ここでは、共焦点顕微鏡を用いて、GCaMPカルシウム指標を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュの脳領域における神経活動を調べるための詳細なプロトコルを紹介します。
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この記事について
サマリー
要約
ゼブラフィッシュの幼生は、行動の神経メカニズムを研究するための有望な脊椎動物モデルシステムです。その半透明性と比較的単純な神経回路は、行動の細胞解析における光遺伝学的手法の使用を容易にします。GCaMP6などの in vivo 神経活動の蛍光指標は、ゼブラフィッシュの幼生の単純な行動に関連する神経活動の研究に広く使用されています。ここでは、トランスジェニック系統Tg(elav3:GCaMP6s)を使用して、半拘束されたゼブラフィッシュの幼生における感覚誘発活動を検出するためのプロトコルを紹介します。特に、アリルイソチオシアネートという化学薬品を用いて、後脳と脊髄の境界にある脳領域において、堅牢で再現性のある蛍光応答を誘導します。さまざまな行動パラダイムにおける神経活動の光学的モニタリングのためのGCaMP6の潜在的な使用と、この手法の限界について説明します。私たちのプロトコルは、ゼブラフィッシュの幼生の脳内の動的で行動に関連する in vivo 神経活動を監視するためのアクセス可能なアプローチを概説しています。
概要
ゼブラフィッシュは、詳細な細胞分子神経生物学的研究のための扱いやすさを備えた脊椎動物モデルです。ゼブラフィッシュの幼生は、受精後5日(dpf)で~100,000個のニューロンを持っており、これは哺乳類の脳よりも大幅に少ないです。さらに、ゼブラフィッシュは比較的半透明であり、この特性により神経構造と機能の光学的研究が容易になります1,2,3,4,5。ゼブラフィッシュで使用するためのいくつかの光遺伝学的ツールが開発されており、その中には、高忠実度のカルシウムインジケーター6、電圧センサー7、8、神経活動依存性マーカー9、10、11、12、13などがあります。これらのツールは、遺伝的改変14,15,16,17に対する適合性や、ゼブラフィッシュの幼生が入浴液18,19,20,21に存在する化学物質を吸収する準備ができているなど、このモデルが持つ他の利点を補完するものである。
ゼブラフィッシュの光学生理学、特に2光子顕微鏡、ライトシート顕微鏡、共焦点顕微鏡には、さまざまな方法が有用です。これらの各技術は、解像度の2つの関連する問題、すなわち、周囲の組織による光散乱を含む光学アクセスと、特にサブミリ秒スケールでの活動電位の動力学を捕捉するためのサンプリング速度とのバランスをとる必要がある22。二光子顕微鏡を用いたin vivoカルシウムイメージングには劇的な改善が見られたが、この方法はしばしば<1mm2の視野に制限され、典型的には、深さの1つの平面しか取得できないため、神経回路の広い領域にわたる活動の捕捉が制限される22。ライトシート顕微鏡の場合、脳内のほぼすべてのニューロンの活動を記録できる可能性により、2光子顕微鏡の視野制限が解消されますが、現在のカメラ速度では、ゼブラフィッシュの幼生の脳容積1あたり40平面で、キャプチャが物理的に毎秒約3脳容積に制限されています1,23。共焦点顕微鏡は、2光子顕微鏡や光シート顕微鏡に比べて、深さ分解能と捕捉速度の両面で劣ります。共焦点顕微鏡法は、世界中の研究室に広くアクセス可能であり、cFosやp-ERK9などの神経活動のレポーターを使用して神経活動の全脳再構成を達成する能力という利点があります。さらに、小さな脳領域を対象とする場合、共焦点顕微鏡は神経活動の適切な時間分解能を提供できます。
本論文では、共焦点顕微鏡を用いて、GCaMP6sを汎ニューロンに発現するトランスジェニックゼブラフィッシュの神経活動を記録する方法について述べています。ゼブラフィッシュの幼生を使用したいくつかの同様のプロトコルは、神経経路24、25、26、27、28、29の機能を理解するために開発されています。タイムラプスイメージング、カルシウムダイナミクスの蛍光指標、ライブイメージングなど、これらのプロトコルのいくつかの主な特徴を組み合わせて、嫌悪性化学刺激物であるアリルイソチオシアネート(AITC)に応答してゼブラフィッシュ中枢神経系のニューロンの小さな集団の神経活動を測定しています11,26,27,29,30,31.AITCは、後脳領域11に焦点を当てた脳全体の反応を誘発します。後脳のすぐ尾側にあるニューロンの1つのクラスターは、移動運動とAITCに対する長時間の応答に関与しています。この反応は、嫌悪刺激の除去30よりも持続する。視野を狭めることで、GCaMP6を発現する神経細胞の蛍光変化に反映されるこの神経クラスターの神経活動を検出することに成功しました。共焦点顕微鏡を使用して十分な時空間分解能を達成するための技術、ガイドライン、およびベストプラクティスを提供します。さらに、当社の光記録方式の限界についても説明します。これらの制限にもかかわらず、この方法は、記憶や感覚運動処理を含むさまざまな神経生物学的現象の調査を可能にするはずです。
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プロトコル
動物を使用するすべての手順は、カリフォルニア州立大学フラートン校の施設動物管理使用委員会によって承認されました(プロトコル#2023-1310)。
1. ゼブラフィッシュの幼生を低融点アガロースにステージング
- 汎ニューロン的に発現するTg(elav3:GCaMP6s)6の成体トランスジェニック動物を、施設の動物管理ガイドラインに従って、雄2頭から雌2頭で繁殖させます。成虫は特別な繁殖室に置かれ、放出された卵は成虫がアクセスできない偽の底を持つ下部の部屋に捕獲されます。最初の光が差し込むか、分離ディバイダーが取り外されると、メスは卵子を放出し、オスは偽の底に捕らえられた卵を受精させます。
- 成虫を取り出し、卵ストレーナーを使用して受精卵を採取し、胚(E3)培地(5 mM NaCl、0.33 mM MgSO4、0.33 mM CaCl2、0.17 mM KCl、1 mM HEPES、0.00001%メチレンブルー、pH 7.0)30 、インキュベーター内で28.5°Cで14時間光/10時間暗色)に入れます。
注:使用されているE3レシピは、蛍光に影響を与えたり、重要な自家蛍光シグナルにつながらない低濃度のメチレンブルーを含んでいます。GCaMP6sトランスジェニックラインによって提供される自然な半透明性のため、プロトコルで指定された発達年齢での1-フェニル2-チオ尿素(PTU)の使用は必要ありません。 - 受精後2〜7日(dpf)に、E3培地に溶解した3%低融点アガロースを使用して動物をマウントします。アガロースを加熱して、ゼブラフィッシュが生物に損傷を与えることなく操作できる温度にします。低融点のアガロースが冷えて固まる前(<1分)に、 図1に示すように、検査対象の脳領域ができるだけ目的に近づくように、ガラス底のペトリ皿に幼虫の背側を上にして配置します。実験にもよりますが、通常、実験群あたり8〜10匹のゼブラフィッシュで十分です。
注:このプロトコルでは動物は麻酔されませんでした。 - アガロースが幼虫を所定の位置に固めた後(約2〜3分)、5mLのE3溶液を追加します。次に、実験プロトコルの要求に応じてメスでアガロースを切断します。
注:ゼブラフィッシュのどの部分が拘束から解放される必要があるか、および/または異なる種類の刺激を受ける必要があるかによって、寒天のさまざまな部分を切り取る必要があります。 - ゼブラフィッシュの入ったシャーレを共焦点顕微鏡ステージに移し、魚が20分間順応するのを待ちます。
2. 刺激アプリケーションを用いた共焦点顕微鏡下でのセッティングとイメージング
- 順化期間の後、光源(~475 nm)を備えた明視野を使用して、室温で魚を40倍(NA 1.0)水浸対物レンズの中央に配置します。
- 共焦点顕微鏡の取得設定は、蛍光分子の品質と発現レベル、組織の深さと光学特性、視野のサイズ、および記録速度によって異なります。範囲インジケーターを使用して適切な設定を決定し、実験のニーズに応じて放出された光を最適に捕捉します。
- レーザー出力とマスターゲインを適切に調整して、最適な範囲で蛍光を捕捉することで、GCaMP6s依存の蛍光シグナルの不必要な損失を防ぎます。以下に示す主要な共焦点設定と要因のリストを使用して、適切な設定を決定します。
- ピンホールサイズ:これは、他の焦点面を制限しながら単一の焦点面を受け入れるように設定され、使用される対物レンズによって決定されます。このプロトコルでは、32μmのピンホールが使用されます。
- レーザー出力と波長:蛍光分子の発現レベルと組織の深さと光学特性に基づいてレーザー出力を調整します。範囲インジケーターを使用して、レーザーが光検出器の範囲を超えないようにします。励起波長は、蛍光分子を最適に励起する光の波長に設定します。この実験では、魚類はGCaMP6s導入遺伝子に対してヘテロ接合体であり、発現レベルが低かったため、波長488 nm、650マスターゲインで5%のレーザー出力を使用します。強力な導入遺伝子発現により、レーザー出力は1.5%から3%の範囲であり、通常はこれで十分です。
注意: レーザー出力の設定が低すぎると、情報(光電子増倍管によって検出された光)が失われます。レーザー出力の設定が高すぎると、放出される光が検出器の範囲を超えたり、サンプルが損傷したりする可能性があります(光漂白剤)。 - マスターゲイン:マスターゲインは、光検出器の感度を決定します。レンジインジケーターを使用して、マスターゲインが高すぎず、光検出器の範囲を超えないようにします。この実験では、マスター ゲインを 650 に設定します。
- 視野: 視野が目的の組織を捕捉するのに十分な大きさであることを確認してください。これは、図2に示すように、視野のサイズによって撮影速度が制限されるため、一般的に共焦点顕微鏡にとって大きな制限となります。AITCを含む実験では、視野を79.86μm2に設定します。
- キャプチャ速度:キャプチャ速度が上がると、光検出器によってキャプチャされる光の量が減少します。取り込む光が少なくなると、画質が劣化します。キャプチャ速度を確認します 画像の品質と、対象の生理学的イベントをキャプチャするために必要な速度のバランスを取ります。ここでは、キャプチャ速度を 1.20 f/s に設定しています。
- 視野を脊髄30の吻側部分のハレリ交連に尾側のニューロンクラスターの中央に置きます。このクラスターは ~2.5 dpf と非常に小さいですが、開発の後半でははるかに大きくなります (7 dpf)。
注:ステップ1のアガロースの取り付けが最適でない場合、つまり、動物がアガロースに斜めに配置されたり、深すぎたりすると、画質に悪影響を及ぼします。 図3に、適切に配置された動物のゼブラフィッシュの脊髄の画像と、最適でない配置のゼブラフィッシュの脊髄の対照的な画像が示されています。 - 79.86 μm2 の視野角、1.20 fps (fps) の空間分解能、0.119 μm2 /ピクセルの空間分解能を使用して、時系列スキャンを実行します。視野のサイズと画像取得の速度は、目的のアプリケーションに応じて調整します。
- イメージング開始から2分後に、AITCのストック溶液(最終濃度10 μM)またはE3溶液41.67 μLをピペットで皿に加えます。~30秒間記録を続けて、タイムラプスイメージングで対象領域のGCaMP6sアクティビティの変化を観察します。録音が完了したら、動物をアガロースから解放し、施設の動物管理ガイドラインに従って安楽死させます。
注:GCaMP6sの活動を記録している間、共焦点光自体が刺激になることがあります。これは、イメージング結果の分析で考慮する必要があります。録画時間は、各フレームのフレーム数とキャプチャレートの関数であり、必要に応じて必要な時間に合わせて調整できます。
3. FIJIを用いたGCaMP信号の解析
- 記録後、出力がダウンストリームのFIJI分析用の.tifファイル形式でない場合は、顕微鏡ソフトウェアスイートから画像ファイルを.tifファイルとしてエクスポートします。
- 神経トレースの分析のためにFIJIをダウンロードしてください。FIJIを開き、.cziファイルをプログラムにインポートし、プロンプトが表示されたら、BioFormatsプラグインのデフォルト設定を使用します。
- サークルツールまたはフリーハンドツールのいずれかを使用して、 それぞれのアイコンをクリックすることにより、関心のある領域/ニューロンを強調表示します。(アイコンにカーソルを合わせると、プログラム内のツールの名前が点滅します。
注:対象領域のサイズが異なるため、固定領域/円はできません。Thunderパッケージ32のような、ボクセルとしての経時的な蛍光変化の登録を可能にするソフトウェアは、個々のニューロンの検出を可能にすることができる;しかし、現在の実験の~20個のニューロンについては、ブラインドオブザーバーによる膜境界の検出は、自動検出システムよりも優れている可能性が高いでしょう。 - ROIを選択した後、FIJIツールバーで、 ROIマネージャー>>ツールの分析をクリックします。その後、[ 追加]をクリックすると、選択したROIがROIマネージャーウィンドウに追加されます。
- ROI マネージャー内で、[ 詳細] > [複数測定] をクリックします。設定をデフォルトのままにして、[ OK]をクリックします。FIJIは、Pythonを使用してCSVファイルとして、またはスプレッドシートの生データとして操作できる生データを生成します。
- 生データを正規化し、特定の関心領域のニューラルトレースとして表すには、刺激の 2 分前のウィンドウの最後の ~30 秒の値を平均し、刺激後のすべての値をその平均ベースライン値に正規化します。
正規化された蛍光強度 = (刺激後の特定の関心領域の瞬間的な蛍光)/(刺激前の 2 分間隔の平均蛍光 ~30 秒) - 図 4 に示すように、データをニューラル トレースとしてプロットします。
注:脳の体積が記録されるライトシート顕微鏡などの一部のタイプの顕微鏡では、運動アーチファクトは、参照脳の体積1,11への後処理空間登録を介して対処されます。ただし、1つの平面からのみ記録しているため、移動アーティファクトの調整はできません。したがって、ここに示す結果では、フレームは削除されていません。しかし、動きのアーチファクトによって結果が大きく変わる場合は、自動化されたシステムが動きのアーチファクト1、11を持つフレームを特定して修正したり、盲目のオブザーバーがそのようなフレームを削除したりすることができる。
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結果
アリルイソチオシアネートの投与は、ゼブラフィッシュの幼生にカルシウム関連神経信号を引き起こす
AITCの投与(ステップ2.6)は、ゼブラフィッシュの幼生の脳全体でGCaMP6s関連の神経活動の広範な増加を引き起こす11,30。図4に示すように、AITCを適用した後、脳の小さな領域で蛍光シグナルの増加が観察されました。
カルシウム関連神経信号の分解能、捕捉速度、捕捉領域のバランス
キャプチャ速度を上げると解像度が低下するため、実験計画ではこれを考慮する必要があります。 図5では、ゼブラフィッシュの胚を~2.5 dpfで使用したさまざまな速度とそれに対応する解像度を示しています。神経活動を記録する場合、キャプチャ速度は活動を記録するのに十分な速さである必要があります。活動電...
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ディスカッション
私たちは、神経活動がGCaMP6と共焦点顕微鏡法を使用してゼブラフィッシュの幼生の脳に記録できることを示しました。GCaMPの運動速度が遅いために必要とされる捕捉速度の低下は、観察される脳領域を減少させることによって補うことができる6。より高速な時間ダイナミクスを持つレポーター(すなわち、GCaMP6f)が利用可能ですが、優れた時間分解能は通常、蛍光シグナルの減少という代償を伴います6。共焦点顕微鏡は比較的遅い記録速度に制限されているため22、レポーター分子は共焦点顕微鏡の時間的制限を考慮して選択する必要があります。
このプロトコルは、1)記録中に動物をアガロースに配置する必要があること、および2)共焦点顕微鏡法の捕捉速度が比較的遅いことの2つの主要な特徴によって制限されています。視野とキャプチャ速度のバランスをとることは、特定のアプリケーションに対して十分な解像度で神経活...
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開示事項
著者らは、この研究は、潜在的な利益相反と解釈される可能性のある商業的または金銭的関係がない状態で実施されたと宣言します。
謝辞
この研究は、国立衛生研究所(SC2GM1304854)からのACRへの助成金と、国立科学財団(2050850)からのDLGへの助成金によって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 低融点アガロー | Invitrogen | 16520-100 | アリルに希釈 |
| Sigma Aldrich | 377430 | 化学刺激剤 | |
| E3 | N/A | N/A | ゼブラフィッシュ幼虫用水媒体 |
| ガラス底皿 | Thermo Fisher Scientific | 12-567-400 | イメージング実験 |
| 中にゼブラフィッシュを保持するために使用マイクロピペット (10-100 uL) | Cole-Parmer | 21600-14 | AITC 希釈液の作成に使用される装置 |
| 顕微鏡スライド | Fisherbrand | 12-550-A3 | 表現型のスクリーニングに使用 |
| 鏡面仕上げ鉗子 | DUMONT | 11251-23 | ブラフィッシュを配向するために使用されます |
| 。28.5° に設定します。C | |||
| ニトリル手袋 | MedPRIDE | MPR-50504 | ベーシック PPE |
| ペトリ皿 | VWR | 89107-632 | ゼブラフィッシュ用容器 |
| ポジクリックチューブ | DENVILLE | C-2171 | AITC 希釈に使用 |
| Samco ポリウレタントランスファーピペット | Thermo Fisher Scientific | 225 | 動物の選択/AITC Stemi の希釈ボーラス投与に使用される装置 |
| SV11 Apo 顕微鏡 | Zeiss | 1.25496E+11 | ゼブラフィッシュのステージングに使用 |
| ジェニック幼虫ゼブラフィッシュ (2 〜 7 DPF)N | /A | N/A | 動物実験対象;Tg(elav3:GCaMP6s)株 |
| ツァイス共焦点顕微鏡(モデルLSM9) | ツァイス | 3523004097 | 魚のイメージング |
参考文献
- Ahrens, M. B., Orger, M. B., Robson, D. N., Li, J. M., Keller, P. J. Whole-brain functional imaging at cellular resolution using light-sheet microscopy. Nat Method. 10 (5), 413-420 (2013).
- Meyer, M. P., Smith, S. J. Evidence from in vivo imaging that synaptogenesis guides the growth and branching of axonal arbors by two distinct mechanisms. J Neurosci. 26 (13), 3604-3614 (2006).
- Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors. Curr Biol. 15 (9), 804-814 (2005).
- Son, J. H., et al. Transgenic FingRs for live mapping of synaptic dynamics in genetically-defined neurons. Sci Rep. 6, 18734(2016).
- Zada, D., Tovin, A., Lerer-Goldshtein, T., Vatine, G. D., Appelbaum, L. Altered behavioral performance and live imaging of circuit-specific neural deficiencies in a zebrafish model for psychomotor retardation. PLoS Genet. 10 (9), e1004615(2014).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Abdelfattah, A. S., et al. and photostable chemigenetic indicators for extended in vivo voltage imaging. Science. 365 (6454), 699-704 (2019).
- Abdelfattah, A. S., et al. Sensitivity optimization of a rhodopsin-based fluorescent voltage indicator. Neuron. 111 (10), 1547-1563.e9 (2023).
- Gao, Y. J., Ji, R. R. c-Fos and pERK, which is a better marker for neuronal activation and central sensitization after noxious stimulation and tissue injury. Open Pain J. 2, 11-17 (2009).
- Kawashima, T., Okuno, H., Bito, H. A new era for functional labeling of neurons: activity-dependent promoters have come of age. Front Neural Circuits. 8, 37(2014).
- Randlett, O., et al. Whole-brain activity mapping onto a zebrafish brain atlas. Nat Methods. 12, 1039-1046 (2015).
- Reijmers, L. G., Perkins, B. L., Matsuo, N., Mayford, M. Localization of a stable neural correlate of associative memory. Science. 317 (5842), 1230-1233 (2007).
- Mohr, M. A., Argast, P., Pantazis, P. Labeling cellular structures in vivo using confined primed conversion of photoconvertible fluorescent proteins. Nature Protoc. 11 (12), 2419-2431 (2016).
- Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (42), 17968-17973 (2009).
- Wyart, C., Del Bene, F. Let there be light: zebrafish neurobiology and the optogenetic revolution. Rev Neurosci. 22 (1), 121-130 (2011).
- Douglass, A. D., Kraves, S., Deisseroth, K., Schier, A. F., Engert, F. Escape behavior elicited by single, channelrhodopsin-2-evoked spikes in zebrafish somatosensory neurons. Curr Biol. 18 (15), 1133-1137 (2008).
- Portugues, R., Severi, K. E., Wyart, C., Ahrens, M. B. Optogenetics in a transparent animal: circuit function in the larval zebrafish. Curr Opinion Neurobiol. 23 (1), 119-126 (2013).
- Best, J. D., Alderton, W. K. Zebrafish: An in vivo. model for the study of neurological diseases. Neuropsychiat Dis Treatment. 4 (3), 567-576 (2008).
- Goldsmith, P. Zebrafish as a pharmacological tool: the how, why and when. Curr Opinion Pharmacol. 4 (5), 504-512 (2004).
- Roberts, A. C., et al. Habituation of the C-start response in larval zebrafish exhibits several distinct phases and sensitivity to NMDA receptor blockade. PloS One. 6 (12), e29132(2011).
- Wolman, M. A., Jain, R. A., Liss, L., Granato, M. Chemical modulation of memory formation in larval zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (37), 15468-15473 (2011).
- Ji, N., Freeman, J., Smith, S. L. Technologies for imaging neural activity in large volumes. Nat Neurosci. 19 (9), 1154-1164 (2016).
- Panier, T., et al. Fast functional imaging of multiple brain regions in intact zebrafish larvae using selective plane illumination microscopy. Front Neural Circuits. 7, 65(2013).
- Distel, M., Köster, R. W. In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Liu, T. T., Hou, H., Du, J. L. A protocol for simultaneous Ca2+ and morphology imaging of brain endothelial tip cells in larval zebrafish. STAR Protoc. 2 (1), 100388(2021).
- Wong, H. C., Drerup, C. M. Using fluorescent indicators for in vivo quantification of spontaneous or evoked motor neuron presynaptic activity in transgenic zebrafish. STAR Protoc. 3 (4), 101766(2022).
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. J Vis Exp. (26), e1217(2009).
- Hirsinger, E., Steventon, B. A versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development. J Vis Exp. (119), e55210(2017).
- Renaud, O., Herbomel, P., Kissa, K. Studying cell behavior in whole zebrafish embryos by confocal live imaging: application to hematopoietic stem cells. Nat Protoc. 6 (12), 1897-1904 (2011).
- Roberts, A. C., et al. Induction of short-term sensitization by an aversive chemical stimulus in zebrafish larvae. eNeuro. 7 (6), (2020).
- Prober, D. A., et al. Zebrafish TRPA1 channels are required for chemosensation but not for thermosensation or mechanosensory hair cell function. J Neurosci. 28 (40), 10102-10110 (2008).
- Freeman, J., et al. Mapping brain activity at scale with cluster computing. Nat Methods. 11, 941-950 (2014).
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