提示された方法は、高効率のレンチウイルス媒介遺伝子送達システムを使用して、L2HGDH遺伝子を標的とするsgRNAを安定的に発現するヒト胚性幹細胞(hESC)株H9におけるCRISPR媒介遺伝子ノックアウトの生成を説明するものです。
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この記事について
サマリー
要約
ゲノム編集のためのCRISPR-Cas9システムは、幹細胞を含む哺乳類細胞の遺伝子機能研究に革命をもたらしました。しかし、この手法を特に多能性幹細胞に実用化するには、時間や労力がかかる、編集効率が低いなどの課題があります。ここでは、L2HGDH遺伝子のsgRNAを安定的に発現するヒト胚性幹細胞(hESC)系統において、高効率で安定したレンチウイルス媒介遺伝子送達システムを用いて、CRISPR媒介遺伝子ノックアウトを作製する方法について述べる。L2HGDH遺伝子のエクソン1を標的とするsgRNAを化学合成し、高効率な単一ベクター系でCas9とsgRNAの構成的発現を組み合わせたlentiCRISPR v2-puroベクターにクローニングすることで、hESC感染に対するレンチウイルス力価の高値とピューロマイシンによる安定選択を実現しました。ピューロマイシン選択細胞をさらに増殖させ、限定希釈法を用いて単一細胞クローンを得た。単一クローンを増殖させ、ウェスタンブロット分析を用いてL2HGDH発現を100%減少させることで確認されたように、L2HGDH遺伝子のホモ接合型ノックアウトクローンをいくつか取得しました。さらに、MSBSP-PCRを用いて、CRISPR変異部位を、選択したホモ接合クローンにおけるCas9のPAM認識配列の上流にマッピングした。正確な挿入/欠失を解析するためにサンガーシーケンシングを実施し、クローンの機能特性評価を行いました。この方法は、以前に報告された非ウイルス性遺伝子導入法と比較して、ホモ接合性欠失の割合が有意に高かった。このレポートはL2HGDH遺伝子に焦点を当てていますが、この堅牢で費用対効果の高いアプローチは、遺伝子機能研究のために多能性幹細胞の他の遺伝子のホモ接合ノックアウトを作成するために使用できます。
概要
ヒト胚性幹細胞(hESC)と人工多能性幹細胞(iPSC)は、体内のあらゆる細胞に分化する可能性を秘めた幹細胞です。これらの細胞は、ヒトの発生を研究するだけでなく、さまざまな疾患の根底にあるメカニズムを理解するための貴重なツールとして機能し、再生医療、疾患モデリング、および創薬に大きな期待を寄せています。このような研究には、特定の遺伝子が生物の発生、機能、および調節にどのように寄与しているかを調査することが含まれます1,2。
遺伝子の機能を解読するために、遺伝子ノックアウトや過剰発現などの遺伝子操作やゲノム編集など、さまざまな手法やアプローチが用いられています。その中でも、CRISPR-Cas9技術は、遺伝子ノックアウトおよび遺伝子編集研究のための最も効率的なアプローチとして浮上しています1,2,3。CRISPR-Cas9システムは、特定の目的のDNA配列を同定して結合するために特別に設計されたシングルガイドRNA(sgRNA)分子を利用して機能します。分子ガイドとして機能するsgRNAは、Cas9酵素を修飾が....
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プロトコル
本研究で使用した遺伝子配列、試薬、および機器の詳細は、 資料表に記載されています。
1. シングルガイドRNA(sgRNA)の設計、クローニング、レンチウイルスベクターの作製
注: L2HGDH 遺伝子のエクソン1を標的とする2つの異なるsgRNA配列は、どちらもQiuら6から適応され、それぞれ配列1および2のAGGおよびTGGのPAM部位が使用される。両方のsgRNAの長さは20 bpで、末端を修飾して、前の報告6で説明したように、制限酵素Bsmb1を標的ベクター(LentiCRISPRv2)にクローニングするためのリンカー配列を追加しました。リンカー配列は、クローニングを目的としたsgRNAの設計中に追加されました。
- アニール化学合成されたsgRNA6およびクローンを、以前に報告された7と同様に最適化されたプロトコルを使用してBsmb1シングルカットレンチウイルスベクター、LentiCRISPRv2に作製します。
- 標準化および最適化さ....
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結果
lentiCRISPRv2ピューロにおけるL2HGDH sgRNAのクローニング
lentiCRISPRv2ピューロベクターを市販で入手し( 「Table of Materials」を参照)、BsmB1で消化した結果、1.8 Kbのスタッファーフラグメントが放出されました。 図2Aに示すように、ベクターの完全な消化が観察されました。各コンストラクトについて、リバースsgRNA配列をプライマーとして、およびベクター配列内からのフォワードプライマー(U6-459F)を用いて、6つのクローンをインサートの有無についてスクリーニングした。このアプローチを使用すると、 図2Bに示すように、インサートを有するクローンのみが288 bpのPCR産物を生じ、sgRNAの逆配列を含まない陰性クローンはPCR産物を得られませんでした。
H9感染、安定選択、ウェスタンブロット
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ディスカッション
この研究では、CRISPR-Cas9技術を通じて、hESCの遺伝子欠失を高効率かつ費用対効果の高い方法で実現する方法を標準化しました。この方法は、hESCの感染からシングルセルクローンの選択と増殖まで、3〜4週間以内にhESCのL2HGDH遺伝子のホモ接合性欠失を達成することに成功しました(表1)。CRISPR-Cas9を介した遺伝子操作は、ほとんどの細胞で一過性トランスフェクションによって達成できますが、幹細胞ではトランスフェクション効率が低く、細胞毒性が高いため、これは困難になります。さまざまな研究で、回収されたクローンの最大10%が欠失を示していると報告されています。例えば、Maliらは、AAVS1遺伝子座3を標的とした後、ヒト誘導多能性幹細胞におけるゲノム編集効率が2%から4%であると報告した。別の研究では、ナイーブなhESCにおいて、多能性と神経分化に関与する長いノンコーディングRNAであるTSUNAを標的とする編集効率が1.3%〜8.4%であると報告されました
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開示事項
著者は、利益相反がないことを宣言します。
謝辞
この研究は、アラブ首長国連邦大学(UAEU)からの助成金 #12M105、助成金 #12R167(Zayed Center for Health Sciences)、21R105(Zayed Bin Sultan Charitable and Humanitarian Foundation(ZCHF))、およびアブダビの先端技術研究評議会(ATRC)の技術プログラム管理の柱であるASPIREから、ASPIREプレシジョンメディシン研究所アブダビ(ASPIREPMRIAD)の助成金番号VRI-20-10を通じて支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 2-メルカプトエタノール | Invitrogen | 31350010 | |
| 38.5 mL、滅菌済み + 認定フリー オープントップ 薄壁超透明チューブ | ベックマン・コールター | C14292 | |
| Accutase | 幹細胞技術 | 7920 | |
| bFGF 組換えヒト | Invitrogen | PHG0261 | |
| Brachyury Rabbit mAb | Abclonal | A5078 | |
| BsmBI-v2 | NEB | R0739S | |
| chir99021 | Tocris | 4423/10 | |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 354234 | |
| Cyclopamine | Stem cell technologies | 72074 | |
| DMEM 培地 | Invitrogen | 11995073 | |
| DMEM NUTRIENT MIX F12 | Invitrogen | 11320033 | |
| DPBS w/o: Ca and Mg | PAN Biotech | P04-36500 | |
| 胎児 bovie 血清 | Invitrogen | 10270106 | |
| FoxA2/HNF3β | CST | 8186 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb 抗体 | CST | 2118S | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem cell technologies | 7174 | |
| HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100x Solution | GE healthcare | SH30238.01 | |
| Ki-67 (D3B5) Rabbit mAb | CST | 9129 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | |
| L GLUTAMINE, 100x | Invitrogen | 2924190090 | |
| L2H-BMSBSP-F1 | Macrogen | CGTGCGGGTTCGCGTCTGGG | |
| L2HGDH ポリクローナル抗体 | Proteintech | 15707-1-AP | |
| L2HGDH-SgRNA1-F | Macrogen | CACCGCGTGCGG GTTCGCGTCTGGG | |
| L2HGDH-SgRNA1-R | Macrogen | AAACCCCAGACGC GAACCCGCACGC | |
| L2HGDH-SgRNA2-F | マクロゲン | CACCGCCCGCGG GCTTTTCGCCGG | |
| L2HGDH-SgRNA2-R | マクロゲン | AAACCCGGCGAA AAGCCCGCGGGC | |
| L2H-SeqF1 | マクロゲン | GCTAAAGAGCGC GGGTCCTCGG | |
| L2H-SeqR1 | マクロゲン | GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG | |
| L2H-UMSBSP-R1 | Macrogen | GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG | |
| LentiCRISPRv2 | Addgene | 52961 | |
| mTesR1 完全培地 | 幹細胞技術 | 85850 | |
| Nanog 抗体 | CST | 3580 | |
| NEUROBASAL MEDIUM 1x CTS | Invitrogen | A1371201 | |
| Neuropan 2サプリメント 100x | PAN Biotech | P07-11050 | |
| Neuropan 27 サプリメント 50x | PAN Biotech | P07-07200 | |
| Oct-4 抗体 | CST | 2750 | |
| Pax6 (D3A9V) XP ウサギ mAb | CST | 60433 | |
| ペニシリン ストレプトマイシン ゾル | Invitrogen | 15140122 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| ポリブレン感染試薬 | Sigma | TR1003- G | |
| ポリエチレン、分岐 | Sigma | 408727 | |
| psPAX2.0 | Addgene | 12260 | |
| ピューロマイシン | Invitrogen | A1113802 | |
| qPCR レンチウイルス力価キット | Abm | LV900 | |
| 岩石阻害剤 Y-27632 二塩酸塩 | Tocris | 1254 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614/10 | |
| Sox2 | CST | 2748 | |
| スクロース | シグマ | 57-50-1 | |
| トリプシン .05% EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| U6-459F | Macrogen | GAGGGCCTATT TCCCATGATTC | |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | プロメガ | A1120 | |
| XAV 939 | トクリス | 3748/10 |
参考文献
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jiang, F., Doudna, J. A. CRISPR-Cas9 structures and mechanisms. Annu Rev Biophys. 46 (1), 505-529 (2017).
- Mali, P., ....
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再版と許可
