プロテイナーゼは細菌の病因に不可欠であり、侵入と免疫回避を可能にします。細菌の細胞質タンパク質と膜タンパク質を活性型で一段階で抽出することは悲惨です。このビデオ記事では、ゼラチナーゼを検出および特性評価するためのザイモグラフィー分析のために 、レプトスピラ の全細胞タンパク質を抽出する方法を示します。
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この記事について
サマリー
要約
病原菌のプロテイナーゼは、宿主の細胞外マトリックス (ECM) 成分と細胞障壁を積極的に分解し、宿主の免疫応答を修飾し、宿主防御システムを劣化させることにより、侵入と病因に寄与します。このため、プロテイナーゼは最も毒性の高い分子の 1 つとなり、その同定と特性評価は病気の予防と制御に不可欠です。多くの細菌は、外膜結合プロテイナーゼも持っています。活性型の外膜タンパク質の単離と特性評価は、外膜内に局在するため、重大な課題となります。本研究では、 レプトスピラ から細胞質ゼラチナーゼと外膜関連ゼラチナーゼの両方を抽出するシングルステップ法を実証し、ザイモグラフィーを用いてそれらの酵素活性を実証します。この方法では、デオキシコール酸ナトリウムを使用して細胞膜を破壊して結合タンパク質を放出し、6-アミノカプロン酸を使用して放出された膜タンパク質を天然の形で可溶化します。さらに、レプトスピラルゼラチナーゼのザイモグラフィー分析を示します。このアプローチは、さまざまな細菌病原体からメタロプロテアーゼ、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼを単離、精製、特性評価するための多用途のフレームワークを提供します。
概要
ほとんどの細菌性病原体は、病因の発生中に標的臓器への侵入および播種中に宿主の細胞外マトリックス (ECM) に遭遇する必要があります。コラーゲンは動物組織のECMの主成分を形成します1.ゼラチナーゼは、コラーゲンとその加水分解形態であるゼラチンに作用するプロテアーゼのグループです。ECM分解は、主にコラゲナーゼおよびゼラチナーゼを含むプロテアーゼのグループによって実行されます2,3。細菌性病原体は、コラゲナーゼとゼラチナーゼを使用して、侵入と病因の便宜のために宿主ECMをリモデリングまたは分解します4,5。細菌のECM分解酵素は、ワクチンおよび薬物標的化の潜在的な候補です5。
細菌のプロテアーゼは、分泌型および膜結合型で見られます6,7,8,9。細胞酵素抽出の多くの方法は、膜結合細菌ゼラチナーゼおよびコラゲナーゼの単離には効果がありません。同様に、膜結合プロテアーゼとゼラチナーゼのみを抽出する膜特異的な方法があります。膜タンパク質を含む総タンパク質の従来の抽出方法には、酵素活性に影響を与える可能性のある界面活性やカオトロピックイオンが含まれることがよくあります。酵素活性と溶解度を維持する抽出手順は、電気泳動分離に不可欠であり、プロテアーゼ活性を検出するためのザイモグラフィー開発を可能にします。
デオキシコール酸ナトリウムは、細胞膜を破壊することで細胞を溶解できるイオン界面活性剤であり、細胞内容物と膜タンパク質の放出を可能にします。6-アミノカプロン酸は、放出された膜タンパク質を天然の形で可溶化することができます。6-アミノカプロン酸による可溶化は、電気泳動に影響を与えないという利点があります。ここでは、デオキシコール酸ナトリウムと6-アミノカプロン酸を用いて細胞および膜結合細菌プロテイナーゼを抽出し、それらを天然の可溶性形態で安定化させることを実証します10,11,12。この方法は、電気泳動を妨げることなく直接使用できる細胞および膜からのタンパク質を効果的に可溶化します13,14。用途に応じて、活性化バッファーに使用されるプロテアーゼ阻害剤と金属イオンを変更することにより、さまざまな酵素特性評価を実行できます。
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プロトコル
1. 細菌性ゼラチナーゼの抽出
注:試薬および材料の調製については 、表1 を参照してください。
- 10 mg/mLのウシ血清アルブミンを含むEllinghausen McCullough Johnson Harris(EMJH)培地で30°Cで生物を増殖させます。 抽出プロテイナーゼ13,14のために、3.5×108細胞/ mLを含む成長の中間対数期のレプトスピラ培養物10 mLを取ります。暗視野顕微鏡下でペトロフ・ハウスサー計数チャンバーで直接顕微鏡計数を使用して、成長の対数中期を観察します。
- 6,000 × g で10分間遠心分離して細胞を回収し、上清を容器に廃棄し、121°Cで60分間オートクレーブ滅菌して除染します。
- ペレットを1 mLの洗浄バッファーに懸濁して1.5 mLの微量遠心チューブに移し、6,000 × g で5分間遠心分離します。この洗浄を繰り返します。
- 10 mLの培養物から レプトスピラ ペレット用の抽出バッファー100 μLを加え、5分間ボルテックスすることにより、ペレットからタンパク質を抽出します。4°Cで1時間インキュベートして抽出を続けます。抽出したタンパク質を15,000 × g で4°Cで10分間遠心分離して回収し、ペレットを容器に廃棄し、121°Cで60分間オートクレーブ滅菌して除染します。
- タンパク質抽出物を同量の2xサンプルバッファーを添加することにより、ザイモグラフィーに直接使用します。
- Bradford推定アッセイを使用して、タンパク質濃度を測定します。
- タンパク質濃度が低い場合は、タンパク質を4倍の体積のアセトンと混合して沈殿させ、アセトンで沈殿させ、-20°Cで一晩インキュベートします。 翌日、サンプルを10,000 × g で10分間遠心分離し、得られたペレットを自然乾燥させ、PBSに再懸濁するか、目的のバッファーに溶解して-20°Cで最大1か月間保存します。凍結乾燥は長期保管または輸送に使用します。
注:抽出物中の活性プロテアーゼとプロテアーゼ阻害剤の欠如により、タンパク質はサンプル中で分解する可能性があります。
2.ゼラチナーゼのジモグラフィー
- ゼラチン共重合SDS PAGEゲルの調製
- ゲルの分解
- ゲルを鋳造するために必要な量の成分を添加して、分離ゲル混合物を作ります。50 mLビーカーの3.86 mLの水に、2.5 mLのTris-HCl(pH 8.8)、0.1%ゼラチン原液から0.1 mL、3.34 mLのアクリルアミド-ビスアクリルアミド溶液(ABA)、0.1 mLの10%SDS、0.006 mLのTEMED、および0.1 mLの10%過硫酸アンモニウムを加え、泡立ちや気泡なしでよく混合します。上記のシステム(通常のガラスプレート、18 x 8 cm)には、10 mLの分離ゲルミックスが必要です。
注:ゼラチンが冷凍アリコートからのものである場合は、溶けるまで解凍して、塊なしで溶液をクリアします。過硫酸アンモニウムを加えた直後に重合が始まるため、鋳造の直前に過硫酸アンモニウムを加えます。 - 分離ゲル混合物を、ウェルの底のマーキングから最大3~5 mm下の鋳造チャンバーに注ぎます。気泡を避けてください。
- ゆっくりと水を注ぎ、ゲルの上部に均一な1mmの層を作り、気泡を取り除きます。ゲルを1時間設定します。
注:ゲル形成は、水の層とゲルの間の相分離を探すことによって確認できます。ジェルカセットを傾けてもジェルを注ぐことはできません。
- ゲルを鋳造するために必要な量の成分を添加して、分離ゲル混合物を作ります。50 mLビーカーの3.86 mLの水に、2.5 mLのTris-HCl(pH 8.8)、0.1%ゼラチン原液から0.1 mL、3.34 mLのアクリルアミド-ビスアクリルアミド溶液(ABA)、0.1 mLの10%SDS、0.006 mLのTEMED、および0.1 mLの10%過硫酸アンモニウムを加え、泡立ちや気泡なしでよく混合します。上記のシステム(通常のガラスプレート、18 x 8 cm)には、10 mLの分離ゲルミックスが必要です。
- スタッキングジェル
- 以下の成分を混合してスタッキングゲルを調製します。10 mLビーカーの1.84 mLの水に、2.5 mLのTris-Cl(pH 6.6)、0.35 mLのABA、0.03 mLの10%SDS、および0.006 mLのTEMEDを加えます。厚さ1 mmの8 x 10 cmシステムには、3 mLの分離ゲルミックスが必要です。
- ゲルカセットから、ゲルセットアップを片側に傾け、細い濾紙を使用して角から集めた水を吸い取ることにより、ゲルの上部に形成された水をデカントします。
- ステップ2.1.2.1で述べた混合物に0.03mLの10%APSを加え、気泡を形成せずに混合します。
- スタッキングゲルを分解ゲルに注ぎ、コームの歯の下に気泡を形成せずにすぐにコームを所定の位置に置き、分解ゲルとコームの歯の底の間に3〜5 mmの厚さのスタッキングゲルを残します。ゼラチンの完全な重合と架橋まで少なくとも3時間待ちます。
- 下部スペーサーを取り出し、電気泳動装置にゲルを固定します。
- ゲルを1x電極バッファーの入ったタンクにゆっくりと入れ、ゲルの底に空気が閉じ込められていないことを確認します。
- ゲルの分解
- サンプルの準備
- 同量のサンプルバッファーを抽出物に加え、37°Cで30分間インキュベートして、SDSがタンパク質に結合できるようにします。2 μLのヒト血清を含むサンプルと同量のサンプルバッファーをポジティブコントロールとして使用します。
- サンプルのロード
- 先端の狭いピペットまたはハミルトンシリンジ(0.5〜1 mL)を使用して、サンプルをウェルに慎重にロードします。電極バッファーを徐々に追加して、ロードされたサンプルを乱すことなく、ウェルの残りの部分、ゲルの上部、および電気泳動ユニットの上部タンクを満たします。
注:ハミルトンシリンジは、相互汚染を避けるためにサンプル間で完全に洗浄する必要があります。
- 先端の狭いピペットまたはハミルトンシリンジ(0.5〜1 mL)を使用して、サンプルをウェルに慎重にロードします。電極バッファーを徐々に追加して、ロードされたサンプルを乱すことなく、ウェルの残りの部分、ゲルの上部、および電気泳動ユニットの上部タンクを満たします。
- 電気泳動の実行
- ゲルあたり6 mAで電気泳動を開始し、色素フロントが分離ゲルに入るまで実行します。次に、電流をゲルあたり12mAに増やし、色素の前面がゲルの底から1cm上に達するまで続けます。
注:実行時間は、使用するABAの濃度と標的タンパク質のサイズによって変化する場合があります。
- ゲルあたり6 mAで電気泳動を開始し、色素フロントが分離ゲルに入るまで実行します。次に、電流をゲルあたり12mAに増やし、色素の前面がゲルの底から1cm上に達するまで続けます。
- 規格のバンドの向きをマークする
- 電気泳動が完了したら、プレート分離ツールまたはプラスチックスパチュラを使用してガラスプレートを慎重に分解し、ゲルの右下隅を切断してサンプルローディングの方向をマークし、近くに穴を開けるかゲルをスキャンして染色済みのマーカーバンドにマークを付けます。
- 分解酵素の再生
- ゲルトレイ内のTriton X-100を含む再生溶液にゲルを沈め、振とうことなく室温で30分間インキュベートします。
注:分離されたタンパク質を含むザイモグラムゲルは、SDSの存在下で変性して活性を失う可能性があるため、Triton X-100はタンパク質を変性させます。
- ゲルトレイ内のTriton X-100を含む再生溶液にゲルを沈め、振とうことなく室温で30分間インキュベートします。
- プロテアーゼ活性のためのインキュベーション
- 再生溶液をゲルを完全に沈める活性化バッファーに置き換え、インキュベーターで37°Cで18時間インキュベートします。
注:必要に応じて、プロテイナーゼ活性を特徴付けるために、目的のプロテイナーゼの阻害剤または活性化剤を添加することにより、活性化バッファーを変更します。
- 再生溶液をゲルを完全に沈める活性化バッファーに置き換え、インキュベーターで37°Cで18時間インキュベートします。
- ザイモグラムの染色
- インキュベーション後、活性化バッファーを取り除き、ゲルを水で1分間短時間すすぎ、残っているTriton X-100を除去し、振とう中の泡立ちを防ぎます。
- 染色液をトレイに加え、ゲルが完全に浸透していることを確認します。損傷を防ぐために、ジェルを低速で軽く振ってください。ゲルが完全に青くなるまで染色を続けます。
- ジェル表面の余分な汚れを水で1分間洗い流して取り除きます。脱色液をトレイに加え、軽く振ってください。青い背景に対して目的のバンドコントラストが得られるまで、脱色液を新しい溶液と数回交換します。
注:脱色を行っている間、ゲルが完全に脱色されないように継続的に監視し、タンパク質分解バンドの観察と記録を可能にします。 - ゲルドキュメンテーションシステムまたはドキュメントスキャナーでゲルをスキャンし、タンパク質標準と比較してタンパク質バンドの分子量を決定します。
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結果
結果は、ヒト血清からのレプトスピラルタンパク質とゼラチナーゼのザイモグラムを示しています。 図1に示す結果は、プロテアーゼを青い背景に白い透明なバンドとして表しています。バンドは、共重合ゼラチンが分解され、したがって染色されていない領域を表しますが、ゼラチンの存在によりゲル全体の他の領域は青色に染色されます。さらに、ゼラチンもタンパク質であるにもかかわらず、アクリルアミドとの共重合により電気泳動で溶出しないことが示されました。これは、共重合と正しい組成と重合のための十分な時間の重要性を示しています。
図1:ゼラチナーゼ活性を示すザイモグラム。レプトスピラからの...
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ディスカッション
アクリルアミドゲルの調製中に、ゼラチンはアクリルアミドポリマーマトリックスと共重合します。その結果、共重合ゼラチンはゲル内に固定化されたままであり、たとえタンパク質であっても電気泳動中に移動しません。電気泳動後、デオキシコール酸と6-アミノカプロン酸緩衝液を使用して抽出された天然タンパク質は、その質量と電荷に応じて分離します。SDSを除去した後、これらのタンパク質はTriton X-100の存在下で再生成され、活性を取り戻します。天然条件下では、さまざまなゼラチナーゼの要件に応じて、酵素は共重合ゼラチンを分解し、その領域をクマシーブルーで染色することはできません。これらのバンドは、染色されたゲルをスキャンした後、デンシトメトリーを使用して定量できます。
ここで使用されている抽出方法は、細菌細胞から天然の全タンパク質を抽出するのに十分な堅牢性を備えています。プロテアーゼは通常、その加水分解性のために生物学的システムで厳密に制御されているため、プロ酵素として不活性な形で生成および保存される可能性があります。4-酢酸ア...
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開示事項
著者には宣言すべき利益相反はありません。
謝辞
著者らは、MGMへの助成金 No.SR/S0/HS/0108/2012 を通じて支援してくれたニューデリー科学技術省SERB部門に感謝の意を表します
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 6-アミノカプロ酸 | メルク | A2504 | |
| 酢酸 | シグマ | 695092 | |
| アセトン | シグマ | 32201 | |
| アクリルアミド | シグマ | A-3553 | |
| 過硫酸アンモニウム | シグマ | A-3678型 | |
| ビスアクリルアミド | シグマ | M7279 | |
| ウシ血清アルブミン画分 V (BSA) | シグマ | A-8022 | |
| ブロモフェノールブルー | シグマ | B-8026 | |
| CaCl2 | メルク | C4901 | |
| クマシーブリリアントブルー | シグマ | 1.12553 | |
| デオキシコール酸塩 | シグマ・アルドリッチ | D6750 | |
| エリングハウゼン–マッカロー–ジョンソン–ハリス(EMJH)ミディアム、ディフコ | ディフコ | 279410 | |
| ゼラチン | メルク | G9382 | |
| グリセロール | メルク | G5516 | |
| グリシンG8790 | シグマ | G-8898型 | |
| レプトスピラ血清型コペンハーゲン株フィオクルスL1-130(ATCC BAA-1198) 、ICMR-RMRCポートブレアのバイオリポジトリに維持 | ICMR-RMRCポートブレアのバイオリポジトリで維持 | 最適成長温度30°C;C | |
| 塩化マグネシウム M8266 | シグマ | M8266 | |
| メタノール | シグマ | 17995-7 | |
| リン酸緩衝生理食塩水 | シグマ | P4417 | |
| プレート分離ツール | ワンダーウェッジル | ||
| ローター | サーモサイエンティフィック | ファイバーライト F15 8x50 サイ | |
| ドデシル硫酸ナトリウム(SDS) | シグマ | L-4396 | |
| テメド | シグマ | T-9281型 | |
| トリトンX-100 | シグマ・アルドリッチ | T8787 | |
| トリズマベース(TRIS) | シグマ | T6066 |
参考文献
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