方法論記事

角膜上皮掻爬術と角膜縫合糸の併用に基づくラットにおける重篤な角膜炎症モデルの確立

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DOI：

10.3791/67305

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2024年11月22日

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1Department of Ophthalmology, the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, 2School of Clinical Medicine, Guizhou Medical University, 3The Second People's Hospital of Guiyang City, 4Department of Biomedical Sciences, School of Infection, Inflammation and Immunology, College of Medicine and Health, University of Birmingham

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

私たちは、角膜上皮の掻爬術と角膜縫合糸の組み合わせにより、重度の角膜炎症のラットモデルを開発しました。この研究では、炎症条件下での角膜の炎症パターン、上皮の増殖、および辺縁系幹細胞の変化を評価しました。

要約

角膜の炎症、特に重度の角膜の炎症は、角膜辺縁系幹細胞の機能障害の発症に重要な役割を果たします。適切な動物モデルを構築することで、角膜辺縁系幹細胞に対する重篤な炎症の影響に焦点を当てることができます。2 mmの錆除去剤を使用して、Sprague Dawley(SD)ラットの中央角膜上皮を除去して損傷を負わせました。次に、角膜の中央間質をナイロン縫合糸で縫合して、持続的な炎症を誘発しました。このようにして、角膜上皮中央部の擦過傷と中枢間質縫合を伴う角膜炎症モデルが構築され、重度の角膜炎症が誘発されました。角膜の炎症の変化と辺系幹細胞の状態は、モデリング後1日、3日、7日で観察されました。モデリング後3日目に 、ラットの角膜辺部は重度の浮腫性であり、辺縁系幹細胞欠損症の典型的な徴候である明らかな血管新生と局所過形成を呈していました。7日目までに 角膜浮腫は徐々に悪化し、血管新生は増加し続けました。定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)と免疫蛍光染色により、角膜上皮炎症因子の発現が有意に上昇し、角膜上皮の分化が異常であり、角膜上皮幹細胞が有意に減少し、細胞増殖と幹細胞性も減少していることが分かりました。したがって、このモデルは、重度の炎症が辺縁系幹細胞に直接損傷を与えることなく、辺系幹細胞の損傷を誘発できることを示しています。このモデルは、幹細胞の生物学的メカニズムに対する重度の炎症の影響を観察するのに有益であり、炎症によって誘発される角膜上皮幹細胞の機能障害のメカニズムを研究するための理想的なプラットフォームを提供します。

概要

辺縁部幹細胞機能障害(LSCD)は、持続的な上皮欠損、角膜血管新生、慢性炎症、瘢痕化、および角膜の結膜化を特徴としています1,2。これは、化学熱傷、熱傷、スティーブンス・ジョンソン症候群、眼科手術による医原性損傷などの重度の眼表面疾患後の辺縁系幹細胞の枯渇または機能不全から生じる可能性があります2,3,4。LSCDの発症機序は、主に幹細胞の変化と幹細胞微小環境の乱れ5,6を伴い、角膜上皮の恒常性に影響を及ぼします2,7。LSCDの辺縁系幹細胞の運命変化には、主に2つのタイプがあります:1)角膜上皮幹細胞の方向分化電位が異常になり、皮膚上皮細胞への分化につながります。これは、角膜上皮細胞特異的転写因子Pax6および角膜特異的ケラチンKrt12およびKrt3の発現の減少、ならびに皮膚関連の扁平上皮化生マーカーKrt10、Krt1、およびSprr1bの発現の有意な増加によって証明されます8;2)眼表面損傷は、角膜辺縁幹細胞を直接破壊し、壊死またはアポトーシスを引き起こし、その結果、角膜を覆う結膜組織増殖を引き起こす9。LSCDの発生過程では、角膜上皮幹細胞の微小環境において、マクロファージ、好中球、樹状細胞などの炎症細胞が有意に増加することが報告されています。これに対応して、インターフェロン-γ(IFN)-γ、腫瘍壊死因子(TNF)-α、インターロイキン(IL)-1β、マクロファージ炎症性タンパク質(MIP)-1α/βなどのサイトカインも有意な上昇を示しています10。

縫合糸、化学的損傷、塩化ベンザルコニウムのスポッティング11によって誘発されるものなど、さまざまなLSCDモデルが確立されています。これらのモデルにはそれぞれ長所と短所があります。化学的損傷は、眼の表面全体を損傷し、辺縁系幹細胞を直接破壊する可能性があります12。塩化ベンザルコニウムは、化学的損傷と同様に機能しますが、効果は比較的遅いです13。角膜縫合モデルは、安定した長期的な炎症反応を誘発することができますが、炎症反応は比較的軽度であり、LSCDを引き起こすことはありません。

角膜LSCDの発症における炎症の役割とメカニズムを調べるために、角膜中央上皮の掻爬と角膜縫合糸を組み合わせた動物モデルを確立しました。このモデルは、辺系幹細胞に直接損傷を与えることなく、角膜上皮の持続的な炎症を誘発します。

プロトコル

すべての手順は、眼科および視覚研究における動物の使用に関するARVOガイドラインに準拠しており、貴州医科大学の動物倫理委員会によって承認されました(承認番号2305192)。ラットは貴州医科大学の動物センターに収容され、関連する動物管理規則を遵守しました。

1.動物の選択

  1. 7〜8週齢の雌のSprague-Dawley(SD)ラットを使用します。細隙灯検査で眼表面病変がないことを確認してください。
  2. 急速滅菌器を使用して器具を滅菌します。必要な器具には、角膜錆リングリムーバー、2mmサイズの皮膚サンプリングマーカー、ニードルホルダー、プレートレイヤーナイフ、眼科手術用ハサミ、鉗子などがあります。
  3. 体重100 gあたり0.3 mLの用量で腹腔内注射により、1.25%トリブロモエタノールでラットに麻酔をかけます。.つま先をつまんで麻酔の深さを評価します。瞳孔拡張のためのトロピカミド点眼薬を1滴点眼します。ブピバカイン塩酸塩点眼薬を目に塗布します。.対側の眼に眼の潤滑剤軟膏を使用して、水分を維持します。.
  4. 目の周りの皮膚と毛をヨードフォアで消毒します。
  5. 炎症モデルを確立します。
    1. ラットを外側の褥瘡の位置に置きます。眼球を手術用顕微鏡で露出させます。
    2. 角膜中央部は2mmサイズの皮膚サンプリングマーカーで標識し、標識した角膜中央部上皮部は角膜錆リング除去剤で掻き取りました。
    3. 10-0ナイロンワイヤー、ニードルホルダー、眼科用手術用ハサミと鉗子を使用して、3つの120°角膜縫合糸をリンバスから約3mmのところに配置し、角膜14,15を貫通しないようにします。
  6. 感染を防ぐために、手順の最後にオフロキサシン眼軟膏を塗布します。
  7. 術後 1日目、3日目、7 日目に 、スリット ランプ拡大 10 倍レンズを使用して角膜を観察し、撮影します。角膜上皮治癒、結膜充血、角膜浮腫、辺縁充血、角膜血管新生などの症状を記録します。

2.炎症指数の計算

  1. 動物モデルを確立した後、眼表面の炎症指数を計算します。
    1. 毛様体鬱血を次のようにスコアリングします:鬱血なし(0ポイント)。1 mm(1ポイント)未満の混雑の存在。1mmから2mm(2点)の間の充血;1 mmから2 mm(3ポイント)の充血。
    2. 角膜中央浮腫を次のようにスコアリングします:浮腫なし(0ポイント)。虹彩の視認性がはっきりしている浮腫(1ポイント)。虹彩の視界が不明瞭な浮腫(2点)。虹彩が見えない浮腫(3点)。
    3. 傍中心角膜浮腫を次のようにスコアリングします:浮腫なし(0ポイント)。虹彩の視認性がはっきりしている浮腫(1ポイント)。虹彩の視界が不明瞭な浮腫(2点)。虹彩が見えない浮腫(3点)。
    4. すべてのスコアを加算し、それを9で割ることにより、炎症指数を計算します。

3. 角膜新生血管の評価

  1. 角膜新生血管をスリットランプで観察します。
    1. スリットランプ画像処理ソフトウェアを使用して画像を分析および処理します16.
    2. 各観察時点での角膜血管新生の成長を記録し、角膜中央部への最長の角膜血管新生を最小限の湾曲で測定します。
    3. それらを次のように評価します:グレード0:無血管;グレード1:マイクロ(<1 mm);グレード2:マイルド(1 mmから1.5 mm);グレード3:中程度(>1.5 mmから2 mm);グレード4:重度(>2 mm)。

4. モデルの生物学の解析

  1. 凍結した眼の標本を準備します。
    1. ラットを4〜5%イソフルランで麻酔し、子宮頸部脱臼によって安楽死させます。
    2. 側褥瘡の位置で、マイクロピンセットでラットの眼球を外側に持ち上げ、アイハサミで上下のアイドームに沿って結膜を切り開きます。
    3. 角膜上皮の完全性を維持することに注意を払いながら、視神経を切断します。
    4. 眼球表面の血痕と水分を濾紙で乾燥させ、最適な切断温度(OCT)の包埋用剤で包埋箱に入れます。
    5. 200μLのピペットで包埋箱内の気泡を取り出し、液体窒素で凍結した後、埋入した検体を超低温冷凍機で保存します。
  2. 眼球の凍結部分を準備します。
    1. 凍結切片を調製する前に、クライオスタットを約-28°Cに、試料ホルダーを-26°Cに予冷します。
    2. 凍結した検体を冷凍庫から取り出し、クライオトームに約1時間置きます。
    3. 凍結した標本をクライオトームで10分間予冷します。試料に鉛筆で印をつけ、OCTで試料パッドに固定し、冷却後に切片ラックに一緒に固定します。
    4. 凍結した試料の位置と向きを調整し、固定します。まず、角膜中央が見えるまで20μm切片をカットします。次に、連続スライスにより6μmの切片を取得し、事前に調製した接着スライド上に切片を回収します。
    5. スライド上の組織の名前、材料、切片時間、名前、および番号をマークします。室温(RT)で約30分間置きます。
    6. 乾燥させた後、箱に入れて超低温冷凍機で保存します。
  3. ヘマトキシリンおよびエオシン染色を行います。
    1. あらかじめ準備した冷凍切片を超低温冷蔵庫から取り出し、RTのドラフトに入れて乾燥させます。
    2. 4%パラホルムアルデヒドを使用してRTで15分間切片を固定し、1x PBSで試料を5分間すすぎます。
    3. スライドを含む試料切片をスライドホルダーに置き、ヘマトキシリン色素溶液を入れた色素シリンダーに室温で5分間浸します。
    4. スライドを含む試料を水道水でゆっくりとすすぎ、浮遊染料を洗い流し、0.1%塩酸アルコールで染料タンクに入れ、1〜2秒後にすばやく取り除きます。
    5. 試験片を水道水で15分間ゆっくりとすすいでください。
    6. 標本を水から取り出し、スライドをエオシン色素タンクに浸します。RTで3分間放置します。
    7. 試料を水道水でゆっくりとすすぎ、余分な色素を洗い流し、アルコール75%、アルコール80%、アルコール95%、アルコール100%(1個)、アルコール100%(2個)を用いてグラジエントアルコール脱水を行います。各濃度の切片を2分間測定します。
    8. 試料をキシレン(1)とキシレン(2)でそれぞれ2分間透明にします。
    9. ヒュームフード内で試料を乾燥させ、シール剤で切片を密封し、気泡が出ないように注意してください。
    10. RTのスライドボックスにスライドを置き、顕微鏡を使用して切片を画像化します。
  4. 免疫蛍光染色を行います。
    1. 凍結した切片を取り出し、RTのヒュームフードの箱に入れて乾かします。
    2. 凍結検体のスライドガラスブランクに染色する抗体の名称を印をつけます。
    3. 試料を4%パラホルムアルデヒドで室温で15分間固定します。試料が乾燥するのを防ぐために、ボックスに少量の水道水が加えられました。
    4. パラホルムアルデヒド固定液を取り外し、1x PBSバッファーで試料を3回洗浄します。試料を洗い流さないように注意してください。
    5. 組織切片の周りの液体を乾燥させ、標本を細胞膜溶液(0.2% TritonX-100)で覆い、室温で20分間インキュベートします。
    6. 細胞膜溶液を取り出し、切片を1x PBSバッファーでそれぞれ5分間3回洗浄します。
    7. 組織切片を乾燥させ、試料を免疫蛍光ブロッキング溶液(2% BSA)で覆い、室温で1時間インキュベートします。
    8. インキュベーション中に一次抗体と希釈液(1% BSA)を調製し、製造元の指示に従ってください。
    9. ブロッキング液を取り除き、吸引ポンプで試料を乾燥させます。調製した一次抗体を添加し、箱に蓋をして、4°Cの冷蔵庫で一晩(約12〜16時間インキュベート)して光を避けてインキュベートします。
    10. 一次抗体を廃棄し、検体をPBSで4回、各10分間洗浄します。
    11. 洗浄ステップでは、製造元の指示に従って二次抗体希釈液を調製します。
    12. PBSを取り出し、検体を乾燥させ、調製した二次抗体を検体に加えます。試料を覆い、光から離れて室温で1時間インキュベートします。
    13. 二次抗体を取り出し、検体を1x PBSバッファーで4回、各10分間洗浄し、スライド全体を1x PBSバッファーで覆います。
    14. PBSを取り外し、試料を乾燥させ、DAPIを含む封入剤で切片を密封し、気泡がないことを確認します。スライドを錫箔で包み、光から4°C離して保管します。
    15. レーザー共焦点顕微鏡システムまたは直立型蛍光顕微鏡カメラシステム(スキャン速度:4μs/ピクセル、スキャン解像度:1024 x 1024)で写真を撮影します。
  5. ラット角膜上皮の単一細胞懸濁液調製
    1. 安楽死後、75%アルコールに浸したピンセットで眼球を取り出し、事前に準備した10%ウシ胎児血清(FBS)と10%ペニシリン-ストレプトマイシンを含む1xハンクス平衡塩溶液(HBSS)に入れます。
    2. 眼球をきれいにし、10%のFBSと10%のペニシリン-ストレプトマイシンを含む1x HBBSをそれぞれ5分間2回使用します。.
    3. 強膜縁に沿って結膜を取り除きます。強膜縁を約1mmのままにします。再度、10%FBSおよび10%ペニシリン-ストレプトマイシンを含む1x HBBSで角膜組織を2回洗浄する。
    4. 清潔な角膜組織を、2U / mLのディスパーゼIIを含むサプリメントのホルモン表皮培地(SHEM)に移します。.シールを閉じ、4°Cで14〜16時間置きます。
    5. ピンセット、歯なしピンセット、虹彩回復装置、外科用滅菌器を用意してください。
    6. 手術用顕微鏡で、角膜の縁に沿って角膜上皮をそっと分離します。
    7. 角膜上皮を10%ペニシリン-ストレプトマイシンを含む1x HBSSで5分間洗浄します。
    8. 角膜上皮組織を200 mLのトリプシンが入った1.5 mLの遠心チューブに移し、5% CO2、37 °Cのインキュベーターでインキュベートします。5分ごとに、遠心分離チューブを3回振って、角膜上皮シートを単一細胞懸濁液に消化します。
    9. 等量のSHEM培地を添加してトリプシン消化液の作用を止め、RTに置きます。
  6. 角膜上皮細胞のクローン培養
    1. 栄養膜細胞を調製します。
      1. NIH 3T3マウス細胞の増殖密度が80〜90%に達したら、細胞培養培地を廃棄します。調製済みの10 mg/mL NIH 3T3マイトマイシン培地を添加し、37°Cで2.5時間インキュベートします。
      2. 培地を取り出し、1x HBSSで細胞をすすぎ、新しいNIH 3T3細胞培地と交換し、CO2 インキュベーター(5% CO2、37°C)でインキュベーションを続けます。
    2. 角膜上皮細胞懸濁液を調製し、必要な比率に従って細胞をカウントします。
    3. 角膜上皮細胞懸濁液を調製しながら、マイトマイシンで処理したNIH 3T3細胞を処理します。
      1. 上清を捨て、1x HBSSで細胞をすすぎ、1mLのトリプシン-EDTA溶液を加え、室温で2〜3分間インキュベートします。
      2. 同量のサプリメントホルモン上皮培地(SHEM培地:DMEM / F12、10 ng / mLマウス上皮成長因子[EGF]、10 μg / mLインスリン-トランスフェリン-セレン[ITS]、5%FBS、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、0.5%ジメチルスルホキシド[DMSO]、0.5 mg / mLヒドロコルチゾン)を同量追加し、静かにピペットで細胞懸濁液を作成し、細胞をカウントします。.
    4. 12ウェルプレートを使用し、各ウェルに0.5 mLのSHEM培地を加えます。
    5. 角膜上皮細胞とNIH 3T3細胞を500角膜上皮細胞/cm2 および5 x 105 NIH 3T3細胞/cm2の密度で混合します。各ウェルに1 mLのSHEM培地を加えます。
    6. 各ウェルに1 mLの細胞混合物を加え、細胞を均等に分配するために静かにピペットで動かします。
    7. インキュベーター(5%CO2、37°C)でインキュベートし、2〜3日ごとに培地を交換します。12-14日間培養します。
  7. クリスタルバイオレット染色
    1. 約12日後、角膜上皮クローンが融合しそうになったら、培地を取り出し、各ウェルに4%パラホルムアルデヒド溶液1mLを加え、細胞を完全に覆います。細胞を室温で15分間固定します。
    2. 4%パラホルムアルデヒドを除去し、ウェルを1x PBSでそれぞれ5分間3回洗浄します。
    3. 1x PBSバッファーを取り外し、各ウェルに0.4%クリスタルバイオレット色素溶液を加えます。室温で30分間染色します。
    4. クリスタルバイオレット染料溶液を除去またはリサイクルし、1x PBSでそれぞれ10分間3回洗浄します。
    5. 完全に乾くまでRTでウェルを風乾します。
    6. 通常の直立顕微鏡撮影システムを使用します(スキャン速度:4μs/ピクセル、スキャン解像度:1024 x 1024)。
  8. 角膜mRNAの抽出
    1. 眼科用ハサミ、角膜ハサミ、歯付き鉗子、電気角膜上皮スクレーパー、トリゾール、RNaseフリー1.5mL遠心チューブ、アイスボックスを集めます。
    2. 上皮獲得
      1. ラットを4〜5%イソフルランで麻酔し、子宮頸部脱臼後に安楽死させます。動物を横向きの位置に置きます。マウスのひげをアイハサミでトリミングして、視界を遮らないようにします。
      2. ラットを手術用顕微鏡の下に置き、眼球に焦点を合わせるために適切な高さに調整します。歯付き鉗子を使用して、眼球をそっと押して露出させます。ラットの結膜を持ち上げ、清潔な電気角膜上皮スクレーパーを使用して、角膜上皮の中央2mm領域をこすります。
      3. 掻き取った角膜上皮を、アルコールを噴霧した清潔な歯付き鉗子で集めます。採取した組織を1mLのトリゾールが入った遠心チューブに入れます。
      4. できるだけ早く作業して、二重脱イオン水が入った50 mLの遠心チューブで収集した組織をすすぎます。濾紙で余分な水分を吸収します。75%アルコールをスプレーして、次のステップに進みます。
      5. 歯付き鉗子を使用してラットの結膜を再度持ち上げます。凹面を上にして角膜ハサミを使用して、輪部に沿って結膜を切断し、約0.5mmの白い結膜を残します。
      6. 角膜上皮を角膜リンバスの2mmの範囲内で電気スクレーパーを使用してこすります。前述のように組織を採取します。3つの眼球から角膜中央上皮を採取し、3つの眼球から辺縁上皮を採取します。
      7. 収集した組織を別々の1 mL Trizol RNA抽出試薬チューブに入れます。RNAの完全性を維持するために、氷上ですべての操作を実行します。すぐに次のステップに進むか、サンプルを-80°Cの超低温冷凍庫に保管して後で使用してください。
    3. 標本を氷上で解凍し、超音波組織ホモジナイザーを使用して細胞を溶解します。超音波ホモジナイザーの出力を25%、時間をバーストあたり2秒、インターバル時間を5秒、合計時間を2分に設定します。氷の上に10分間放置します。
    4. 各サンプルにクロロホルム(全容量の1/5、約200 μL)を添加し、30秒間反転させて十分に混合し、400 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
    5. RNA沈殿物
      1. 遠心分離後、遠心分離管内の液体は3つの部分に層状になります。上の透明な層はRNA、真ん中の白い曇った層はDNAとタンパク質、下の層はトリゾールです。上部の透明層の約500μLを新しい1.5 mL遠心チューブに慎重にピペットで移し、中間層の白い沈殿物を吸引しないように注意します。誤って吸引した場合は、遠心分離を繰り返して透明な層を再度収集します。
      2. 透明層を含む遠心分離チューブに等量の予冷したイソプロパノール(約500μL)を加え、チューブを数回反転させて十分に混合した後、すぐに-80°Cの超低温冷凍庫に20〜30分間置く。このステップは、RNAの沈殿を促進することを目的としています。
    6. サンプルを取り出し、すぐに400 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 遠心分離管の底に少量の白い薄片状の沈殿物が見られます。上清を捨てます。
    7. 事前に調製して氷冷した70%エタノールを各チューブに加えます。直ちに4°Cで400 x g の冷蔵遠心分離機で約10分間遠心分離します。上記の手順を一度繰り返して、沈殿物を完全に洗います。このステップでは、ヒュームフードをUVライトで15分間予備滅菌します。
    8. 遠心チューブを取り外し、上清を捨てた後、再び4°Cで約250 x g で2分間遠心分離します。200 μLのピペットチップを使用して、沈殿物の反対側から余分なアルコールを慎重に吸引し、できるだけ完全に乾燥させます。UV滅菌済みのドラフトに入れて乾燥させ、沈殿物を約15分間風乾します。
    9. 1 mLのRNase阻害剤を40 mLのジエチルピロカーボネート(DEPC)水に加えて溶液を調製します。適切な量のDEPC水/RNase阻害剤混合物(約20〜30μL)を加えて、サンプルを溶解します。沈殿物が多い場合は、30-50 μLを加え、すぐに逆転写PCRを進めてください。
  9. 逆転写PCR
    1. PCR装置、RNaseフリーの1.5 mL遠心チューブ、0.2 mLのPCRチューブ、アイスバスまたはアイスボックス、ピペット、RNaseフリーチップが揃っていることを確認してください。
    2. 微量分光光度計を使用してRNA濃度を測定します。各サンプルについて、1 μg の RNA が反応システムに添加されていることを確認してください。
    3. 逆転写システムの総容量は20μLで、サンプル数に基づいて必要な試薬の総量を計算します。指示で指定された比率に従って混合します。
    4. 氷上で反応系を調製し、ボルテックスして短時間遠心分離します。42°Cで15分間、90°Cで30秒間インキュベートします。
    5. 逆転写プロセスから得られたcDNAは、リアルタイムの定量PCR分析に直接使用するか、-80°Cの冷蔵庫で保存します。
  10. リアルタイム定量PCR反応
    1. 10 μLの反応システムを備えたリアルタイム定量PCR試薬キット17 を使用してください。 表1に示すプライマー配列を使用してください。
    2. 上記の反応システムをRT-PCR専用の96ウェルプレートまたは8ストリップチューブに加えます。サンプルが十分に混合されていることを確認してください。PCR装置にチューブを置く前に、チューブ内に気泡がないか確認してください。
    3. PCRサイクル(95°Cで5分間)、40サイクル(95°Cで10秒、60°Cで30秒)で遺伝子を増幅し、データを完成させて2-ΔΔCt値を算出します。適切なデータ分析ソフトウェアを使用して、データを処理、分析、およびプロットします。

結果

図1Aに示すように、細隙灯による観察により、角膜上皮の治癒が阻害されていることがわかりました。通常の状況では、角膜中央上皮は除去後24〜48時間以内に完全に治癒しますが、縫合モデルと組み合わせた角膜中央上皮切除では、新しい血管が存在し続けました。モデル確立後3日目には、顕著な角膜辺縁浮腫と血管新生が観察され、角膜辺縁系幹細胞欠損症の典型的な徴候が局所的に現れた。時間が経つにつれて、7日目になっても、治癒はまだ完全ではありませんでした。角膜炎症指数は、毛様体うっ血、角膜傍傍浮腫、および角膜中央浮腫を使用して評価されました。角膜浮腫は徐々に悪化し、角膜の炎症(図1A)は悪化し続けました。さらに、角膜新生血管は炎症の指標です。炎症の進行に伴い、角膜血管新生術(図1B)と炎症指数(図1C)は継続的な増加を示しました。

モデル作成から7日後に眼組織への凍結埋埋込みを行いました。ヘマトキシリンとエオシンの染色(図2A)では、辺縁部と角膜中央部で上皮が肥厚し、上皮配列が正常な形態を失い、非定型的な過形成が示されました。角膜間質は浮腫性に見え、炎症細胞の顕著な浸潤を伴いました。PMNおよびED1免疫蛍光染色(図2B)を使用すると、好中球およびマクロファージの浸潤の顕著な増加が観察されました。この研究では、IL-1β(図2C)とMIP-1α(図2D)を使用して炎症因子を評価し、IL-1βは3日目にピークに達し、その後徐々に減少する一方で、MIP-1αは時間の経過とともに継続的に増加することを発見しました。

慢性炎症は通常、Pax6のダウンレギュレーション、Krt12発現の低下、角膜上皮の扁平上皮化生など、一連の辺縁系幹細胞の欠損を引き起こします。本研究で開発したモデルが角膜上皮表現型にこれらの変化を誘発できるかどうかを検証するために、角膜上皮のKrt12(図3A)およびPax6(図3B)の免疫蛍光染色を行いました。Krt12の発現は炎症が長引くと減少し、7日目にはKrt12陽性細胞が1つだけ観察され、角膜上皮ではPax6の発現が有意に減少しました。mRNAレベルでは、正常な角膜上皮マーカーであるKrt12(図3C)およびPax6(図3D)の発現レベルは7日目に有意に減少しました。しかし、扁平上皮化生マーカーであるKrt10(図3E)とSprr1b(図3F)の発現レベルは、7日目に有意に増加しました。

増殖マーカーKi67を用いて角膜上皮を染色したところ、7日目までにKi67陽性角膜上皮細胞の数が有意に減少したことが示されました(図4A)。角膜上皮幹細胞の状態は、角膜辺縁系幹細胞特異的マーカーABCG2(図4B)および上皮前駆細胞マーカーP63(図4C)を用いて評価した。ABCG2およびP63のレベルは、正常グループのレベルよりも有意に低かった。さらに、幹細胞のゴールドスタンダードであるクローン培養法を用いて、この過程での角膜辺縁系幹細胞の変化を評価しました。角膜辺縁系幹細胞(図4D)のクローン形成速度は、3日目までに減少し、7日目までに大幅に減少し、クローンの平均面積は小さくなり、7日目には数個のホロクローンしか見えないことが観察されました。コロニー形成効率(CFE)は、培養皿の顕微鏡フィールドで見える細胞クローンをカウントすることによって得られました。CFE(図4E)は、炎症条件下で角膜辺縁系幹細胞の数が徐々に減少することを示しました。このことから、このモデルでは重度の炎症が角膜辺縁系上皮幹細胞の枯渇につながることが示唆されており、この過程は角膜辺系幹細胞の表現型転換を誘導するのではなく、分化や自己複製に問題をもたらすことが示唆されています。

この研究で使用された炎症モデルは、角膜への炎症細胞の広範な浸潤、角膜上皮の形成異常、正常な角膜上皮表現型におけるPax6およびKrt12の発現の中断または減少など、LSCDに特徴的な角膜変化をもたらしました。さらに、Krt10 mRNAの発現が有意に増加しました。要約すると、この実験モデルは、炎症によって誘発される角膜上皮幹細胞の異常な分化の研究に適しています。

figure-results-1
図1:炎症モデルの確立。 重度の炎症が角膜上皮幹細胞に及ぼす影響を研究するために、重度の炎症モデルが確立されました。(A)モデルを誘導した後、スリットランプ撮影により角膜を観察した。モデリングの3日後、ラットの角膜辺縁部は重度の浮腫性であり、角膜辺縁系幹細胞欠損症の典型的な徴候である明らかな血管新生と限局性過形成を伴いました。7日目までに角膜浮腫は徐々に悪化し、血管新生は成長し続けました。炎症の進行に伴い、(B)角膜新生血管術と(C)炎症指数が継続的に増加しました。*P < 0.05、****P < 0.0001。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:モデリング後の炎症反応。 モデルが角膜に誘導する炎症反応を評価しました。(A)眼球のヘマトキシリンとエオシンの染色は、炎症過程で、辺縁部と中央の角膜上皮の両方が肥厚し、角膜上皮の配置が正常な形態を失い、非定型過形成の兆候を示すことを示しました。(B)マクロファージマーカーED1(緑)と好中球マーカーPMN(赤)が有意に増加した。RT-qPCRでは、角膜上皮炎症因子(C)IL-1βおよび(D)MIP-1αの有意な上昇が示されました。青はDAPIによる核染色を表し、スケールバー= 50 μm。p < 0.001 です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-3
図3:炎症条件下での細胞の表現型の変化。 辺縁上皮における(A、赤)KRT12および(B)PAX6の免疫染色。(C)KRT12 mRNAの発現レベルは、炎症が進行するにつれて有意に減少します。(D)PAX6 mRNAの発現は、炎症条件下での辺縁上皮の異常な分布と顕著な減少を明らかにしています。逆に、炎症時には、(E)Krt10や異常に分化した角膜上皮マーカー(F)Sprr1bのmRNA発現が有意に増加します。青はDAPIによる核染色を表し、スケールバー= 50 μm。**p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-4
図4:炎症状態下での辺縁系幹細胞の変化。 (A, 赤) Ki67の免疫蛍光画像は、炎症誘発後の増殖細胞の変化を示しています。幹細胞マーカー(B)ABCG2のmRNA発現は大幅に減少します。前駆細胞マーカー(C)p63も発現しています。(D)クリスタルバイオレット染色画像および(E)CFEは、炎症条件下での辺縁系幹細胞の数の減少を示しています。青色はDAPIで染色された核を示します。スケールバーは50μmです。*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

プライマー名プライマー配列
TNF-aフォワード5'-TCAGTTCCATGGCCCAGAC-3'
逆5'-GTTGTCTTTGAGATCCATGCCATT-3'
IL-1βフォワード5'-CCTCGTCCTAAGTCACTCGC-3'
逆5'-GGCTGGTTCCACTAGGCTTTTT-3'
パックス6フォワード5'-GTGTTCAGTGCAGAGCCTTCTC-3'
逆5'-TTCACCGTTGCTGTTCACTG-3'
KRT12フォワード5'-AGCTAACGCGGAACTGGAAA-3'
逆5'-CTCTCCTCTCTTGGTGAGGT-3'
krt10のフォワード5'-TCCGGGATCTGGAAGAGTCAA-3'
逆5'-TTGGGTAAGCTTTTTGCTAAGTGGAA-3'
Sprr1bのフォワード5'-CCATCCCAAGGCACCTGAG-3'
逆5'-TGCTGGTATGGTGATGGAGT-3'
アクチンフォワード5'-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3'
逆5'-CCCATACCACACCCATCACC-3'

表1:定量的RT-PCRに使用したプライマーの配列。

ディスカッション

炎症は、辺縁系幹細胞欠損症の発症に重要な役割を果たしている18が、その特異的なメカニズムと影響については、さらなる調査が必要である。この問題に対処するために、角膜中央上皮を掻き取り、角膜中枢間質を縫合することでLSCDを誘導し、重度の角膜炎症を引き起こしました。角膜炎症の進展と辺縁系幹細胞の状態を、モデリング後1日目、3日目、7日目に観察しました。モデリング後3日目には、ラットの輪部の著しい浮腫、顕著な血管新生、および辺縁系幹細胞欠損症の典型的な特徴である局所組織増殖の増加が観察されました。7日目までに角膜浮腫はさらに悪化し、新しい血管の数は増加し続けました。RT-qPCRと免疫蛍光染色法により、モデリング後7日目に、マクロファージマーカーED1、好中球マーカーPMN、および角膜上皮中枢炎症因子MIP-1αおよびIL-1βの発現レベルが有意に上昇したことが観察されました。炎症の進行中、角膜上皮細胞特異的転写因子Pax6および角膜特異的ケラチンKrt12の免疫染色イメージングおよび関連するmRNA発現レベルは有意に低下しました。皮膚関連扁平上皮化生マーカーKrt10と角膜上皮マーカーSprr1bのmRNA発現は、炎症の進行中に増加し、異常な分化を示した。幹細胞マーカーABCG2のmRNA発現は有意に減少しました。前駆細胞マーカーp63も発現した。クリスタルバイオレット染色画像とCFEは、炎症条件下では、辺縁系幹細胞の数が減少することを示しました。包括的な解析の結果、モデリングの7日後には、角膜上皮の炎症因子が有意に増加し、角膜上皮の分化が異常であり、角膜上皮幹細胞の数が有意に減少し、細胞増殖能と幹細胞特性が低下したことが示されました。

このモデルは、辺縁系上皮幹細胞を直接損傷することなく角膜炎症を誘発し、角膜炎症が辺縁系上皮幹細胞に及ぼす影響とメカニズムの研究を促進します。角膜上皮を含む上皮組織では、幹細胞の再プログラミングが上皮の分化転換として現れます。このプロセスは炎症と密接に関連しており、微小環境19,20,21,22における種々のサイトカイン、成長因子、および他の可溶性因子によって誘発される異常な分化を特徴とする。炎症状態、特にドライアイ症候群や他の眼表面疾患23,24,26のような長期持続性の炎症状態では、角膜上皮は皮膚上皮に再プログラムされうるが、これは扁平上皮化生として知られる状態である。この移行には、角膜上皮特異的マーカーKrt12の弱体化または喪失が含まれ、Krt12は皮膚特異的マーカーKrt10およびSprr1bに置き換えられます27,28。このプロトコルに記載されているモデルは、同様の現象を示します。最初に、辺縁系幹細胞が活性化され、その後、持続的な炎症の下で、角膜上皮扁平上皮化生が起こります。角膜上皮には、Krt12とPax6の発現減少とKrt10とSprr1b(扁平上皮化生のマーカー)の発現増加を特徴とする典型的な扁平上皮細胞が観察されました。初期の炎症は角膜上皮の増殖を促進しましたが、後期の段階では増殖が減少しました。スティーブンス・ジョンソン症候群または先天性無虹彩症によって引き起こされるLSCDに関する研究でわかったことと一致して、辺縁系幹細胞マーカーABCG2と幹細胞を評価するためのゴールドスタンダードであるコロニー形成効率は大幅に低下しました。しかし、クローン細胞は成熟した角膜上皮細胞に分化する能力を保持していました。これまでの研究では、気液界面培養において角膜上皮の扁平上皮化生が観察されましたが、角膜上皮幹細胞は依然として正常な角膜上皮表現型に分化し、増殖能が増加する可能性を示しました。これは、現在の研究29と非常によく似ています。

したがって、このプロトコルで開発された研究モデルは、重度の炎症が辺縁幹細胞のニッチを直接損傷することなく、辺縁幹細胞に損傷を与える可能性があることを確認しています。この知見は、重篤な炎症が辺系幹細胞の生物学的メカニズムに及ぼす影響を観察するのに非常に有益であり、角膜炎症によって引き起こされるLSCDのメカニズムを研究するための理想的な実験プラットフォームを提供します。

ただし、このモデルには制限があります。麻酔をかけたラットは、角膜上皮の機械的掻爬とそれに続く角膜縫合を受けますが、これらはどちらも侵襲的な処置であり、術中および術後の感染のリスクが高い30。また、ラットの角膜は薄いため、縫合時に穿孔が発生しやすく、高いオペレーターの熟練度が求められます。

したがって、手順中に次の点に注意を払う必要があります:(i)清潔さと消毒:すべての器具は手術前に滅菌する必要があります。抗生物質点眼薬は、感染のリスクを減らすために、処置の前日と当日に投与する必要があります。角膜縫合糸は炎症や感染を引き起こす可能性のある異物であるため、厳格な無菌技術に従う必要があり、抗生物質の点眼薬を術後3日間続ける必要があります。(ii)ラット角膜の取り扱い:ラット角膜は比較的薄く、縫合中に穿孔しやすいです。歯付き鉗子を使用して結膜を縫合部位の反対側に保持し、眼球を安定させ、手術を容易にします。縫合糸は、角膜が厚く、穿孔しにくい角膜から約1.5〜2mmのところに縫合糸を配置し、輪部幹細胞への損傷を防ぎます。(iii)角膜上皮の除去:角膜トレフィンと角膜上皮スクレーパーは、角膜上皮をすばやく除去でき、操作も簡単ですが、非常に鋭利で、間質を損傷したり、穿孔を引き起こしたりする可能性があります。ミシン目を防ぐために、除去中の力の強さを制御します。除去領域の均一性を確保するために、角膜上皮を切除する前に、円形マーカーを使用して領域をマークします。

開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

この研究は、貴州省科学技術プロジェクト(QKHJC-ZK[2024]ZD043)、福建省著名な若手学者のための科学基金(2023J06053 [SOへ])によって部分的に支援されました。中国自然科学基金会(No.82101084[SOへ]および中国奨学金評議会（CSC、202306310049[YWへ])。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10-0縫合ラインAlcon, Inc., USA8065698001
2 mm 角膜トレフィンSuzhou XVI Vision Company, Chinahttp://www.66vision.com/
20 μL、100 μL、1 mLピペットガンヘッド、細胞培養プレート、培養プレート、遠心チューブ広州Jiete Biological Co.、Ltd.、中国https://www.jetbiofil.com/index.html-20
/ -80 >C冷蔵庫青島ハイアールカンパニー、中国https://www.haier.com/cn/
A 10 mLシリンジ 浙江コンデライ医療機器有限公司、中国https://en.kdlchina.com/zhejiang/25.html
スライドShiTai Company188105
。マックリン生化学、中国http://www.macklin.cn/products/
抗サイトケルチンアブカム、英国ab76318
抗ケラチン12抗体 EPR17882アブカム、英国ab185627
抗PAX6抗体アブカム、英国ab195045
アンチストリッピングスライド、カバースリップ江蘇泰実験装置有限公司、中国https://cn.citotest.com/
オートクレーブ平山、日本https://hirayama.com.cn/about/
アバーティン上海アラジン生化学技術、中国https://www.aladdin-e.com/zh_cn/A111225.html
クロロホルム上海生物工学有限公司、中国https://www.siobp.com/web
CO2オーブンインキュベーター、超音波破砕機、遠心分離機Thermo Fisher Technologies Inc., USAhttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
共焦点顕微鏡Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Co., Ltd.,https://www.clinx.cn/about
角膜上皮鉗子蘇州XVI Vision Company, 中国53418D
DAPIVector. Inc., USAH-1000
DEPC水 Shanghai Biological Engineering Co., Ltd., Chinahttps://www.siobp.com/web
Dicuro eye cream(オフロキサシンアイクリーム)Santian Pharmaceutical Corporation, Japanhttps://www.santen.com/asia
D-KSFM, culture medium, double antibody, and PBSThermo Fisher Scientific, Inc., USAhttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
ED1AbD Serote c, United 
電子天秤上海 Ohaus バイオテクノロジー カンパニー、中国http://shbio.com/company
Parafilm, Inc., 米国の筐体https://www.sigmaaldrich.cn
フルオレセインナトリウム テスト ストリップは、眼科 天津 Jingming New Technology Development Co., Ltd., Ltd., 中国https://www.eworldtrade.com/c/jingmingtechnological/
蛍光逆位相差顕微鏡法システムTE-2000U, ニコン, 日本https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-te2000-inverted-microscope
冷凍卓上遠心分離機ドイツ, エッペンドルフ,https://www.eppendorf.sh.cn 
ガラスシートフレーム厦門天京バイオテクノロジー株式会社、中国http://www.tagene.net/
H-1200、DAPIシール剤付き厦門ジュインバイオテクノロジー株式会社、中国https://www.bosonbio.com.cn/
HE染色キットAuragene、中国http://jushengwu.com/a048/
ヘマトキシリン-エオシン染料溶液キットAURAGEN、米国P032IH
高および低精密電子天秤Sdolis、ドイツhttps://www.solisinverters.com/global
IsopropanolShanghai Sinopharm Chemical Reagents Co., Ltd., Chinahttps://en.reagent.com.cn/
Ki-67抗体アブカム、英国ab16667
液体窒素厦門Yidongガス株式会社、中国https://www.china.tdk.com.cn/tdk_chn_en/tdk_xiamen/
マイクロハンドホルダー蘇州XVIビジョンカンパニー、中国http://www.66vision.com/
マルチホルムアルデヒド粉末Sigm、アメリカhttps://www.sigmaaldrich.cn
常温遠心分離機 46エッペンドルフ、ドイツhttps://www.thermofisher.cn
OCT 上海茂康Biotechnology Co., Ltd., China4583
Ordinary biological Micrographic SystemEclipse 50i, Nikon, Japanhttps://www.microscope.healthcare.nikon.com/zh_CN/products/upright-microscopes/eclipse-ni-series
PBSShanghai Anjin Biotechnology Co., Ltd, ChinaSH30256.01
PCR, and the reactorBiometra Thermocycler, Germany.https://www.analytik-jena.com/products/life-science/pcr-qpcr-thermal-cycler/thermal-cycler-pcr/biometra-tone-series/
さまざまな仕様のピペットEppendorf Company, Germanyhttps://www.eppendorf.com/cn-zh/
Primers for Rt-PCRShanghai Bio-Tech Co., Ltd.
Promeaine hydrochloride 0.5% 点眼薬Alcon, Inc., USAhttps://www.alcon.com/about-us
Rat PMN antibodyFitzgerald, UnitedStates 20R-PR020
リアルタイム蛍光定量 PCR応用バイオシステムズ, United Stateshttps://www.thermofisher.cn
Reverse transcription kitTAKARA, Japanhttps://www.takarabiomed.com.cn/
スリットランプTOPCON, Japanhttps://topconchina.cn/
Smooth forcepsSuzhou XVI Vision Company, Chinahttp://www.66vision.com/
Specimen-boxLambolid (Fuzhou) Biotechnology Co., Ltd., Chinahttp://chuangdianbio.com/
Superclean benchNew Plus Pi Art High Technology Company Limited, Singaporehttps://www.hi-p.com/
Toothed ForcepsSuzhou XVI Vision Company, Chinahttp://www.66vision.com/
Toppicamide eye drops (Medol)Alcon, Inc., USAhttps://www.alcon.com/about-us
Trace nucleic acid protein濃度試験Thermo Fisher Technologies Inc., USAhttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
TrizolInvitrogen The United Stateshttps://www.fishersci.com/us/en/brands/IIAM0WMR/invitrogen.html
Zeiss, with a surgical microscopeCarl ZEIS, Germanyhttps://www.zeiss.com/corporate/en/about-zeiss.html
アミレンアルコール上海の付着します KingdomMCA341GA膜 apparatus 器

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