原核生物には細胞小器官系がありませんが、局所的なタンパク質を持つ細胞内領域があります。細胞内領域の酵素とタンパク質の定量的および定性的分析は、薬物およびワクチンの標的を開発するために重要です。ここでは、Triton X-114を用いたレプトスピラルタンパク質の細胞内分画とその解析を図示します。
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この記事について
サマリー
要約
原核生物は正確な細胞内細胞小器官を欠いていますが、細胞質、内膜、周形質、外膜などの明確な領域を示し、ほとんどの生化学的および生理学的機能が組織化されています。したがって、タンパク質の機能特性を理解するには、タンパク質の細胞内局在を解明する必要があります。しかし、グラム陰性菌から細胞内タンパク質を抽出するには、リン脂質二重層が複雑であるため、課題が生じます。Triton X-114 は外膜タンパク質 (OMP) 抽出に有望であることが示されていますが、簡潔なプロトコルは依然としてとらえどころのないままです。このプロトコルは、スピロヘータレ プトスピラ をモデルとして使用して細胞内タンパク質を抽出するための段階的なワークフローを示しています。この技術は、細胞内分画と相分離を特徴としており、細胞質、外膜、および内膜タンパク質の異なる画分を生成します。界面活性剤 Triton X-114 は、最適な曇り点温度 (~22 °C) と低い臨界ミセル濃度 (CMC) により相分離に適しており、変性を最小限に抑えながら天然タンパク質の効率的な抽出と精製を可能にします。特に、この分析により、細胞質とは異なる内膜と外膜のタンパク質を区別する効率が明らかになりました。
概要
細胞内プロテオミクス(SCP)解析は、細菌細胞の特定の細胞内コンパートメント内のプロテオームを解析することで、細菌の病因を解明する上で極めて重要な役割を果たします。この細胞内プロテオミクスアプローチは、異なるコンパートメント内の細菌タンパク質を特徴付け、非常に豊富なタンパク質を除外し、それらの組織と比例存在量に関する洞察を提供することで複雑さを軽減します1,2。たとえば、細胞内分画と LC-MS/MS 技術を採用した Shewanella oneidensis の研究では、そのプロテオームのかなりの部分が明らかになり、細胞とタンパク質の存在量のコンパートメント構造に関する重要な詳細が明らかになりました。この研究は、グラム陰性菌内の細胞内組織に関するその後の研究の基礎的な枠組みとして機能します3。細菌の病因の領域では、病原性を促進するメカニズムを理解するために、in vivo感染中の細菌プロテオームを描写することが不可欠です4。さまざまな感染段階にわたる上皮細胞内の細胞内サルモネラ菌のプロテオームを調査することは、細胞内環境内で細菌病原体が採用する適応戦略を明らかにするのに役立ちました4,5。SCP 戦略は、さまざまな細胞コンパートメント内のタンパク質の存在量と転座を評価することにより、細胞動態に関する包括的な洞察を提供します。この方法は、多様な細菌コンパートメントからのタンパク質の広範な同定を容易にし、細菌プロテオームの徹底的な分析を強化します 6,7。
タンパク質の細胞内分布は、タンパク質の機能活性を決定するだけでなく、機能的多様性も高めます8。たとえば、酵素は細胞内局在に応じてさまざまな調節メカニズムと活性レベルを示します。たとえば、トランスグルタミナーゼ(TGase)は、花粉管の異なる細胞内コンパートメントにわたって異なる役割または調節メカニズムを示します:細胞質TGaseは、Ca(2+)依存性の方法で細胞質ゾルタンパク質(アクチンやチューブリンなど)に第一級アミンを組み込み、細胞骨格と相互作用します。膜TGaseはゴルジ体および原形質膜に関連しており、エキソサイトーシス送達における役割を示唆しています。細胞壁関連TGaseは、細胞壁マーカーと共局在することにより、頂端の成長を調節します。これらの機能的区別は、コンパートメント固有の役割9によって媒介されます。さらに、細菌エンベロープ内の酸化タンパク質の修復は、活性酸素種に曝露された特定の細胞コンパートメント内の酵素システムの重要な役割を強調しています10。細胞内局在が脂質修飾によって調節され、多様な細胞膜との相互作用に影響を与える内皮一酸化窒素シンターゼ(eNOS)を考えてみましょう11。酵素のコンパートメント化は、酵素と基質の間の相互作用を助長する明確な環境を維持し、コンパートメント特異的な代謝プロセスを促進します12。
細菌や他の原核生物には、明確な細胞内細胞小器官がありません。細胞質、内膜、ペリプラズム、外膜など、異なる領域があります。生物の生化学的および生理学的機能のほとんどは、さまざまなサブセラーコンパートメントに組織化されています13。したがって、タンパク質の細胞内局在は、タンパク質の機能的特徴を予測するために重要です。しかし、グラム陰性菌から細胞内タンパク質を抽出するには、その複雑な二重膜リン脂質二重層のために課題が生じます。ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)などの界面活性剤や尿素などの添加剤を使用する従来の抽出法では、膜タンパク質の完全性が損なわれることが多く、下流の分析に影響を与えます14,15。さらに、脂質組成は、膜タンパク質のコンフォメーション変化の形成に重要な役割を果たします。このプロセスでは、脂質二重層への界面活性剤の挿入とそれに続くタンパク質の可溶化が含まれるため、可溶化の成功は界面活性剤-脂質-タンパク質比などの要因に依存します16。界面活性剤の選択は、曇り点温度やインキュベーション時間などの要因を考慮して、膜タンパク質を効果的に可溶化するために重要です17。脂質環境は、膜タンパク質の立体配座変化に影響を与える可能性があります18,19。
界面活性剤は、生体膜から膜タンパク質を抽出し、その後のタンパク質精製の前提条件である水溶液への溶解性を確保するために不可欠です。ただし、膜タンパク質は天然の脂質膜環境から除去され、界面活性剤緩衝液に入れられ、膜の物理的および化学的特性を部分的にしか再現できないため、膜タンパク質の精製はしばしば困難です20.抽出後、膜タンパク質は通常、透析、タンパク質沈殿、および可溶性タンパク質としての一部のクロマトグラフィー法を使用して、その後のプロセスで精製されます20,21.相分離は、クロマトグラフィーベースの精製プロトコルに代わる強力な代替手段または補完手段を提供し、可溶化タンパク質に直接適用できます。基本的に、相分離により、内在性膜タンパク質は界面活性剤濃縮相に分配され、界面活性剤が枯渇した水相では細胞質ゾルタンパク質に分配されます20,22.以前の研究では、膜タンパク質の可溶化に使用されるといくつかの界面活性剤が記載されています20.これらには、トリトンファミリー(トリトンX-100&トリトンX-114)、トゥイーンファミリー(トゥイーン-20、-80)、陰イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、ポリオキシエチレングリコールモノエーテル界面活性剤などが含まれますが、タンパク質、構造、機能の点で長所と短所があります20.これらの界面活性剤の物理化学的特性は、膜タンパク質の相分配と可溶化に大きく影響します20.界面活性剤は、極性ヘッドグループと疎水性炭化水素鎖を持つ両親媒性分子です。低濃度では、それらは水中にモノマーとして存在します。臨界ミセル濃度(CMC)を超えると、サイズが界面活性剤の種類に依存するミセルが形成され、凝集数はミセルあたりの分子数(ミセル分子量とも呼ばれます)を示します。もう一つの重要な要素は「曇り点」で、濁りを増やし、最終的に2つの異なる相を形成するミセル洗剤水溶液の温度を変化させることで到達できます。このプロセスは、相分離または濁点抽出として知られています。CMCが高いほど、結合が弱い高濃度の界面活性剤に対応する膜タンパク質が増え、定義された界面活性剤濃度の緩衝液に対して透析することができます20.ただし、ほとんどの界面活性剤で高いCMCに達するには高い曇点温度が必要であり、抽出されたタンパク質の構造と機能に影響を与え、下流のプロセスに影響を与える可能性があります。この段階の高濃度の界面活性剤でさえ、タンパク質に有害であり、粘度が高いため正確な量をピペッティングするための液体処理に問題を引き起こす可能性があります。たとえば、トリトンX-100は、64〜65°Cの混濁点温度を超える界面活性剤ミセル中に膜タンパク質の収率が高くなります。 使用温度を維持するには、9%-23%(NH4)2だから4 または、16%〜25%のNaCl添加を室温(RT)に減らすと、高濃度の界面活性剤が得られ、タンパク質の安定性に影響を与える可能性があります。同様に、トゥイーンベースの抽出では、高い曇り点温度(トゥイーン20の場合は76°C、トゥイーン80の場合は93°C)を使用します。陰イオン性界面活性剤SDSはタンパク質用途で頻繁に使用されますが、通常はタンパク質を変性させます20.研究者らは、膜タンパク質を効率的に抽出することを目指し、Triton X-114 が最適な渾濁点温度が約 22 °C であり、膜タンパク質の研究に理想的な古典的な界面活性剤であると特定しました。1981年にボルディエによって初めて導入されたTriton X-114は、それ以来、微生物だけでなく動植物組織を含むさまざまな供給源にわたる膜タンパク質の抽出と精製に広く使用されています20,22.Triton X-114のCMCが低いため、透析による除去が防止されます。ただし、その穏やかな性質により、界面活性剤が豊富な相での膜タンパク質の変性が最小限に抑えられます。さらに、Triton X-114はTriton X-100と比較してより小さなミセル(n = 7-8)を形成します20.James G. Prydeの研究プロトコルでは、培養哺乳類細胞からの膜タンパク質抽出にTriton X-114を使用しました。20°C以上の曇り点温度(30°Cで3分間インキュベート)を使用することにより、内在性膜タンパク質は界面活性剤濃縮相に分配され、末梢タンパク質とサイトゾルタンパク質は界面活性剤が枯渇した水相から回収されました22.さらに、David A. Haakeらは、Triton X-114を使用して、外膜タンパク質(OMP)を抽出しました。 Leptospira interrogans、CaClの有無にかかわらず2 添加剤として23,24.その後の研究では、Triton X-114 がグリセロールや CaCl などの添加物を使用せずに細胞内コンパートメントから OMP を効果的に抽出することが確認されました225,26.ただし、塩を含めると界面活性剤の濃度が上昇する可能性があり、ハイスループット質量分析を使用した大規模なプロテオーム研究に影響を与える可能性があります20.細胞内プロテオーム解析の研究では、Triton X-114 とタンデム質量分析を組み合わせて使用し、細胞質、内膜、外膜タンパク質を含むすべての細胞内コンパートメントにわたって有意な濃縮を達成しました25,26.本プロトコルの主な目的は、下流プロセスにおける問題を最小限に抑えながら、典型的なグラム陰性菌細胞の細胞内コンパートメントを効率的に濃縮することです。さらに、このプロトコルは費用対効果が高く、時間効率が高いように設計されています。ここでは、細胞内タンパク質単離のために研究室で開発された最適化されたプロトコルについて詳しく説明し、抽出プロセス中に遭遇する各ボトルネックについて説明します。
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プロトコル
注:このプロトコルは、細胞内タンパク質抽出実験に レプトスピラインターロガン を利用します。このプロトコルは他のグラム陰性菌での使用にも適応できますが、特定の研究目的に応じて最適化が必要になる場合があります。 材料表 と 表 1 は、それぞれ緩衝液と試薬溶液の組成とともに、化学物質と機器のリストを示し、 表 2 は 実験施設の概要を示しています。
1. レプトスピラ 株と培養条件
- L. interrogans血清型Icterohaemorrhagiae serovar Copenhageni株Fiocruz L1-130を入手します。
注:この株は、レプトスピラ症の診断、参照、研究、およびトレーニングを専門とするWHO協力センターであるインドのポートブレアにあるインド医学研究評議会-地域医学研究センターから入手されました。 - 1%ウシ血清アルブミン(BSA)を添加した50 mLのEllinghausen McCullough Johnson Harris(EMJH)培地でレ プトスピラ (~1×106 細胞/mLを含む接種物)を増殖させます。
- 培養物が対数成長期(3.5×108 細胞/mL)に達するまで、30°Cでインキュベートします。培養培地のアリコートを栄養寒天プレートでテストして、培地が汚染されていないことを確認します。
注:暗視野顕微鏡とPetroff-Hausser計数チャンバーを使用して細胞をカウントします。詳細については、以前に公開された記事27 を参照してください。
2. 細胞採取
- 7日間のインキュベーション期間の後、 L. interrogans 培養物の3つの生物学的複製を等量(各25 mL)の遠心分離管に移します。
注: レプトスピラ 培養は、移送中にBSL-2実験施設の層流フード内で処理されました。 - すべてのチューブを2500 × g で4°Cで45分間遠心分離します。 消毒剤の入ったビーカーに上清を慎重にデカントし、廃棄します。次のステップに細胞ペレットを使用します。
- 細胞ペレットを5 mM MgCl2を添加したリン酸緩衝生理食塩水(各回1 mL)で3回洗浄し、各洗浄後に10,000 × g で4°Cで10分間遠心分離します。
注:このステップでは、EMJH培地中に存在する不要なBSAを細胞ペレットの表面から除去します。
3. 細胞内タンパク質抽出
- Triton X-114抽出
- 採取後に得られた レプトスピラ 細胞ペレットを、10 mM Tris-Cl(pH 8)、1%Triton X-114、および150 mM NaClを含む抽出バッファーで、採取されたペレットあたり1 mLの割合で処理します(表1)(オプション-プロテアーゼ阻害剤カクテルは、実験目的に応じて追加できます)。
注:この手順では、抽出バッファーを添加して膜タンパク質を抽出することにより、細菌を界面活性剤溶液にさらすだけです。 - 溶液が視覚的に濁るまで、25°C未満のマイクロピペットを使用して、抽出バッファーをペレットと穏やかに混合します。
- 混合物を4°Cで一晩インキュベートします。
- 得られた抽出物をマイクロピペットで再度混合し、15,000 × g で 4 °C で 30 分間遠心分離します。
- 上清を別のバイアルにデカントし、その後の抽出プロセスのために細胞ペレットを保持します。
注:この上清は、細胞質および外膜から豊富に存在する親水性および疎水性タンパク質の混合物を含み、相分離に使用されます。 - 10 mM Tris-Cl(pH 8)、8 M尿素、プロテアーゼ阻害剤カクテル、および1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含む50 μLのバッファーを細胞ペレットに加えます。
- 抽出バッファーを添加した後、混合物を5分間連続的にボルテックスし、4°Cでさらに5分間インキュベートします。
- 混合物を15,000 × g で4°Cで30分間再度遠心分離し、得られた上清をペレット画分(P)として指定します。
注:ペレット画分は、レプトスピラ25,26に大量の内膜タンパク質を含んでいることがわかりました。
- 採取後に得られた レプトスピラ 細胞ペレットを、10 mM Tris-Cl(pH 8)、1%Triton X-114、および150 mM NaClを含む抽出バッファーで、採取されたペレットあたり1 mLの割合で処理します(表1)(オプション-プロテアーゼ阻害剤カクテルは、実験目的に応じて追加できます)。
- フェーズパーティション
- 抽出液から得られた上清のTriton X-114濃度を2%に調整します。たとえば、上清の量が900 μLの場合、9 μLのTriton X-114界面活性剤を加えて、目的の濃度にします。
- 混合物を37°Cで1時間インキュベートし、2000 × g で30°Cで5分間遠心分離します。 この低速遠心分離により、相の分離を加速できます。
- 混合物を水性と洗剤の2つの異なる相に分離します。目に見える分離を実現するために、低速で適切な遠心分離を確保してください。必要に応じて、分離する前に1分間放置します。分離が起こらない場合は、必要に応じて手順3.2.2を繰り返します。
注:相分離は、分光光度計を使用した濁度測定、または静的光散乱によって視覚的に観察できます。濁点アッセイの精度を高めるには、濃度500 nMの疎水性色素(5-ヘキサデカノイル-アミノエオシン)を溶液に添加し、紫外可視分光法(UV-VIS)で分析します。 - 滅菌シリンジで界面に穴を開け、別のバイアルに移すことにより、上部水相を分離します。マイクロピペットを使用して底面の界面活性剤相を分離し、別のバイアルに保管します。
注:分離プロセス中は、両方の相を含むバイアルを慎重に扱ってください。注射器でバイアルに穴を開ける前に、針の破損や上部水相の抽出の困難を防ぐために蓋を開けてください。シリンジを使用すると、分離後の各相のより正確な体積測定が保証され、相間のタンパク質の相互汚染が最小限に抑えられます。 - 相を水性(A)と界面活性剤(D)としてラベル付けし、将来の使用のために-20°Cで保存します。
4. タンパク質推定
- ビシンコニニックアッセイ28 またはその他の適切な方法を使用して、各Triton X-114画分(水性、界面活性剤、およびペレット)のタンパク質濃度を評価します。
5.ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)ゲル電気泳動
注:各画分(水性、界面活性剤、ペレット)からのタンパク質は、ベータ-メルカプトエタノールで処理して還元し、10%SDS-PAGE(3回の生物学的複製)を使用して分離する必要があります。10% SDS-PAGE のレシピを 表 1 に示します。タンパク質サンプルのターゲティングでは、酵素活性分析は、ネイティブPAGEで分離できるネイティブ形式で行う必要があります。
- サンプルの4倍の体積を使用して、タンパク質サンプルを氷冷のアセトンに再懸濁します。混合物を-20°Cで最低2時間インキュベートし、14,000 × g で10分間遠心分離します。さらに、ペレット画分を80%氷冷アセトンに再懸濁し、4°Cで5分間インキュベートします。 14,000 × g で 10 分間遠心分離して、過剰な尿素塩結晶を除去します。
- 遠心分離後、上清を慎重に除去し、すべての残留アセトンがバイアルから蒸発するまでプロテインペレットを乾浴に入れます。
- タンパク質サンプルをベータメルカプトエタノールを含む20 μLサンプルバッファーでインキュベートし、ウォーターバスまたはドライバスで95°Cで10分間加熱します。
注:ここで、タンパク質サンプルは、細胞質タンパク質を含む水性(A)画分、外膜タンパク質を含む界面活性剤(D)画分、および内膜タンパク質を含むペレット(P)画分を表します。 - A、D、およびPを含むサンプルを、染色済みタンパク質マーカー(M)および総タンパク質(T)とともに10%SDS-PAGEゲルの各ウェルにロードします。
注:全タンパク質は、20 μLのサンプルバッファーを使用して、3つの画分すべてを1つのバイアルにまとめることによって調製できます。 - 電気泳動装置に1x電極バッファーを使用します(表1)。ゲル実行パラメータをスタッキングゲルの場合は6 mA、分離ゲルの場合は12 mAに設定します。RTで電気泳動を実行します。
- クマシーブリリアントブルーGまたはラボで入手可能な他のタンパク質染色でゲルを染色します。
6. イムノブロッティング
- ゲル分離後、未染色のゲルを転写バッファー(25 mM Tris塩基、190 mMグリシン、20%メタノール)中で5分間インキュベートします。
- 適切なサイズのあぶらとり紙をイムノブロット転写バッファーで5分間インキュベートし、サンドイッチの最下層として組み立てます。
- ポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレンまたはニトロセルロースメンブレンを利用して、未染色のゲルからタンパク質を転写します。まず、PVDFメンブレンを無水メタノールに30秒間浸漬し、続いてイムノブロット転写バッファーに5分間浸します。その後、吸い取りサンドイッチに組み込んでください。
- 次に、転写バッファーから除去した未染色のゲルを置き、転写ブロッティングサンドイッチに使用します。
- 最後に、サンドイッチを他のあぶらとり紙の上に置いて覆い、ブロットローラーで閉じ込められた気泡を放出し、セミドライ転写法を使用して転写を実行します。
注:実験室の施設に応じて、乾式および湿式転写を含む他のアプローチを使用できます。 - メンブレンをブロッキングバッファー(TBS-0.1%トゥイーン20[TBS-T]中の8%脱脂乳)に2時間沈め、続いてレ プトスピラ リポタンパク質LipL41(1:5000)を標的とする単特異性抗血清*、またはべん毛フィラメント35 kDaコアタンパク質(FlaB)(1:4000)(*カスタム抗体)を4°Cで一晩インキュベートします。メンブレンをTBS-Tで3回すすぎ、各すすぎを5分間進めます。
注:目的の抗体を使用してください。抗体の希釈係数は異なる場合があります。 - 西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)IgG(1:20000希釈)と結合したマウス抗ウサギ二次抗体とメンブレンをRTで2時間インキュベートします。
- メンブレンを電気化学発光(ECL)試薬にさらして、タンパク質バンドを視覚化します。
- 暗室内の青色感受性X線フィルムの下にメンブレンを置きます。
注:他の現像方法も利用できます。
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結果
本実験では、スピロヘータの レプトスピラ をモデル生物として用いて、細胞内区画を抽出しました。私たちは、非イオン性界面活性剤であるTriton X-114の有効性を利用して、曇点と臨界菌糸体濃度(CMC)に固定された戦略的方法論を採用しました(図1)。さらに進む前に、タンパク質推定を実施して、単一の生物学的複製の各画分の濃度を評価しました。水性(A):界面活性剤(D):ペレット(P)画分で3:1:1.3の濃度比が観察され、生物学的複製の各バッチで一貫して観察されました。各Triton X-114画分から抽出したタンパク質サンプルをSDS-PAGE分析にかけ、その後イムノブロッティングして品質を評価しました(図2)。 レプトスピラ のLipL41およびFlaBタンパク質を免疫ブロット分析に使用し、さまざまな細胞内コンパートメントにわたるそれらの発現を調査しました26。表面露出外膜タンパク質29
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ディスカッション
細胞内分画技術は、その後の分析のために個別の細胞成分を単離する上で極めて重要な役割を果たします。非イオン性界面活性剤であるトリトンX-114は、サンプルを異なる相に分割する能力があり、さまざまな細胞成分の分離を可能にするため、これらの技術で一般的に使用されています32。Triton X-114 は、尿細胞外小胞、ゴルジ膜、細菌膜、ボレリア ブルグドルフェリやレプトスピラ インターロガンなどの病原体の外膜タンパク質など、さまざまな供給源から膜タンパク質 (天然の形) を抽出するのに特に有用です 25,32,33,34,35,36,37
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開示事項
著者らは、相反する金銭的利益はないと宣言している。
謝辞
著者らは、インドのニューデリーにあるインド医学研究評議会が、助成金番号を通じて提供された財政的支援に対して心から感謝の意を表します。Leptos/22/2013-ECD-I-2012-2400 およびインド、ニューデリーの科学技術省科学技術研究委員会、助成金番号による資金提供支援に感謝します。SR/SO/HS/0108/2012 から MGM へさらに、著者らは、助成金番号を通じて上級研究フェローシップを授与したインド、ニューデリーのインド医学研究評議会に感謝の意を表します。ICMR-SRF 2020-0756/プロテオミクス-BMS、フェローシップ/131/2022-ECD-II-2021-8230 それぞれ HP および AS および科学技術省、科学工学研究委員会、ニューデリー、インド、助成金番号。PDF/2017/000343からS.A.D.C.へ
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 酢酸 | シグマ | 695092 | |
| アセトン | シグマ | 32201 | |
| アクリルアミド | シグマ | A-3553 | |
| 過硫酸アンモニウム | シグマ | A-3678型 | |
| 秤 | 島杜ズ | Z741079 | |
| ビスアクリルアミド | シグマ | M7279 | |
| ウシ血清アルブミン画分 V (BSA) | シグマ | A-8022 | |
| ブロモフェノールブルー | シグマ | B-8026 | |
| 遠心分離管 (50 mL) | ターソンズ | 500020 | |
| キャップ付きコニカルフラスコ(150mL) | ターソンズ | 431030 | |
| 冷却遠心分離機 | エッペンドルフ | 5355316200 | |
| クマシーブリリアントブルー | シグマ | 1.12553 | |
| 暗視野顕微鏡 | ツァイス | GmbH37081 | |
| デリケートなタスクワイプ | キムテックサイエンス | 34155 | |
| ドライバス | エッペンドルフ | 535531620 | |
| エリングハウゼン–マッカロー–ジョンソン–ハリス(EMJH)ミディアム、ディフコ | ディフコ | 279410 | |
| ゲルトレイ:ゲルトレイは、寸法が少なくとも2cm幅で、蓋付きの滑らかで平らな表面を持っている必要があります。 | ホーファー | 該当なし | |
| ガラスビーク(150mL) | ターソンズ | 421030 | |
| グリシンG8790 | シグマ | G-8898型 | |
| イモビロンブロッティングろ紙 | ミリポール | IBFP0813C | |
| イムノブロットセミドライセットアップ | アタ | AE-6675 | |
| インキュベーター - ゲルトレイを37°Cで18時間インキュベートします。 | アイラ | SLI-700 | |
| 層流気流 | 該当なし | 該当なし | |
| ルミノール | シグマ | 09253 | |
| 塩化マグネシウム M8266 | シグマ | M8266 | |
| マグネチックスターラー | ターソンズ | 6040 | |
| メタノール | シグマ | 17995-7 | |
| マイクロピペットチップ(10µL–10mL) | アクシーゲン | T-10、T-200-C、T-1000-C、T-10ML-C | |
| マイクロピペット | エッペンドルフ | EP2231300010 | |
| マイクロチューブ(1.5 mL セーフロック) | エッペンドルフ | EP022363212 | |
| ミニスピン | ジェナクシー | GEN-MINI-6K | |
| マルチモードリーダー | BMGラボテック | S/N 413-3877 | |
| 無脂肪乾燥乳、ウシ | シグマ・アルドリッチ | M7409 | |
| P-クマル酸 | シグマ | C9008型 | |
| リン酸緩衝生理食塩水 | シグマ | P4417 | |
| 冷蔵庫 | LGの | GC-B217BLJ2 | |
| ロッカー - ゲルを染色するための低速のロッキングまたはロータリーシェーカー。 | ターソンズ | 4080 | |
| SDS-PAGE SETUP- 電気泳動装置 | 株式会社ホーファー | SE300-10A-1.0 | Hoefer モデル 'ミニVE'厚さ1mmの10cm×8cmサイズのゲルを鋳造できます。 |
| 塩化ナトリウム | シグマ | 5886 | |
| ドデシル硫酸ナトリウム(SDS) | シグマ | L-4396 | |
| テメド | シグマ | T-9281型 | |
| トリトン X-114 | シグマ | 648468 | |
| トリズマベース(TRIS)T6066 | シグマ | T6066 | |
| 渦動 | ターソンズ | 3020 |
参考文献
- Curreem, S. O. T., Watt, R. M., Lau, S. K. P., Woo, P. C. Y. Two-dimensional gel electrophoresis in bacterial proteomics. Protein Cell. 3 (5), 346-363 (2012).
- King, B. R., Latham, L., Guda, C. Estimation of subcellular proteomes in bacterial species. Open Appl Informatics J. 3 (1), 1-11 (2009).
- Brown, R. N., Romine, M. F., Schepmoes, A. A., Smith, R. D., Lipton, M. S. Mapping the subcellular proteome of Shewanella oneidensis MR-1 using Sarkosyl-based fractionation and LC−MS/MS protein identification. J Proteome Res. 9 (9), 4454-4463 (2010).
- Cash, P. Investigating pathogen biology at the level of the proteome. Proteomics. 11 (15), 3190-3202 (2011).
- Liu, Y., et al. Temporal regulation of a Salmonella Typhimurium virulence factor by the transcriptional regulator YdcR. Mol Cell Proteomics. 16 (9), 1683-1693 (2017).
- Rey, S., Gardy, J. L., Brinkman, F. S. Assessing the precision of high-throughput computational and laboratory approaches for the genome-wide identification of protein subcellular localization in bacteria. BMC Genomics. 6 (1), 162(2005).
- Lietzén, N., et al. Quantitative subcellular proteome and secretome profiling of influenza A virus-infected human primary macrophages. PLoS Pathog. 7 (5), e1001340(2011).
- Arioka, Y., Watanabe, A., Saito, K., Yamada, Y. Activation-induced cytidine deaminase alters the subcellular localization of Tet family proteins. PLoS One. 7 (9), e45031(2012).
- Del Duca, S., Faleri, C., Iorio, R. A., Cresti, M., Serafini-Fracassini, D., Cai, G. Distribution of transglutaminase in pear pollen tubes in relation to cytoskeleton and membrane dynamics. Plant Physiol. 161 (4), 1706-1721 (2013).
- Gennaris, A., et al. Repairing oxidized proteins in the bacterial envelope using respiratory chain electrons. Nature. 528 (7582), 409-412 (2015).
- Schilling, K., et al. Translocation of endothelial nitric-oxide synthase involves a ternary complex with caveolin-1 and NOSTRIN. Mol Biol Cell. 17 (9), 3870-3880 (2006).
- Mintz-Oron, S., Aharoni, A., Ruppin, E., Shlomi, T. Network-based prediction of metabolic enzymes' subcellular localization. Bioinformatics. 25 (12), i247-i252 (2009).
- Phukan, H., Sarma, A., Rex, D. A. B., Rai, A. B., Prasad, T. S. K., Madanan, M. G. Unique posttranslational modification sites of acetylation, citrullination, glutarylation, and phosphorylation are found to be specific to the proteins partitioned in the Triton X-114 fractions of Leptospira. ACS Omega. 7 (22), 18569-18576 (2022).
- Tinrat, S. Preliminary phytochemical analysis, antibacterial and anti-biofilm activities of Curcuma zedoaria (Christm.) Roscoe extracts. Malaysian J Microbiol. 18 (4), 344-353 (2022).
- Silhavy, T. J., Kahne, D., Walker, S. The bacterial cell envelope. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (5), a000414-a000414 (2010).
- Arnold, T., Linke, D. The use of detergents to purify membrane proteins. Curr Protoc Protein Sci. 53 (1), ps0408s53(2008).
- Santos, H. deL., Ciancaglini, P. A practical approach to the choice of a suitable detergent and optimal conditions for solubilizing a membrane protein. Biochem Educ. 28 (3), 178-182 (2000).
- Picard, M., Duval-Terrié, C., Dé, E., Champeil, P. Stabilization of membranes upon interaction of amphipathic polymers with membrane proteins. Protein Sci. 13 (11), 3056-3058 (2004).
- Rice, A. J., Alvarez, F. J., Davidson, A. L., Pinkett, H. W. Effects of lipid environment on the conformational changes of an ABC importer. Channels. 8 (4), 327-333 (2014).
- Arnold, T., Linke, D. Phase separation in the isolation and purification of membrane proteins. BioTechniques. 43 (4), 427-440 (2007).
- Fricke, B. Phase separation of nonionic detergents by salt addition and its application to membrane proteins. Anal Biochem. 212 (1), 154-159 (1993).
- Pryde, J. G. Partitioning of proteins in Triton X-114. In: Methods in Molecular Biology. , Humana Press. Totowa. (2000).
- Haake, D. A., Walker, E. M., Blanco, D. R., Bolin, C. A., Miller, J. N., Lovett, M. A. Changes in the surface of Leptospira interrogans serovar grippotyphosa during in vitro cultivation. Infect Immun. 59 (3), 1131-1140 (1991).
- Haake, D. A., et al. The leptospiral major outer membrane protein LipL32 is a lipoprotein expressed during mammalian infection. Infect Immun. 68 (4), 2276-2285 (2000).
- Thoduvayil, S., et al. Triton X-114 fractionated subcellular proteome of Leptospira interrogans shows selective enrichment of pathogenic and outer membrane proteins in the detergent fraction. Proteomics. 20 (19-20), (2020).
- Phukan, H., et al. Physiological temperature and osmotic changes drive dynamic proteome alterations in the leptospiral outer membrane and enhance protein export systems. J Proteome Res. 22 (11), 3447-3463 (2023).
- Murray, G. L., King, A. M., Srikram, A., Sermswan, R. W., Adler, B. Use of luminescent Leptospira interrogans for enumeration in biological assays. J Clin Microbiol. 48 (6), 2037-2042 (2010).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
- Shang, E. S., Summers, T. A., Haake, D. A. Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding LipL41, a surface-exposed lipoprotein of pathogenic Leptospira species. Infect Immun. 64 (6), 2322-2330 (1996).
- Evangelista, K. V., Hahn, B., Wunder, E. A. Jr, Ko, A. I., Haake, D. A., Coburn, J. Identification of cell-binding adhesins of Leptospira interrogans. PLoS Negl Trop Dis. 8 (10), e0003215(2014).
- Picardeau, M. Virulence of the zoonotic agent of leptospirosis: still terra incognita. Nat Rev Microbiol. 15 (5), 297-307 (2017).
- Hu, S., et al. Purification and identification of membrane proteins from urinary extracellular vesicles using Triton X-114 phase partitioning. J Proteome Res. 17 (1), 86-96 (2018).
- Radolf, J. D., Chamberlain, N. R., Clausell, A., Norgard, M. V. Identification and localization of integral membrane proteins of virulent Treponema pallidum subsp. pallidum by phase partitioning with the nonionic detergent Triton X-114. Infect Immun. 56 (2), 490-498 (1988).
- Nally, J. E., Whitelegge, J. P., Bassilian, S., Blanco, D. R., Lovett, M. A. Characterization of the outer membrane proteome of Leptospira interrogans expressed during acute lethal infection. Infect Immun. 75 (2), 766-773 (2007).
- Crother, T. R., Nally, J. E. Analysis of bacterial membrane proteins produced during mammalian infection using hydrophobic antigen tissue Triton extraction (HATTREX). Curr Protoc Microbiol. 9 (1), mc1201s9(2008).
- Casey, T. M., Meade, J. L., Hewitt, E. W. Organelle proteomics. Mol Cell Proteomics. 6 (5), 767-780 (2007).
- Bell, A. W., et al. Proteomics characterization of abundant Golgi membrane proteins. J Biol Chem. 276 (7), 5152-5165 (2001).
- Boonciew, P., et al. Improved antibody detection for canine leptospirosis: ELISAs modified using local leptospiral serovar isolates from asymptomatic dogs. Animals. 14 (6), (2024).
- Nogueira, S. V., et al. Leptospira interrogans enolase is secreted extracellularly and interacts with plasminogen. PLoS One. 8 (10), e0078150(2013).
- Riazi, M., Zainul, F. Z., Bahaman, A. R., Amran, F., Khalilpour, A. Role of 72 kDa protein of Leptospira interrogans. as a diagnostic marker in acute leptospirosis. Indian J Med Res. 139 (2), 308-313 (2014).
- Domingos, R. F., et al. Features of two proteins of Leptospira interrogans with potential role in host-pathogen interactions. BMC Microbiol. 12, 50(2012).
- Dhandapani, G., et al. Proteomic approach and expression analysis revealed the differential expression of predicted leptospiral proteases capable of ECM degradation. Biochim Biophys Acta Proteins Proteomics. 1866 (5-6), 712-721 (2018).
- Matsunaga, J., Werneid, K., Zuerner, R. L., Frank, A., Haake, D. A. LipL46 is a novel surface-exposed lipoprotein expressed during leptospiral dissemination in the mammalian host. Microbiology. 152 (12), 3777-3786 (2006).
- Pinne, M., Haake, D. A. A comprehensive approach to identification of surface-exposed, outer membrane-spanning proteins of Leptospira interrogans. PLoS One. 4 (6), e6071(2009).
- Madathiparambil, M. G., Cattavarayane, S., Perumana, S. R., Manickam, G. D., Sehgal, S. C. Presence of 46 kDa gelatinase on the outer membrane of Leptospira. Curr Microbiol. 62 (5), 1478-1482 (2011).
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