方法論記事

茎潰瘍病原体によって誘発されるポプラ不定根:根の生物学と光応答関連過程を研究するための実験的システム

DOI:

10.3791/67304

2024年10月11日

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この記事について

サマリー

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ここでは、師部または表皮ガードル真菌病原体接種経路を介して不定根(AR)の産生を誘導するプロトコルを提示します。これは、根の生物学とポプラの光応答関連の生理学的プロセスの研究に適しています。

要約

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Valsa sordidaBotryosphaeria dothidea は、多くの植物宿主、特に Populus 属の種に損傷を与える 2 つの重要な壊死性真菌病原体です。これら 2 つの真菌病原体は、主にポプラの枝、茎、小枝に発生し、潰瘍性病変、キャノピーの立ち枯れ、しおれなどの古典的な症状を引き起こします。病原体接種は、植物病害のメカニズムを研究するための最も効率的な経路です。茎の接種部位周辺の潰瘍病変の他に、茎潰瘍病原体接種後のポプラ種では、新たな発生現象である鮮やかな赤色の大量の不定根(AR)が観察されました。本研究では、ポプラの木に真菌病原体を用いてARを誘導する方法について説明しました。この方法の重要なステップは、(師部または表皮)ガードル操作後の病原体接種です。2番目の重要なステップは、保湿素材の塗布です。パラフィルムによる保湿マニピュレーションと比較して、接種部位を家庭用ポリエチレン(PE)ラップで包むと、ガードル接種後20日でカラフルで多数の強固なARを生成することができます。最後に、シェーディング処理(茎をアルミホイルで包む)した後、ポプラ茎の接種リングから白いARが発芽しました。この手法は、根の発生と形態形成を研究するための新しい実験システムを導入し、根の発生、形態形成、および疾患ストレス下での応答の生物学を理解するために重要です。さらに、シェーディング処理と組み合わせることで、この研究は、フラボノイド、アントシアニン、またはその他の関連代謝産物の生合成、およびこれらのプロセスに関与する遺伝子または転写因子など、光応答に関連するプロセスを調べるための便利な実験システムを提供できます。

概要

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壊死性真菌病原体である バルサ・ソルディダボツリオスファリア・ドティディアによって引き起こされるポプラ茎潰瘍病は、ポプラ種の生態学的および経済的プランテーションの発展に深刻な損害を与えた中国北部の2つの重要な樹木病です。ポプラ潰瘍病は、常に幹や枝の樹皮に発生しますが、潰瘍性病変が典型的な症状です。疾患の発症後、拡大する潰瘍性病変は、宿主の師部、形成層、および木部に徐々に損傷を与えました。さらに、それらは血管系を通る同化製品と水の輸送に影響を与えました。しかし、潰瘍性病原体がどのように師部と木部の輸送を妨げるかは不明のままです。

潰瘍性病原体に感染したポプラの糖質と水分の輸送機構を明らかにするために、古典的なガーデンガードル操作と病原体接種法(菌糸ブロック創傷接種)を組み合わせた師部または表皮ガードルリング接種法1,2を提案した。これらの方法は、潰瘍性病原体によって引き起こされる蔓延プロセスと水と炭水化物の閉塞をシミュレートできます。

私たちの研究は、真菌病原体がポプラのキャノピーの立ち枯れを引き起こしたことを示しました 最初に炭素飢餓を誘発することにより、水力障害 1,3,4,5.驚くべきことに、茎潰瘍病原体の接種に関連するポプラ茎の特別な根茎形成が観察されました:大量の赤い不定根(AR)は、上部の茎の下端(師部または表皮ガードルリングリングリングの上端の反対側)から成長します。さらに、私たちの実験は、ARの産生がポプラと潰瘍の病原体の相互作用において普遍的であることを示しました。それらは、さまざまな年齢(1歳、2歳、さらには6歳)のポプラ種またはクローンの種類から生成される可能性があり、さまざまな潰瘍性病原体(V.sordidaおよびB.dothidea)またはそれらの分離株によって引き起こされる可能性があります。また、ポプラARの発色メカニズムについても検討し、フラボノイドやアントシアニンの生合成や、照明条件下での光関連遺伝子(または遺伝子モジュール)の遺伝子発現制御と関連していることを明らかにしました6。したがって、病原体によって誘導されるこれらのポプラARは、植物と病原体の相互作用、根の生物学、および光関連遺伝子の機能と発現の研究のための安定した理想的な実験システムとして使用できます。

本研究では、ガードリング接種経路によるポプラARs実験システムを確立するためのプロトコールを紹介・提供する。さらに、ARの形成に影響を与える重要な要因を指摘し、ポプラの根の生物学やその他の光応答関連の生理学的プロセスの研究におけるガードリング接種の潜在的な適用について詳しく説明します。

プロトコル

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1. ガードリング接種によるポプラARの誘導

  1. 真菌性潰瘍病原体の培養
    1. ジャガイモ抽出物6g、デキストロース20g、寒天20gを1000mLの水に溶かし、ジャガイモデキストロース寒天培地(PDA)を調製します。培地を121.1°Cで30分間滅菌し、各皿に約20mLのPDA培地が入ったシャーレ(直径9cm)に培地を注ぎます。
    2. PDAペトリ皿の中央に活性化した真菌菌糸体キューブ(~0.5cm)を接種します。
    3. 接種したPDAプレートを28°Cの暗所で7〜10日間インキュベートします。
    4. インキュベートしたPDA培地を真菌菌糸体とともにストラップ(幅1.2cm、長さ約3〜6cm)に切ります。
  2. ポプラ材の調製
    1. 1〜2歳で、元気に成長しているポプラの苗木を選択します。
    2. ポプラの苗木(直径1〜2 cm、病気や害虫の侵入がない)から成熟した茎/枝を選択します。
    3. ポプラの茎/枝の接種領域(地上または枝の付け根から約30cmの高さ)を洗います。茎/枝を75%アルコール溶液で滅菌します。
  3. 師部ガードル接種によるARの誘導
    1. 滅菌したポプラの茎/枝の表皮と師部を慎重にガードルし、ガードルされた師部リング(幅1 cm、部分的な形成層を含む)を取り外し、白い内側の形成層/木部組織を露出させます。
      注:ステップ1.3.2-1.3.4では、接種の代替方法を詳しく説明しています。
    2. 師部ガードル接種(GP)として菌糸体ストラップ(幅1.2cm)でガードル領域を完全に覆います。真菌の菌糸は露出した木部に直面しています。
    3. 露出した内側の形成層組織を滅菌ナイフで削り取って損傷させた後、PDAストラップ(幅1.2cm)をガードルリング領域に接種し、ガードル形成層除去処理(GR)を行います。
    4. ガードルコントロール(GC)として、未培養のPDAミディアムストラップ(幅1.2cm)をガードルリング領域に直接接種します。
    5. 接種した茎/枝を伸縮性があり、無色で透明な接ぎ木テープ(またはPEプラスチックフィルム)で包みます。水分を保つために4層を包みます。
    6. 接種した茎/枝を(金属、プラスチック、または木質の)棒(50 cm以上)で結び、防風林から守ります。
    7. 実験中に定期的な灌漑でガードルポプラ材料を栽培します。
    8. 外部から観察し、接種後14〜30日でポプラARの形成を記録します。
  4. 表皮ガードル接種によるARの誘導
    1. ステップ1.2で説明されているように、接種材料を選択して準備します。
    2. ポプラの茎/枝の表皮を慎重に包み込みます。
    3. 表皮リング(幅1.0cm)を取り外し、緑色の師部組織を露出させます。
    4. 師部組織をわずかに垂直に4回こすり落とし、師部の内部構造を露出させます。
    5. ガードル表皮領域に真菌性菌糸体(eGP)とPDAストラップ(eGC)を接種します。手順1.3.2-1.3.4と同様の接種操作を行います。
    6. ステップ1.3.5で説明されているように、接種した茎を接ぎ木テープ(またはPEプラスチックフィルム)で包みます。
    7. ポプラを管理し、手順1.3.6-1.3.8で説明されているようにARを観察します。

2. ガードル接種法による光関連遺伝子研究の実験系の確立

  1. 師部ガードルリング接種法(ステップ1.3.2-1.3.4)を使用してポプラARを誘導します。
  2. あるいは、ステップ1.4.5で説明したように、表皮ガードリング接種法を使用してポプラARを誘導します。
  3. ポプラの茎/枝(高さ15cm)の病原菌接種領域をアルミホイルで包む(遮光処理、S)またはアルミホイルラップなしで包みます(照明処理、L)。
  4. 茎/枝を>50cmの長さの棒に結び付けて、防風林から守ります。ポプラを定期的に栽培して管理し、ステップ1.3.6-1.3.7で説明されているように、実験中はポプラを十分に灌漑します。
  5. 接種後~20日でステムからアルミホイルをはがします。
  6. すぐにアルミホイルの陰影付き(S)と影なしのポプラAR(L)を観察して撮影します。
  7. 日陰のポプラARは、日光またはその他の人工光源/条件で栽培します。
  8. グラフトテープ(またはPEプラスチックフィルム)をはがし、光にさらされてから1〜5日後にポプラARを収穫します。
  9. すべてのARサンプルをアルミホイルで包みます。シェーディング処理を施したポプラARについては、暗所でサンプルを採取します。
  10. ARサンプルを液体窒素に浸し、さらに調査するために-80°Cで保存します。
  11. 光に曝露したポプラまたは非露光のポプラARをアルミホイルで包んだ後(暗闇で実施)、形態学的およびその他の in situ アッセイのために4°Cで保存します。

結果

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ガードリング接種を通じて不定根を誘導する茎潰瘍性病原体のワークフローを 図1に示します。ここで行われた実験では、茎潰瘍性病原体である V.sordidaB.dothidea、およびそれらの分離株(異なる宿主、地域、または病原性から)の両方が、ポプラ種でARの形成を誘発できることが示されました。このプロトコルでは、 V. sordida isolate CZC、CFCC86775、 および B. dothidea isolates SD50 および SD81 を使用して、 P. alba var. pyramidalis で AR を作製しました。 Vソディダ CZCは使用される典型的な病原体であり、中国総合微生物培養収集センター(CGMCC 40575)に寄託されています。 V.ソルディダアイソレート CFCC86775は中国林業文化収集センターから、SD分離株は山東省の潰瘍病ポプラの木から2つのSD分離株を採取し、当研究室に寄託しました。 図2に示すように、師部ガードルリング処理(図2Aパネル1)にカルスが形成され、金メッキと形成膜除去処理(図2A、パネル2)ではARがほとんど形成されませんでしたが、師部ガードルリング接種処理後(図2A、パネル3-6)には赤色の繊維状根が大量に形成されました。また、 ARは、P. alba var. pyramidalisPopulus × beijingensisP. alba × P. tremula var. glandulosa clone 84K、 P. euramericana cv. 'Bofeng 3'、またはその他の雑種ポプラなど、さまざまなポプラ種またはクローンで誘導されることも観察されました。しかし、このプロトコルでは、ARは1歳の P. alba var. pyramidalisの茎でのみ産生されます。最後に、 図2 パネル7に示すように、6歳の P. alba var. pyramidalis の幹にも、病原体 V. sordidaによる師部ガードルリング接種後にAR構造が誘導されました。ポプラの幹の直径は約6〜7 cmで、最も長い繊維状の根の長さは7.0 cmより長かった。

図2に示すように、日光条件にさらされた後、遮光ポプラARでは、アルミホイルで包まれたポプラ(図2B、パネル1)で生成された白い乳白色または淡赤色のARから、3日後の赤いAR(図2B、パネル4)に赤いセグメントが生成されました。また、光曝露後短時間で赤色色素が産生されることもわかり、遺伝子発現解析の結果、色素(主にシアニジン-3-O-グルコシド)の生合成は、フェニルプロパン代謝経路の始まりからの新規な生合成ではなく、アントシアニジン基質から直接形質転換されることが示されました6。

このプロトコルでは、2つのガードルリング法(師部と表皮ガードルリング)の両方が、病原体接種後にポプラ茎にARの形成を誘導することができます。表皮に接種したポプラの防風林が少なく、生理機能への影響(水や炭水化物の輸送など)も少なかった。ただし、師部ガードルリングではARの生成が少し速くて効率的であるようです。したがって、ポプラARの研究には師部ガードリング接種法が推奨されます。

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図1:ポプラのガードリング接種法による茎潰瘍病原体によって誘発される不定根(AR)形成の概略ワークフロー。 まず、茎潰瘍性病原体(暗所28°Cで7〜10日間培養)を菌糸体ストラップ(幅1.2cm)に切断しました。1年前のポプラの苗木または1年前の枝は、師部ガードルリング(茎の表皮、師部、および部分的な形成組織を含むガードルリングをガードルして廃棄する)または表皮ガードルリング(茎の表皮のみを含むガードルリングをガードルして廃棄する)の2つの方法によって茎(地面または枝の基部から~30 cmの高さで、青い矢印で示されています)にガードルされました。ガードル師部または師部リングの幅は1.0cmです。次に、ガードルされた領域を菌糸体ストラップで完全に覆い、すぐにPEプラスチックテープで包みました。ストラップの菌糸体の側面は、ガードルされた領域に面していました。根生や根の発達などの根生物学の研究のために、接種したポプラの苗木/枝を定期的な管理下で14〜30日間栽培しました(Pathway I、黄色の矢印で強調表示)。セグメントの生合成、光形態形成、または光関連遺伝子の発現制御の研究のために、追加のアルミホイルラッピングが採用され、その後、接種された苗木/枝が~20日間培養されてARが生産されました。ARが作製されたとき、アルミホイルは茎/枝から取り除かれ、ポプラARは日光またはその他の光条件(光スペクトル、強度、周期、またはそれらの組み合わせで異なる)の下で露光されました(Pathway II、赤い矢印で強調表示)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:茎潰瘍性病原体は、ポプラのARの光条件下で不定根(AR)およびセグメント生合成の形成を誘導した。A1:ガードル制御;A2:ガードルと形成層の除去(GR);A3-6: 異なる茎潰瘍病原体(V. sordidaおよびB. dothidea)は、1歳のP. alba var. pyramidalisの苗木にAR形成を誘導する;A7: ARは6歳のP. alba var. pyramidalisの枝で産生されます。(B)光曝露はポプラAR上のセグメントの生合成を誘導する。B1-B4 は、曝露後 0、1、2、3 日後に光条件下で曝露されたポプラ AR を表します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

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ポプラ種は、茎の挿し木からARまたは側根(LR)を生成する傾向があり、これはそれらの繁殖に貢献し、木の植物で研究する根の生物学のモデルとして貢献しています7,8。さらに、研究は、有益な細菌(Agrobacterium rhizogenes 9,10;植物成長促進根茎菌[PGPR]11)、エンドファイト菌12,13、アーバスキュラー菌根菌(AMF)14,15、または外生菌根菌(EMF)16,17は、植物の根の成長または発達を促進する可能性があります。しかし、宿主植物上のAR構造を誘導または促進する病原体(細菌も真菌病原体でもない)についての報告は報告されていません。

ここでの実験では、さまざまなポプラ潰瘍病原体( V.sordidaB.dothideaなど)がポプラの茎/枝にARの形成を誘発する可能性があることが示されています(図2A、パネル3-6)。さらに、実験では、1〜2歳の P. alba var. pyramidalisの苗木、 Populus × beijingensisP. alba × P. tremula var. glandulosa clone 84K、 P. euramericana cv. 'Bofeng 3'、さらには6歳の ポプラ の枝(図2A、パネル7)など、さまざまなポプラ種/クローンでARを誘導できることが示されました。しかし、 Malus spp.、 Prunus spp.、 Cedrus deodaraPinus massonianaの1歳の苗木/枝では、AR構造は生成されませんでした。その後、このプロトコルは、ポプラのAR産生の新しい経路を提供しました:ポプラの茎/枝に樹木真菌性潰瘍病原体(V.sordida および B.dothidea)をガードルで接種することにより、ARを誘導します。

実験はまた、師部と表皮の両方の方法が、病原体接種後にポプラ茎にARの形成を誘導できることを示しました。しかし、師部ガードルリング接種後のポプラ茎は、ガードルリングと樹皮(師部)の操作、および病原体の侵入によって引き起こされる靭性の大幅な低下のために、ガードルリング部位で容易に風で壊れます。したがって、AR誘導の場合、ポプラの茎/枝は、特に師部ガードリング法が使用された場合、それらが壊れるのを防ぐために棒にしっかりと結び付ける必要があります。

植物自体が主にARの形成を決定します。ただし、一部の環境要因の影響も受けます。例えば、ARは、一部の双子葉植物種18,19の浸水または洪水条件で誘発され得る。水分保持は、地上の茎/枝へのAR誘導の重要なステップでした。このプロトコルでは、パラフィルムと家庭用PEフィルムの両方を水分保存のために使用しました。しかし、パラフィルムのラップページは、新たに形成されたARによって浸透し、ポプラARの水分損失、成長遅延、褐変、および木化を引き起こす可能性があります。それどころか、PEで包まれたポプラの茎には、豊富で柔らかく、水分が豊富なARが収穫されました。したがって、このプロトコルでは、パラフィルムフィルムではなく家庭用PEフィルムが推奨されました。

根は植物の重要な器官であり、植物の繁殖、成長、栄養素、水分吸収に重要な役割を果たしています。次に、ポプラ種における根系形成20、形態と発生、および根系構造(RSA)21 の研究に方法を使用すべきである。さらに、研究は、根系と根圏細菌との間の関連が宿主植物の耐病性を向上させる可能性があることを示しました22。次に、ガードリング潰瘍病原体への接種は、ポプラARの分子的およびエピジェネティックな変化を誘発するはずであり、これは耐病性苗の栽培に応用できる可能性があります。

光は、植物の成長、発達、繁殖に影響を与える重要な環境要因です。陰影曝露実験(図2B)は、病原体誘発性ポプラARが植物セグメント(フラボノイド、アントシアニン23など)の生合成に理想的な実験システムであることを示しました。以前の研究では、光条件(親植物にさらされた強度、品質、持続時間、および量)が根の形成または根茎形成、および不定根と側根の両方の発達に影響を与えることも示されました24,25,26。したがって、照明条件の微調整により、このプロトコルの病原体誘発性ポプラARシステムは、ポプラ植物の根生物学やその他の光応答関連プロセスの研究に使用できます。

開示事項

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著者は何も開示していません。

謝辞

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本研究は、中央公益科学機関国家樹木遺伝育種研究研究所基礎研究基金(助成金番号CAFYBB2020ZY001-2)と中国国家自然科学基金会(助成金番号32171776)から趙嘉平市に共同で資金提供されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
寒天ソーラービオA8190  真菌の増殖に栄養を提供する
アルミホイルバイオシャープBS-QT-027B感染した領域に日陰を提供するには
ガードリングナイフMoGong ハードウェア ツール会社ポプラの茎/枝の表皮を包みます
接ぎ木テープCAPI5cm植物の菌類を修正するには
PD(ジャガイモ抽出、ブドウ糖) ソーラービオP7360真菌の増殖に栄養を提供する
PEプラスチックフィルムミャオジエ413703植物の菌類を修正するには
ペトリ皿Bkman biological Co.,Ltd 90ミリメートルPDA培地を準備する
サーモスタット式培養器上海昆天実験器具有限公司KTD-6000真菌の増殖のための環境を提供する

参考文献

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