 mm、LD-PE、透明
Zeiss SteREO Discovery.V12 バージョン 4.7.1.0。	Axiocam MRmカメラとAxioVisionソフトウェアを搭載した	Zeiss