方法論記事

従属栄養酵母と光合成糖分泌シアノバクテリアを組み合わせた共培養物の組み立てと定量化

DOI：

10.3791/67311

⸱

2024年12月27日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Synthetic Microbiology, Heinrich Heine University Düsseldorf, 2Institute of Microbiology, Heinrich Heine University Düsseldorf, 3Department of Microbiology, Genetics, & Immunology, Michigan State University, 4Computational Life Science, Department of Biology, RWTH Aachen University, 5Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコールは、光独立栄養糖分泌シアノバクテリアや従属栄養酵母などの共培養のセットアップと定量的モニタリングのための包括的なガイドラインを提供します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

持続可能なバイオテクノロジーに対する需要が高まる中、太陽光駆動型バイオプロダクションの方法として、光合成微生物と従属栄養パートナー種を含む混合コンソーシアムが研究されています。1つのアプローチでは、有機炭素を分泌して共培養従属栄養生物の代謝をサポートするCO2固定シアノバクテリアを使用し、その結果、炭素をより価値の高い商品やサービスに変換します。このプロトコルでは、モデル酵母種に代表されるように、ショ糖分泌性シアノバクテリア株と真菌パートナー(複数可)を組み合わせた共培養の確立において実験者を支援するための技術的説明が提供されます。このプロトコルでは、培地組成の定義、個々のパートナーの成長特性のモニタリング、および同じ成長容器に複数の種が組み合わされた混合培養の分析など、共培養を確立するための主要な前提条件が説明されています。顕微鏡法、セルカウンター、シングルセルフローサイトメトリーなど、共培養モニタリングのための基本的なラボ技術をまとめ、FAIR(Findable, Accessible, Interoperable, Reusable)の原則に沿った生フローサイトメトリー標準(FCS)ファイルのデータ解析に使用する非独占的なソフトウェアの例を提供します。最後に、糖分泌シアノバクテリアと新しい従属栄養パートナーとの共培養を確立しようとするときに頻繁に遭遇するボトルネックと落とし穴についての解説が含まれています。このプロトコルは、シアノバクテリアと従属栄養微生物を含む新しい共培養微生物のペアを確立しようとする研究者にリソースを提供します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

近年のゲノムツールとDNA技術の急速な拡大に伴い、バイオエンジニアリングの取り組みでは、無菌培養だけに焦点を当てるのではなく、微生物の混合コミュニティをバイオプロダクション戦略の実行可能と見なすことがますます可能になっています。微生物コンソーシアムは、単一種培養と比較して、専門化と分業、適応性と堅牢性、基質利用の効率性など、複数の潜在的な利点を持っています1。しかし、複数種コンソーシアムの予測可能なエンジニアリングは、種間の相互作用から生じる高次の振る舞いによって引き起こされる不確実性によって複雑になります2。種間シグナル伝達と代謝物交換は、分業の原則の中心にありますが、コンソーシアム3の参加者間で予期しない相乗効果と対立も引き起こします。混合微生物コンソーシアムの可能性を最大限に引き出すためには、柔軟な2パートナーおよび3パートナーの共培養プラットフォームの使用を含め、この分野での大幅な開発が必要です。これには、「ボトムアップ」から微生物の相互作用をより良く特徴付け、理解するために使用できるプラットフォームが含まれます。

現在、この分野では、補完的な補助栄養パートナーや、幅広い微生物種に一般的に有益な代謝物を分泌する微生物など、いくつかの主要なタイプの共培養プラットフォームが使用されています。後者のカテゴリーでは、シアノバクテリアは、代謝が容易な炭水化物の分泌につながる経路の導入を通じて、強化された一次生産者になるように操作されており、現在、合理的に設計されたさまざまなコンソーシアムで研究されています。簡単に言えば、このような遺伝子操作された微生物群集では、シアノバクテリアのパートナーは光とCO2 を主要なインプットとして利用することができ、酸素光合成のプロセスを通じて、これらの菌株は公共財として中央の炭素糖を分泌することができます。このような遺伝子操作されたシアノバクテリア株の1つのクラスは、二糖類のスクロース4を分泌するように操作されたものです。スクロースは多くの種で中枢炭素代謝に近い代謝物であり、また、さまざまな環境非生物的ストレスに適応するためのいわゆる「適合溶質」として頻繁に過剰蓄積されるため、このような菌株は成功を享受している可能性があります5。最小限の遺伝的介入で、さまざまなシアノバクテリアモデル生物に効率的なショ糖分泌をもたらすことができます4。

スクロース分泌シアノバクテリアは、幅広い従属栄養種が炭素とエネルギーの主要な供給源としてスクロースを代謝できるため、合理的に設計された微生物コンソーシアムの研究に有用なプラットフォームです。実際、ショ糖分泌能力を持つ少数のモデルシアノバクテリアを利用して、多くの研究室では、1つ以上の従属栄養微生物を含み、最終的には有機炭素原料を補給することなく光とCO2 の主要な入力によって支えられる混合種の共培養とコンソーシアムを合理的に設計しています4.従属栄養株は、シアノバクテリア由来の炭水化物を単に生存させる場合もあれば、ショ糖原料をより価値の高いバイオ製品(燃料、ポリマー、顔料など)に変換するために利用される場合もあります。このような単純な共培養は、持続可能なバイオプロダクションの潜在的な戦略であるだけでなく、無関係な微生物種間の創発的な相互作用を調査するためのプラットフォームとしても役立つ可能性があります。

このビデオ記事では、糖を生産するシアノバクテリアを柔軟なプラットフォームとして利用し、軽量で無機的な炭素の添加量のみを補うことで安定する単純な微生物コンソーシアムを設計するための方法論と前提条件に焦点を当てています。単一の確立された微生物を含む培養のセットアップとモニタリングは、ほとんどが簡単で、光学密度(OD)または後方散乱法を使用して簡単に達成できますが、2つ以上の生物が1つの容器に組み合わされると、これは実現できません。主な理由は、これらの方法では異なる微生物を区別できないため、培養の全体像を提供するだけで、個々の生物の成長を解決しないことです。さらに、シアノバクテリアは400〜750 nmの範囲に広い吸収スペクトルを持っているため、従属栄養生物のOD600 を測定すると、フィコシアニン(620 nmで吸収する)による誤った結果につながります。したがって、実験室内でのシアノバクテリア-従属栄養生物混合コミュニティのセットアップのための特定のプロトコル、およびこれらのコンソーシアムの経時的なパフォーマンスの分析のための有用な汎用プロトコルが提供されます。プロトコルは、モデル、スクロース分泌シアノバクテリア種と1つ以上のモデル従属栄養微生物との特定のペアリングに焦点を当てていますが、この作業の目的は、新しい種の組み合わせを設計し、そのような培養の確立のための最適化フェーズを加速したい研究者にリソースを提供することです。したがって、種固有のプロトコルに加えて、読者のニーズによって定義されるカスタムコミュニティに対してこれらのプロトコルを適応させ一般化するために使用できる情報と戦略が含まれています。

本明細書に記載の共培養プラットフォームの柔軟性のために、糖分泌シアノバクテリアとの共培養において以前に報告されている多数の異なる従属栄養種についてのプロトコルが記載されている。例えば、 Synechococcus elongatus PCC 7942と一般的な実験室酵母 Saccharomyces cerevisiae との共培養のための段階的なプロトコルが提供されています。しかし、この記事には、 Ustilago maydisの酵母型を含む他のモデル種を含む共培養の性能をアッセイするのに適したプロトコルも含まれています。

この記事では、シアノバクテリア/従属栄養共培養を確立し、これらの混合コンソーシアムの経時的なパフォーマンスの基本的な特性評価を実行するために必要なプロトコルのコアセットに焦点を当てています。具体的には、異なる種の正確なセンサスを行うのに適したシングルセルフローサイトメトリーと粒子計数法、および細胞形態を評価するための顕微鏡アプローチが強調されています。これらのプロトコルは、利用可能なニーズと機器に適応するための基礎として機能することを目的としています。重要なことは、ラボ内での共培養の確立とモニタリングに重要なテクニカルノートやその他の考慮事項が提供されていることです。最後に、Pythonパッケージを使用した生のFCS6 ファイルのデータ分析のための非独占的な代替手段の例が含まれています。要約すると、目標は、シアノバクテリアベースの共培養技術を、より幅広い科学的な聴衆にとってより利用しやすいものにすることです。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注:このプロトコルには、糖分泌性 S. elongatus および従属栄養モデル酵母種の共培養をセットアップし定量する方法に関する詳細な説明が含まれています。一般に、このプロトコルは、遺伝子操作に適した任意の酵母種に適用できます。

1. 光合成シアノバクテリアと従属栄養酵母を組み合わせた共培養の確立

  1. 共培養の準備:培地と予備培養
    注:すべての培地とストック溶液は、超純水を使用して調製します。すべてのガラス器具(計量ビーカー、メスシリンダー、保存ボトル、栽培フラスコ)は、洗浄してオートクレーブする必要があります。滅菌培地は室温(RT)で保存できます。光独立栄養培養の要件に適合するデバイスが利用可能である必要があります。
    1. 共培養を開始する予定の少なくとも3〜4日前に共培養培地を準備します。ほとんどの共培養培地レシピは、多くのシアノバクテリアモデル種のルーチン培養に利用される一般的なBG-11培地7 のバリエーションです。このプロトコルでは、以前に報告されたCoYBG-11培地を例として使用します(8; 表 1 を参照)。必要に応じて、調製した培地をオートクレーブ(121°C、20分)またはフィルター滅菌(0.22μmの細孔サイズ)します。
      注:他の種の組み合わせに適した培地を適応させるための提案については、ディスカッションのセクションを参照してください。
    2. 分子試薬の調製:cscB発現およびスクロース輸送9,10,11の誘導のために、イソプロピル-β-チオガラクトシド(IPTG)の1 Mストックを調製します。
      注:共培養中の抗生物質の使用は最適ではありませんが、すべての菌株が耐性のあるカセットを持っている場合は、それらを使用できます。その場合は、採用した菌株のニーズに応じて抗生物質のストックを準備してください。
    3. シアノバクテリウムのプレカルチャーの準備:共培養の開始の少なくとも3日前に、BG-11培地で増殖しているシアノバクテリアの糖分泌株のプレカルチャーから、CoYBG-11 培地を含む新鮮なバッフルフラスコに細胞を移します(表1)。
      注:シアノバクテリアの複数の種と菌株が、糖を分泌するように改変されました。この記事の執筆時点で入手可能な株の包括的なレビューについては、4.この参考文献には、シアノバクテリアの共培養が以前に報告されている従属栄養種(1.1.4を参照)もリストされています。
      1. プレカルチャーのOD750を測定します。目標 OD750 を 0.3 (C1) にするための必要前培養量を、式 V1 = C2 x V2/C1 (C2 = 目標 OD、V2 = 目標量、V1 = 必要前培養量) を使用して計算します。例えば、30mLの培養液(V2)を接種する場合、使用する液体培養液の量xはV1(mL)=(0.3×30)/(測定されたOD750)です。
        注:光学密度は細胞密度の近似値であり、成長条件と細胞形態に依存します。したがって、研究者は、共培養の性能を適切に評価するために、光学密度を細胞の絶対数に関連付ける方法(セクション2.1、2.2、および2.3を参照)を使用する必要があります。シアノバクテリアの場合、光合成活性スペクトル内の光波長(すなわち、400〜700 nm)は、クロロフィルや他の色素に吸収されるため、光学密度の決定に使用しないでください。そのため、遠赤外波長(750nmなど)が日常的に使用されています。
      2. 希釈した培養物を適切なフォトインキュベーターでインキュベートします。典型的なインキュベーション
        モデルシアノバクテリアの条件は、30°C、150rpm(25mmスロー)、2%CO2 ヘッドスペース、~200μmol光子M-2・S-1LED 照明、湿度75%です。
        注:放出されるスクロースの量を最適化するために、CO2 の補給を強くお勧めします。
      3. 共培養を設定する前に、この希釈プロセスを少なくとも3日間毎日繰り返して、シアノバクテリアが指数関数的に増殖していることを確認します。これにより、異なる日の実験間での共培養パフォーマンスの一貫性が向上します。
    4. 共培養の開始の少なくとも2日前に、従属栄養前培養を準備します。前述したように、多くの酵母種および亜株が以前にシアノバクテリア8,12,13との共培養で増殖してきた。
      1. 濃厚な培養ブロス( 表1を参照)で増殖する従属栄養種の液体培養液から1:100希釈(250μL)の細胞を、250 mLのバッフルフラスコに20 g/Lのスクロースを添加した50 mLのCoYBG-11 培地に移します。
      2. シアノバクテリアパートナーに使用した培養条件と同じ温度で一晩インキュベートします。
    5. 共培養の接種予定時刻の少なくとも24時間前にOD600 をチェックして、従属栄養株が実験的ニーズに対して十分に成長したことを確認します(1.2を参照):必要に応じて指数関数的な成長を維持するために新鮮な培地で希釈します。
  2. 共培養接種とメンテナンス
    注:光栄養微生物と従属栄養微生物との間の接種率に関する考慮事項については、ディスカッションセクションを参照してください。
    1. 共培養の接種については、遠心分離により両方のプレカルチャーを濃縮します。
      1. 濃縮細胞懸濁液の量を計算して、標準的なC1 x V1 = C2 x V2の式(C1 = 濃縮培養のOD)を使用して、両方の種で所望の開始密度を達成します。例えば、開始OD750が0.5のS.elongatus(1.5OD無軸培養から)および開始OD0.05のS.cerevisiae(0.7OD無軸培養から)の25mLの培養を行うには、上記の式に基づいて、8.33mLのS.elongatus開始培養物、1.79mLの濃縮従属栄養培養物が必要であり、 14.88 mLのCoYBG-11培地。
      2. 13,000 x g を使用して、RTで10分間培養物を遠心分離します。無菌条件下で、上清をデカントして廃棄します。
        注:S. elongatusと比較してより大きな細胞(2x-3x倍)であるため、S. cerevisiaeをペレット化するために使用できる相対遠心力(RCF; xg)が少ないですが、上清が透明になることに注意してください。シアノバクテリアバイオマスの回収には、13,000 x g未満でも使用できますが、遠心分離にはより長い時間が必要になります(たとえば、4,000 x gを20分間使用できます)。
      3. シアノバクテリアペレットを25 mLの滅菌CoYBG-11 培地に再懸濁します。以前と同じ遠心分離条件を使用し、その後、上清を廃棄してデカントします。
      4. このプロセスをS. elongatusに対して2回、S. cerevisiaeに対してさらに4回繰り返します。
        注:シアノバクテリアと従属栄養生物(S.cerevisiae)のペレットを洗浄して、残留培地成分を除去することが重要です。 S. cerevisiae は以前、ショ糖の存在下で増殖していたため、洗浄ステップの量を増やすことで、残留可能な糖を確実に除去することができます。
      5. ODが確認されたら、無菌条件下で S.elongatus と S.cerevisiae の容量を250 mLのバッフルフラスコに組み合わせ、CoYBG-11 を最終容量の50 mLまで追加します。事前に調製した1 MのIPTGストックから最終濃度1 mMに希釈します(これは、シアノバクテリアがスクロースを培地に輸出するように誘導するためです)。50 mLの培養には、1 M IPTGストックから50 μLを使用します。
        注:バッフルフラスコは、シアノバクテリアの通気と混合が優れているため、通常は優れています。
      6. 前のステップのフラスコを200 μmolの光子・m-2・s-1 LED照明に2% CO2 を添加し、30°Cで150 rpm(25 mmスロー)で軌道振とうを行い、湿度75%で加熱します。
        注:上記の条件は異なる場合があり、実験結果に基づいて最適化する必要があります。
      7. 12時間または24時間ごとに滅菌サンプリング(1 mL)することにより、培養物の成長をモニターします(セクション2を参照)。オプションで、サンプルを使用して標準的な生細胞顕微鏡検査を行い、適切な培地で酵母細胞のコロニー形成単位(CFU14)を決定して、細胞の形態と適応度を追跡し、生きた従属栄養細胞の量と汚染を監視します。
        注:CFUは、液体培地から固体培地への培養移行において大きなストレスを受ける可能性のあるシアノバクテリア種の正確な細胞密度をモニタリングする方法としては推奨されません。したがって、酵母抽出物ペプトンデキストロース(YEPD)15など、酵母パートナー種の増殖に適した濃厚培地を備えた寒天プレートを選択する必要があります。
化合物BG-11(濃度mg/L)CoY BG-11 (濃度 mg/L)
ナノ315001500
K2HPO44040
MgSO4・7H2O7575
CaCl2 ·2時間2分3636
クエン酸66
クエン酸第二鉄アンモニウム66
EDTA(二ナトリウム塩)11
Na2CO32020
微量金属組成
H3BO32.862.86
ZnSO4・7H2O0.2220.222
Co(NO3)2 ·6H2O0.04940.0494
MnCl2·4H2O1.811.81
CuSO4 ·5H2O0.0790.079
NaMoO4・2H2O0.390.39
余分な
ヘップソ71607160
酵母窒素塩基(YNB)、アミノ酸なし、硫酸アンモニウムなし–3608、120013
pH 8.3滴定剤島島
KPOの3–118
ショ糖(従属栄養生物のみ)–13690

表1:BG-11とCoYBG-11のメディア組成。CoYBG-11の酵母-窒素塩基濃度は、公開されたリソース8,12,13から得られます。

2. 共培養の成長を監視するためのツールと方法論

注:このプロトコールは、顕微鏡検査やカウンティングチャンバーのような単純だが手間のかかる技術から、パーティクルカウンターやシングルセルフローサイトメトリーなどのハイスループットアプリケーションまで、共培養分析とモニタリングのガイドラインです。実際の共培養とは別に、包括的な分析を可能にするために、単一の微生物の無酸素培養を含めることをお勧めします。分析の一般的な開始点として、カルチャの OD を決定します。このセクションでは、細胞密度の相対的な測定値(ODなど)を体積あたりの細胞数の絶対値に変換するために使用できるさまざまな方法論について詳しく説明します。OD750 測定は、シアノバクテリア培養物の細胞密度を決定するためによく使用されます(400〜700 nmの波長の吸収による)、OD600 は従属栄養生物に使用されます。どちらの測定値も、任意の単位で近似ガイド値を提供します。値は商品間で大きく異なる場合があることに注意してください。

  1. 計数チャンバーによる顕微鏡定量
    注:カウンティングチャンバー(すなわち、ノイバウアー(改良)/血球計算盤)は、形態学的に容易に区別できる細胞で構成される共培養物の組成を決定するためのシンプルで安価な手段です。 i.e.、セルの形状(図1A).厚手のガラス製顕微鏡スライドとカバーガラスで構成されています。カバーガラスがスライドの上に正しく配置されている場合、グリッドが刻まれた2つの精密ボリュームチャンバーが作成されます(図1B-D).グリッドの定義された領域をカウントすることにより、懸濁液の細胞濃度を計算できます。計数室は、さまざまな深さで利用できます。セルの厚さに応じて、適切なチャンバーの深さを選択する必要があります。真菌細胞の場合、 U. maydis 又は S. cerevisiae, 深さは0.1mmが適しています。このチャンバーの深さは、シアノバクテリアなどの小さな細胞には大きすぎ、細胞はチャンバー内に浮いています。深さ0.02mmのチャンバーは、シアノバクテリアとシアノバクテリアと真菌の共培養の両方に適しています。
    1. 計数チャンバーとカバーガラスにほこりやセルがないことを確認してください。
      注:使用直前に70%(v / v)エタノールと糸くずの出ないティッシュで洗浄することをお勧めします。
    2. カバーガラスを正しく配置するには、少し力を入れて2つのサポートバーにスライドさせますが、破損しないように注意してください。
      注:このアプリケーションには、特定の厚いカバーガラスが必要です(チャンバーのマニュアルを参照)。組み立て途中でカバーガラスが割れることもあるので、交換品が手元にあると良いでしょう。
    3. カバーガラスが適切に配置されたら、2つのガラス表面の間にあるいわゆるニュートンリング(図1B)を観察し、カバーガラスが滑りなくなったことを確認します。
      注意: 組み立て前にカバーガラスに優しく息を吹きかけると、多くの場合、結果が改善されます。
    4. 細胞懸濁液を完全に混合し、細胞懸濁液の数マイクロリットル(チャンバーの深さに応じて~2〜10μL)をチャンバーの端に塗布し、毛細管現象の力で完全に充填させます。細胞懸濁液の適切な希釈を使用して、信頼性の高いカウントを可能にします(例えば、大きな正方形あたり20〜200個の細胞が得られます(図1D、赤い長方形)。
    5. 光学顕微鏡の適切な(例:10倍)対物レンズ(明視野または位相コントラストモード)を使用し、計数チャンバーのグリッド線に焦点を合わせます。向きはグリッドによって提供されます。指定されたセルサイズに適した正方形のセルを数え始めます。
      注:ハンドヘルドカウンターやカウント用の適切なスマートフォンアプリケーションなどの技術支援を使用します(たとえば、一般的な「モノカウンター」や非常に便利な機能を提供する専用の血球計算盤アプリ)。グリッドの境界にあるセルをカウントするルールを定義して、二重カウントを回避します。たとえば、各正方形の上端と左端にあるセルは、右端と下端のセルを除外してカウントできます。代替ルールが存在する16.蛍光顕微鏡を使用すると、自家蛍光マーカーまたは蛍光マーカーに基づいて細胞を区別することもできます。
    6. たとえば、角にある4つの大きな正方形すべてを数えた後、各セルタイプの平均値を決定します。これらの平均値を使用して、利用された正方形の面積と特定のチャンバーの深さ(メーカーの情報を参照)により、細胞濃度が計算されます( 代表的な結果を参照)。
      注:セルサイズによっては、カウントに異なる正方形を使用できます。酵母細胞とシアノバクテリア細胞の場合、角にある4つの大きな正方形がうまく機能しています(図1D、赤い長方形)。
    7. 使用後は、サンプルの要件を考慮してチャンバーを洗浄してください(例:遺伝子組み換え生物を適切に不活化してください)。
  2. パーティクルカウンターを用いた定量
    注:共培養中の細胞の特性に応じて、パーティクルカウンターを適用してパートナーの細胞番号を決定することができます。この方法を適用するためには、細胞のサイズが大きく異なる必要があります。例えば、細菌細胞と酵母細胞の識別が達成できる。コンソーシアムの単一微生物の無菌培養物は、結果の解釈を可能にするために含める必要があります。同程度のサイズまたは2つ以上のパートナーを持つ細胞を含む共培養物は、セクション2.1または2.3に記載されている方法で分析する必要があります。
    1. 準備
      1. 培養物の外径を0.1に調整し、サンプルを等張測定バッファー(デバイスのマニュアルを参照)で合計10mLに1,000倍に希釈します。すべてのサンプルのテクニカルトリプリケートを準備します。
      2. 実験に適したキャピラリーの細孔サイズを選択します。
        注:細孔サイズは、共培養中の最小の細胞の範囲内にある必要がありますが、より大きな細胞も含める必要があります。細胞分裂によって細胞の凝集により毛穴が詰まる可能性があるため、小さくしすぎないように注意してください。使用可能な孔径は異なります。例えば、45 μmの毛細血管は、直径0.7 μmの細胞を検出し始めます(U. maydis and S. cerevisiae 3.5 μm-5.5 μm, S. elongatus/Synechocystis sp. ~1-2.5 μm)。
    2. パーティクルカウンター内の細胞の定量化
      1. デバイスを起動します。最終的には、品質管理のためのセルフテストを実行します(特定のデバイスのマニュアルを参照してください)。
      2. サンプルカップにサンプルをセットし、蓋を固定し、カップを少し傾けてサンプルを混合します。
        注意: 泡立ちや気泡を避けてください。測定ごとに常に1つのカップを使用してください。カップは何度も洗浄して再利用できます。除去できない残留物がある場合は、カップを廃棄します。サンプルがカップに長時間留まる場合は、測定する前に再度混合してください。
      3. 細胞凝集体が単一細胞よりも大きい可能性があるため、0〜30μmの範囲で記録します。
        注:まず、共培養パートナーのそれぞれの無酸素培養物を使用して、細胞のサイズを把握し、サイズによって区別できるかどうかを判断します。
      4. 評価後、同じ方法で共培養の組成を決定します。
  3. シングルセルフローサイトメトリーを用いたコンソーシアム定量
    注:シングルセルフローサイトメトリーは、共培養中の個々のパートナーの細胞数を決定するために採用できるハイスループット法であり、パートナーはサイズ/その光散乱特性または/および蛍光によって識別できる。重要なことは、メソッドの確立のためには、共培養パートナーの無菌培養物が、サイトメーターでそれらの特性を分析し、それに応じてポピュレーションゲートを調整する必要があることです。蛍光レポーターを保有する菌株の場合、ネガティブコントロールとして蛍光レポーターを装着していない菌株が必要です。サイトメーターアプリケーションに関する基本的な知識があれば、以下のプロトコルを成功裏に実装することができます17,18,19,20,21.この例では、3 つの微生物の人工混合物が分析されます ( 代表的な結果): Synechocystis (細胞質レポーター蛍光色素、mVenusを発現)と2つの酵母 S. cerevisiae そして U. maydis.の正確な識別のために S. cerevisiae そして U. maydis、蛍光マーカーは、細胞質緑色蛍光タンパク質(GFP)(U. maydis eGFP)および赤色蛍光タンパク質(RFP)mKate2(S. cerevisiae mKate2)を基本的な分子クローニング技術を用いて作成しました。可能であれば、レポーターのゲノム統合を持つ株を優先して、連続的な選択圧力の必要性を回避する必要があります。
    1. サンプル調製
      1. 分析する特定の成長段階における培養物のODを測定します。
      2. サンプルの外径を測定に適した範囲に調整します。シアノバクテリアには約OD750 を0.05〜0.5、酵母にはOD600 を0.2〜1.5に、新鮮な培地(最終容量:500 μL以上)を使用します。共培養の場合は、~0.1 から 0.5 の間の OD750 を目指し、希釈係数を記録します。計算には、手順 1.1.3.1 で説明した式を適用します。これにより、細胞数は10μL/min(6,000〜60,000細胞/μLに相当)の流速で1,000〜10,000細胞/sの範囲に留まるようになります。
        注:希釈には、自家蛍光や粒子を含まない培地またはバッファー(BG-11など)を使用することができます。酵母抽出物などの複雑な成分を含む媒体は、測定で粒子として表示される可能性があるので注意してください。
      3. 各サンプルセル懸濁液300 μLを96ウェルプレート(標準丸型ウェル、透明、平底)の個々のウェルに移します。
        注:あるいは、プレートリーダーモードの代わりに半自動サンプルモードを使用する場合は、0.5〜2mLを蛍光活性化セルソーティング(FACS)チューブに移します。
    2. サイトメトリー測定
      1. サイトメーターを起動し、製造元の指示に従ってスタートアッププログラムと品質管理(QC)を実行します。
      2. ロード(プレートローダーまたは半自動サンプリング)し、サンプルを実行します。まず、各共培養パートナーの無酸素培養物を使用して対照サンプルを作成し、その特性に基づいて各種を同定してから、共培養サンプルでそれらを分離することを目指します。
      3. サンプルに関連する蛍光および散乱(例:前方散乱[FSC]または側方散乱[SSC]高さ[-H]または面積[-A])チャネルのオープンドットプロットおよび/またはヒストグラム。
      4. 必要な細胞集団を探し、閾値を調整して、培地からテクニカルノイズと小さな粒子を除外します。
        注:FSC-HオーバーFSC幅またはFSC-HオーバーSSC-Hドットプロットで細胞集団を検索し、バクテリアのような小さな細胞(通常は1〜3μm)のスケールを線形から対数に調整することをお勧めします。FSC-HまたはSSC-Hチャネルでしきい値を設定します。直径が1μm未満の細胞の場合は、405 nmのバイオレットレーザーでバイオレットSSC(VSSC)を使用すると、分解能が向上します。
      5. 関心のある各チャネルのゲインを手動で25〜2,500の範囲に調整します。ネガティブコントロール(蛍光マーカーなしなど)が1 x 102-1 x 103 の範囲にあり、ポジティブコントロール(蛍光マーカーありなど)が1 x 105-1 x 106 の範囲にあるようにゲインを調整して、最適な分離を実現し、1 x 101-1 x 107の範囲内にとどまります。
        注:QCからの標準ゲインも、良い参考として保持できます。
      6. サンプル中の細胞濃度を測定するには、記録機能を使用して定義されたサンプル量を記録します(例:10 μL/minの流速で10 μL)。後で、このボリュームで測定された個々の細胞数を記録されたボリュームで割って、各集団のμLあたりの細胞数を求めます。
        注:培養/サンプル中の細胞濃度を計算する際には、初期希釈係数を念頭に置いてください。
    3. 細胞集団のゲーティング/選択
      注:測定の実行に使用したデバイスに関係なく、解析およびゲーティングは、以下に例示するように、サイトメーターオペレーティングソフトウェアまたは市販の解析ソフトウェアで実行できます22.さらに、非独占的なソフトウェアを使用したフローサイトメトリーデータの解析は、FlowCytometryToolsなどのさまざまなオープンソースツールで効率的に行うことができます23 またはFlowKit、FlowUtilsを使用24 Python のパッケージ。オープンサイエンスの精神に基づき、このプロトコルは、基本的なデータ探索のためのこれらのパッケージの使用を示す模範的なJupyterNotebookを共有しています。もちろん、フローサイトメトリーのバイオインフォマティクスを実行するためにも、代替ソフトウェアも同様に適しています25.
      1. ドットプロットで細胞集団の周囲にゲートを描画するか、ヒストグラムでピークの周囲に分割線または線分を設定することにより、特定の細胞集団を選択します(図4)。
        注意: プログラムのオートゲート機能は参考として使用できます。
      2. 光栄養生物と従属栄養生物のシグナルは、スペクトルの赤色領域における光栄養生物(主にクロロフィルによる)の自家蛍光に基づいて分離します。例:APC-H チャンネルのヒストグラム(638 nm での励起(例)、660/10 nm での発光(em.))を使用し、右のピーク(phototrophic = chlorophyll autofluorescence positive population)と左のピーク/s(従属栄養性 = クロロフィル自家蛍光陰性集団)の間に垂直分割線を設定します(図 4A)。
        注:蛍光マーカーは、同じ培養内の2つ(またはそれ以上)の光栄養パートナーを区別するためにも使用できます(例: シネコシスティスのmVenus)。
      3. 2つの従属栄養生物は、蛍光マーカーまたは散乱特性(可能であればFSC、SSC)に基づいて分離します。
        注:散乱特性に基づく分離は、細胞が、例えば、散乱に目に見える変化をもたらす異なる細胞サイズまたは形態を有する場合にのみ適用可能である(例えば、 シネコシスティス:直径~1.5〜3μmの球状細胞対長さ10μmおよび直径約1〜2μmの U.maydis 細長い細胞26)。
      4. 例:「従属栄養」集団のみを表示するFITC-Hチャネル(例:488 nm、em.:525/40 nm)のヒストグラムを使用して、GFPを含む従属栄養細胞( 例:U. maydis eGFP)とGFPを含まない細胞(例: S. cerevisiae RFP/mKate2)を区別します(図4B)。あるいは、PC5.5-Hチャネルのヒストグラム(例:561 nm、em:710/50 nm)のヒストグラムを使用して、「従属栄養性」集団のみを表示し、RFPを含む従属栄養細胞(例: S. cerevisiae RFP/mKate2)とRFPを含まない細胞( 例:U. maydis GFP)を区別します(図4C)。
        注:測定中に2つ(またはそれ以上)の異なる細胞タイプが「くっつく」可能性があることに注意してください。これらの「ダブレット」または「マルチプレット」は、両方の蛍光マーカーのドットプロットで容易に検出できます(例えば、光栄養およびGFPタグ付き従属栄養パートナーのダブレットを同定するためのFITC-H上のAPC-H)。
      5. Python での基本的なデータ分析については、この Jupyter (https://git.rwth-aachen.de/computational-life-science/cytoflow) の指示に従ってください。
        注: このノートブックは、データ分析の 3 つのステップをサポートしています。i) データのインポート: FCS ファイルのインポート。ii) 品質管理の実施: データの整合性とイベント数を確認します。iii) データの視覚化: ヒストグラム、散布図、密度プロットなどのプロットを使用して、データを視覚化します。また、 図4 を再現して対象集団を分離するためのゲーティングを行う手順が示されている。
        長期プロジェクトにおける共培養の解析を容易にするために、研究者は上記の方法を使用して細胞数をカウントし、OD値と絶対細胞数を比較するための標準曲線を作成することをお勧めします。光学密度は、種、系統、成長条件、および分光計によって異なる可能性のある相対的な測定値です。したがって、OD値をセル番号に正確に変換するためには、「社内」の標準曲線を生成する必要があります。

figure-protocol-1
図1:形態学的に区別可能な細胞の顕微鏡定量(A)ノイバウアー計数チャンバー。(B)ニュートンのリングは、特殊カバースリップの正しい位置を示しています。(C)細胞計数のために定義された体積の中央空洞を持つチャンバー構造の概略図。(D)描かれたノイバウアー計数室のグリッドは、1mm2(赤)のサイズの9つの大きな正方形で構成されています。角にある4つの大きな正方形は、さらに16の正方形(青)に分割されています。中央の大きな正方形は、0.04 mm2(オレンジ)のサイズで25のグループ正方形に分割されています。各グループの正方形は、16個の最小の正方形(緑)で構成されています。この数値は、一般に公開されているメーカーの情報に基づいて作成されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

光合成 性S. elongatus と従属栄養酵母の共培養の確立
Synechococcus elongatus PCC 7942とS. cerevisiaeのさまざまな亜系統との共培養からの詳細な結果を以前に報告しました。このシアノバクテリア/酵母のペアとの共培養結果の包括的な説明については、8を参照してください。簡潔さと正確さのために、これらの結果はここでは再現しません。簡単に言えば、以前の結果は、シアノバクテリアと酵母の長期共培養の確立に重要ないくつかの考慮事項を示しています。主な関心事は、シアノバクテリアが固定炭素の唯一の形態を提供する条件下で酵母が生存する能力は、酵母株がショ糖を利用できる効率に強く依存していることです。ショ糖27,28をより効率的に代謝するように進化または操作されたS.cerevisiae株は、共培養増殖モードへの移行を生き残る可能性が高く、より高い細胞密度を達成し、長期(数日から数週間)のシアノバクテリア共培養実験でより高い堅牢性を示しました8。共培養物への接種の初期段階は、おそらく培養希釈のストレス、培地組成の切り替え、および/またはより高濃度の炭素源の回収により、酵母の生存率にとって特に重要でした。したがって、共培養開始時に、より豊富な増殖培地から最小限の炭素利用可能性への移行を容易にする努力により、実験のパフォーマンスと一貫性を向上させることができます(ステップ1.2.1.1を参照)。さらに、S. cerevisiaeは、S. elongatusの密集した培養物に接種すると、高酸素と一致するストレス応答を示し、酸素光合成の主要な副産物としてのO2の形成と一致しました。したがって、シアノバクテリアパートナーの異常増殖および/または「昼/夜」の光サイクルを交互に繰り返すのを防ぐ努力は、長期共培養における出芽酵母の生存率を大幅に延長する可能性があります。共培養で一般的な現象の追加の要約については、axenic コントロールサンプルに関連する考察セクションを参照してください。

さまざまな方法論を使用した共培養の成長のモニタリング
次のセクションでは、3つの異なる方法を使用した Synechocystis と2つの酵母 S.cerevisiae および U.maydis の人工的に混合された三者コンソーシアムの例示的な定量化について説明します。混合物については、単一培養物のOD750 (シアノバクテリア用)およびOD600 (従属栄養生物用)を決定し、OD 0.1に調整しました。単一培養物を光学濃度を用いて1:1:1の比率で混合した(これは細胞数とは異なる、上記参照)。サイトメーターにおける酵母の識別を容易にするため、遺伝子組み換え S.cerevisiae FY1679-O1B29 のレポーター株は、細胞質mKate2(遺伝子型:URA3Δ/pTDH3::mKate2;株: S.cerevisiae mKate230)および U.maydis 株AB3331 eGFP (遺伝子型:pep4Δ/pRpl40::egfp;株: U.maydis eGFP32)を使用した。注目すべきは、シアノバクテリア株には、黄色の蛍光タンパク質バージョンmVenus(Synechocystis sp.PCC 6803 pSHDY-Pcpc560-mVenus、株 Synechocystis mVenus、33に類似)およびさらに、光合成機械の存在により典型的な強い自家蛍光を示します。

計数チャンバーを使用した顕微鏡定量: 3つの微生物の人工混合物中のすべての細胞型は、顕微鏡で容易に識別することができます（図2A）: シネコシスティス および 出芽酵母 は、その直径が大きく異なる球状細胞で表されます（シネコシスティス:直径約1.5〜3μm、 出芽酵母:直径約3〜6μm)一方、 ユコ サイジス菌は葉巻状の細長い形態で、長さは少なくとも10μmです(図2A)).これらの明確な形態学的特性により、混合物中の各パートナーの正確な定量化が可能になります。例として、37、18、36、および21 の出芽酵母 細胞が、それぞれ4つの大きな正方形にカウントされます(図2B)。平均値は 28 セルです。使用した血球計算盤の大きな正方形の面積は1 mm2 で、チャンバーの深さは0.02 mmであったため、0.02 μLあたり28個の細胞が得られます。これは1,400細胞/μLに相当し、1.4 x 106 細胞/mLに相当します。他の細胞タイプをカウントし、それに応じて濃度を決定しました(図2C、 表2)。

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図2: Synechocystis と酵母S.cerevisiae および U.maydisからなる三者コンソーシアムの顕微鏡的定量化。 (A)示された微生物の人工的に結合された混合物の顕微鏡的微分コントラスト(DIC)画像。すべての種は、その形態によって簡単に区別できます。スケールバー:10μm.(B)ODが0.1の無軸培養物に基づく示された菌株の人工的に組み立てられた混合物の例示的な計数結果。グリッドエッジの4つの大きな正方形が分析されました( 図1Dの赤いマーク)。(C)4つの正方形でカウントされた異なる細胞の平均値を使用して、懸濁液中の細胞の濃度を次の式で計算しました:平均値/(チャンバーの深さ[0.02mm]×カウントされた正方形のサイズ[1mm2]×1,000)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

パーティクルカウンターを使用した定量化: パーティクルカウンターは、懸濁液内の粒子の数をそのサイズに応じて決定します。このデータセット例では、45 μm のキャピラリーを備えたパーティクルカウンターを使用しました。 S. cerevisiae 細胞と U. maydis 細胞は同様の寸法を示すため、粒子カウンターでは区別できませんが、小さな シネコシスティス 細胞は明確に分離できます。したがって、単一培養物の分析では、2 つの酵母の 3 μm から 6 μm を参照する同一の位置にピークが見られます(図 3A)。測定中、負圧が加えられ、細胞が毛細血管に入ります。これにより、電気抵抗が一時的に変化し、デバイスがその変化に基づいて粒子サイズを決定できるようになります。混合培養では、2つの異なるピークが検出され、1つは小さなシアノバクテリア細胞に関連し、もう1つは2つの酵母種の結合画分を表します(図3B)。重要なことに、生細胞を反映するピークに加えて、細胞の破片や小さな粒子に対応する追加のピークが約1μm(図3)で検出されました。予想よりも大きな直径で現れるシグナルは、細胞の凝集によって引き起こされる可能性があります。注目すべきは、ピークの形状が細胞の均質性を反映していることです:鋭いピークは非常に均質な細胞を示し、これは共培養ではありそうにありません。共培養では、非常に広いピーク、または共培養のパートナーのサイズが明らかに異なる場合は2つのピークが見られることが予想されます。従属栄養菌の無軸培養の場合、ピークは中程度の幅のピークである可能性があります。

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図3: Synechocystis mVenusと酵母S . cerevisiae mKate2および U. maydis eGFPからなる三者コンソーシアムの粒子カウンターを使用した定量化。 (A)グラフに示されている3つの菌株の無菌培養の解析の視覚的出力(45μmキャピラリーのセルカウンター)。(B)同一の条件を用いた人工三者コンソーシアムの分析のための例示的な視覚出力ファイル。パーティクルカウンターは、2番目のピークで表される2つの酵母種の識別をサポートしません。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

シングルセルサイトメトリーを用いた定量: シングルセルフローサイトメーターを使用すると、さまざまな細胞集団を、その(自動)蛍光特性と光散乱特性に基づいて簡単に区別できます。光合成細胞(Synechocystis)は、APC-Hチャネルで測定される光合成色素の赤色自家蛍光に基づいて、従属栄養細胞(U.maydis および S.cerevisiae)から分化することができる(図4A)。光栄養細胞と従属栄養細胞の初期分離に基づいて、2つの従属栄養集団は、FITC-HチャネルのeGFPとPC5.5チャネルのmKate2の蛍光マーカーに基づいて区別できます(図4B、C)。3つの母集団(FSC-HおよびFSC-Width)すべての散乱特性を示すドットプロットでは、母集団のわずかな重複だけで母集団を区別することもできます(図4D)。

この分析法では、希釈したサンプル10μLを10μL/minの流速で分析し、1分間で約70,000個の細胞を定量することができました。これらの細胞の約60%を シネコシスティス (4.23 x 106細胞/mL)に割り当てることができ、残りの40%は U. maydis (1.35 x 106 細胞/mL)と S. cerevisiae (1.36 x 106 細胞/mL、図4E、 表2)に均等に分布していました。

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図4:シアノバクテリアSynechocystis mVenusと酵母U. maydis eGFPおよびS. cerevisiae mKate2からなる三者コンソーシアムのシングルセルフローサイトメトリーを用いた定量。 Synechocystis mVenus(濃緑)、U. maydis eGFP(薄緑)、S.cerevisiae mKate2(赤)の混合培養を1/3 OD750 / 1/3 OD600 / 1/3 OD600の比率でサイトメーター(A)で測定した後に得られたプロット例 APC-Hチャネル(例:638 nm、 em.:660/10 nm)は、自家蛍光に基づいて光合成細胞と従属栄養細胞を区別するために使用されたすべての細胞の100/10 nmです。(B)U. maydis eGFP細胞とS. cerevisiae mKate2細胞の緑色蛍光特性に基づいて分化するために使用したすべての従属栄養細胞のFITC-Hチャネル(例:488 nm、em.:525/40 nm)のイベントカウントと蛍光のヒストグラム。(C)U. maydis eGFP細胞とS. cerevisiae mKate2細胞の赤色蛍光特性に基づいて分化するために使用したすべての従属栄養細胞のPC5.5-Hチャネル(例:561 nm、em.:710/50 nm)のイベントカウントと蛍光のヒストグラム。(D)蛍光特性を持たない細胞集団を同定するために使用される、FSC-Hチャネル上のFSC-Widthの散乱信号のドットプロット。(E)関連する蛍光チャネルのイベントカウント、パーセンテージ、算術平均、標準偏差(SD)を含む母集団統計。細胞の総量は、そのサイズと蛍光とともに、10μLの容量で10μL/分の流量で決定されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

さまざまな定量化方法の出力を比較に視覚化するために、決定されたセル番号を次の 2 つの表 (表 2 と 表 3) に示します。前述の3つの方法を使用して決定された細胞の最終濃度は、すべての方法で同様の範囲にあります。サイトメーターは最も高いサンプルサイズを提供し、次にパーティクルカウンターと顕微鏡定量を提供し、メソッド間で約1桁減少します。

共文化 1:1:1光度計サイトメーターパーティクルカウンター顕微鏡計数チャンバー
生物外径750/600セル数細胞数/mLセル数細胞数/mLセル数細胞数/mL
Saccharomyces cerevisiae mKate20.033313,6181.36×1061,546*2.58 x 106*1121.40×106
Ustilago maydis eGFP0.033313,5411.35×106891.11×106
Synechocystis sp. PCC 6803 mVenus0.033342,3304.23×1063,0945.16×1062713.39×106

表2:さまざまな定量化方法の比較:人工混合培養。 なお、U. maydis とS. cerevisiae は、パーティクルカウンター(*)では区別できません。

単一文化光度計サイトメーターパーティクルカウンター顕微鏡計数チャンバー
生物外径750/600セル数細胞数/mLセル数細胞数/mLセル数細胞数/mL
Saccharomyces cerevisiae mKate20.138,9363.89×1061,9283.21×1064034.03×106
Ustilago maydis eGFP0.136,9273.69×1062,4654.11×1063073.07×106
Synechocystis sp. PCC 6803 mVenus0.1127,8641.28×1078,1861.36×1074281.07×107

表3:さまざまな定量方法の比較:単一/無軸培養によるキャリブレーション。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

実験室での単一無菌培養における微生物の取り扱いは、多くの微生物モデルで何十年にもわたって確立されてきました。しかし、自然界の生命の一般的な形態は微生物群集であるにもかかわらず、1つの培養容器に2つ以上のパートナーを組み合わせることはあまり確立されておらず、既存の知識と方法論のギャップによって課題が提示されています。また、細胞間で創発的な相互作用や代謝物交換が起こり、共培養の運命に強く影響するため、コミュニティ内の細胞の挙動を予測することもより困難である34,35。したがって、共培養の確立は、増殖培地の定義、一般的な成長条件の特定、微量代謝物/シグナルの種間交換、および結果として生じる共培養組成の経時的なレベルを含め、些細なことではありません。従属栄養パートナーとの光栄養性糖分泌シアノバクテリアの集合におけるここ数年の進歩により、新しい共培養ペアの設計に役立つガイドラインを提供できる最初のルールと方法論を推論できるようになりました。その知識に基づいて、このプロトコルの最初の部分では、スクロース分泌シアノバクテリアと1つ以上の酵母を含む共培養物の集合に対する段階的なガイドラインが提供される。

無関係な微生物間の共培養を最初に試みる際の重要な考慮事項の1つは、2つ以上の種のすべての栄養要件を満たす共通の増殖培地の組成です。スペースの制約により、このプロセスの完全に詳細なプロトコルをここで提供することは不可能であり、場合によっては高度なカスタマイズが必要になることもありますが、代わりに、留意すべき重要な考慮事項を以下に概説します。1つの簡単な初期アプローチでは、典型的なシアノバクテリア増殖培地(BG11など、表1を参照)を、目的の従属栄養種用に構成された確立された最小培地と比較します。従属栄養性最小培地に含まれる欠落している成分を標準的なシアノバクテリア培地に補充することは、初期試験8,36の良い出発点である。最小培地には、従属栄養増殖のための重要な有機炭素源(1%-4%グルコースなど)が補充されることが多いため、初期の共培養実験で達成される可能性が高いよりも高い従属栄養細胞密度をサポートするように設計されていることが多いことに留意してください。同様に、一部の一般的な培地成分は、シアノバクテリアパートナーが提供する光合成物(クエン酸塩など)とは無関係に有機炭素源としても機能するため、シアノバクテリア/従属栄養生物の共培養の後の分析を複雑にする可能性があります。したがって、共培養培地を設計する際に、最小のシアノバクテリア培地を欠落している元素の全濃度で補完する必要がない場合があります。例えば、多くの生物は、さまざまな形態の環境窒素(例えば、N2、硝酸塩、亜硝酸塩、尿素)の使用効率が異なり、より酸化された窒素源の一部を完全に利用できない場合があります。同様に、多くの微生物は、必須ビタミン(ビタミンB12など)、補因子、または必須アミノ酸の直接合成のための完全な生合成経路がないため、これらのビタミンの補給を必要とする場合があります。これらの理由から、シアノバクテリアパートナーの確立された最小培地(BG11など)を従属栄養生物の明確に定義された最小培地(例えば、合成定義[SD])と単純に「融合」することから始めることが最も実用的かもしれません。余分な成分を繰り返し除去/削減する後のサイクルを使用して、培地を最適化し、パートナーの1つの成長を阻害する可能性のある化合物の存在量を減らすことができます。有用な出発点は、中性またはわずかに塩基性のpHで培地を緩衝することです。これらはほとんどのシアノバクテリアモデル種が好む条件である傾向があります。

この時点で、過剰なスクロースが供給された場合に、新しい共培養培地で支持された従属栄養生物の成長の予備試験を実施することが役立つことがよくあります。もちろん、潜在的な従属栄養生物を選択する際には、シアノバクテリアパートナーから供給される有機炭素の主要な供給源を異化できるものを選ぶことが重要です。ここで注意することは有用であるが、スクロースは、多くの人工シアノバクテリア/従属栄養培養4で供給される主要な炭水化物として、グルコースと同様に従属栄養微生物によって普遍的に利用される炭水化物ではない:専用のスクローストランスポーターは従属栄養種によってコードされなければならない、または細胞外インベルターゼは、スクロースを高親和性トランスポーター8によってしばしば認識されるフルクトースおよびグルコースに変換するために必要であるかもしれない.混合微生物群集を研究する複数の研究室によって一般的に報告されている重要な観察結果は、光栄養パートナーと従属栄養パートナー4,8,13の間に高次の相乗作用と拮抗作用が現れることである。例えば、他の天然分泌代謝産物(例えば、有機酸、還元型窒素)または補因子(例えば、シデロフォア)は、同じ培地で培養すると、アキセンコントロールと比較して一方または両方のパートナーのより高い成長率を可能にする可能性がある。逆に、光合成水の分解による培地の高酸素化など、潜在的に有害な代謝副産物は、一方または両方のパートナーの種間成長阻害を引き起こすことが報告されている8。したがって、無菌制御は有用なベンチマークを提供できますが、共培養のパフォーマンスは、これらの創発的な特性により予想とは異なる場合があります。

従属栄養パートナーとS.elongatusのショ糖を排泄する能力(誘導のレベル、使用済みIPTG濃度に基づく)に応じて、両方の生物の異なる比率をテストする必要があります。培養の成功は、主にS. elongatusが従属栄養パートナーの成長を維持する能力(すなわち、十分な炭素源を生産できるか)にかかっています。従属栄養株の異常増殖は、通常、共培養培地組成物に提供される有機炭素の不足によって制限されますが、シアノバクテリアは従属栄養生物を上回る可能性があり、それが新たな阻害性相互作用(例えば、高酸素状態8,13)につながる可能性があります。シアノバクテリア:酵母の細胞密度の適切な比率を最初に決定しようとするとき、シアノバクテリアのパートナーは、付随する従属栄養細胞の等しい細胞量をサポートできるというのがおおよそのルールです。真核酵母は、モデルショ糖分泌シアノバクテリアよりもかなり大きな細胞体積を持つ傾向があるため、これは、シアノバクテリア細胞の密度が定常状態でかなり高くなることを意味する可能性があります(たとえば、S.cerevisiaeの場合は50〜100倍)。したがって、研究者固有の実験室および種の条件で新しい共培養を設定する際の良い出発点は、シアノバクテリアと酵母の両方の平均細胞体積を計算し(公表された値に基づく、例えばB10NUMB3R537を参照)、体積比を推定することです。初期フラスコは、この細胞の比率で播種することができます。溶液空間を探索するために、研究者は、シアノバクテリアの濃度を一定(例えば、OD750 = 0.3)に保持しながら、酵母細胞の濃度を、研究者の利用可能な光合成培養空間によって許容されるスループットに基づいて、約一桁ずつ増分で上下に変化させたいと思うかもしれません。もちろん、この体積の「経験則」は、光栄養パートナーが従属栄養パートナーが利用できる有機光合成物(例えば、スクロース)を分泌する能力がどの程度あるかに依存します。共培養条件が確立されると、特に初期の共培養を数日から数週間維持できる場合、理想的な種比率に関する貴重なデータが得られます。この情報は、その後の実験で各パートナー種の初期接種密度を選択する際に活用でき、培養物が自己決定する理想的な種比により迅速に到達するのに役立ちます。

プロトコルの 2 番目の部分では、共培養分析の詳細な手順が提供されています。共培養の信頼性の高い定量化は、その実装を成功させるための鍵です:光向性の炭素分泌パートナーの成長(または少なくとも代謝活性)は、従属栄養生物を維持するために不可欠です。培養物の接種に用いるシアノバクテリア:従属栄養生物の比率は、必ずしも最適化に重要であるとは限らないが、長期の共培養は安定した比率に収束する傾向があるため、培養希釈または1種以上の種のカプセル化を通じて、いずれかのパートナーの無制限の増殖をチェックする方法を統合することが重要かもしれない36,38,39,40.上述したように、シアノバクテリアパートナーの副産物は、高濃度(例えば、O2)で従属栄養生物に対して阻害される可能性があり、従属栄養代謝の一部の産物もシアノバクテリアの健康に有害であり得る。発表されたほとんどの共培養物は、ほとんどのモデルシアノバクテリア種よりも成長率が速い従属栄養生物を利用しています。したがって、従属栄養成長率は、シアノバクテリアによって生成される有機炭素の供給によって制約される傾向があります。それにもかかわらず、種の個体数動態を経時的に決定することは、長期培養における安定性の失敗を解明し、堅牢な共培養を最適化するための重要な価値です。

カウンティングチャンバー、パーティクルカウンター、およびシングルセルフローサイトメトリーを使用した定量のためのプロトコルが提供されています。ただし、すべての手法は、共培養の特性評価のための貴重なツールですが、前提条件、利点、および制限があります。カウンティングチャンバーは、培養中のすべてのパートナーが細胞形状やその他の特性によって視覚的に区別できるという条件で、共培養の定量に非常に広く適用できます。大きな利点は、このデバイスの低価格であり、基本的にすべての研究室で達成可能です。共培養の組成と異なるパートナーの比率に関する情報に加えて、細胞の形態と適応度の印象を一緒に得ることができ、潜在的な汚染物質を検出することができます。ただし、計数チャンバーの適用にも非常に時間がかかり、作業負荷が高く、低スループットしかサポートできません。

パーティクルカウンターとシングルセルフローサイトメトリーはどちらも、ハイスループットと便利で時間を節約する取り扱いという大きなメリットを提供します。セルカウンターは、共培養のパートナーの細胞サイズの明確な違いに依存していますが、シングルセルサイトメトリーは蛍光標識も識別できるため、同じサイズの2つ以上のメンバー、または異なる蛍光マーカーに基づいて同じ生物の2つの異なる変異体を持つ共培養を定量化することができます。提供されたシネコシスティスとS.cerevisiaeおよびU.maydisとの人工的な集合体の例では、細胞内蛍光レポーターmKate2およびeGFPを使用して2つの酵母を区別しました。同じ蛍光レポーターを使用して、光散乱特性だけでは分離できなかった同じ生物の2つの遺伝子組み換え株(S.cerevisiaeなど)を区別することもできます。同様の戦略は、合成細菌コンソーシアムを追跡するために実施されている41。細胞の種類、コンソーシアムのパートナーの数、およびそれらの自家蛍光の潜在的な範囲に応じて、特にシアノバクテリアの自己蛍光特性を考えると、スペクトル品質の重複を避けるために蛍光マーカーの選択には特別な注意が必要です。42名

ここでは、科学データの保存、管理、共有に関するFAIRの指針をどのように遵守するかを提唱します。FAIRは、Findable、Accessible、Interoperable、およびReusable43の頭文字をとったものです。これらの原則が広く受け入れられるにつれて、生物学研究の状況を変革し、データ管理と使用に対するよりオープンで協調的で効率的なアプローチを促進することが約束されます。アクセシビリティの重要な構成要素は、Annotated Research Context(ARC)44にデータを登録することで確保できますが、オープンアクセスソフトウェアを使用してデータ処理ステップの再現を可能にすることが重要です。生のFCSファイルには、フローサイトメトリー実験に関するデータとメタデータ(波長、フィルターなどを含むレーザーと検出器に関する情報)の両方が保存されている45。これらは、高度なデータ分析を可能にする独自のソフトウェアの外部で読み込んで読み取ることができます。たとえば、Python環境内で生データを操作するためのパッケージが多数用意されています。開発されたパッケージは、Python23 で利用可能な多くのパッケージの 1 つを使用して、独自のソフトウェア外部でサイトメトリーデータを含む生の .fcs ファイルをロード、読み取り、および視覚化する方法を示しています。上記のようなオープンソフトウェアを使用すると、プロプライエタリソフトウェアに関連する高額なライセンス料が不要になり、データ処理(変換、補正、ゲーティングなど)を完全に制御でき、さらに多数のツールを1か所に統合できます。

シングルセルサイトメトリーをセルソーターと組み合わせて使用することの貴重な追加の利点は、FACSによって異なるタイプの細胞も収集する機会です。これは、RNASeqやメタボロミクスなど、共培養内の種間相互作用に関する詳細な洞察を得るためのあらゆるオミクス技術を適用するために非常に価値があります。これらのデバイスの明らかな欠点は価格が高いため、そのようなマシンの手頃な価格と入手可能性は、一部の研究所では明らかな制限になる可能性があります。

興味深いことに、コンソーシアムの3つのパートナーの定量化のために提示された方法を直接比較すると、異なる手法間で非常に良好な一致が明らかになり、OD測定に基づいて組み立てられた混合物が、記載されているすべての方法で確実に定量化されることが示されています。興味深いことに、シアノバクテリアの総数は、2つの酵母種の数よりも約3〜4倍多く、これは細胞サイズが小さいためと思われる現象でした。この観察は、ODが較正46なしに実際のセル番号に関する情報を提供しないという一般的な知識によく一致している。しかし、酵母は同等のレベルでカウントを示しました(表2 および 表3)。さらに、単一培養物の定量との比較は、2つの酵母種を分離しなかったパーティクルカウンターを除いて、3つの方法すべてが細胞型を識別するための信頼できるツールであることを示しています。

要するに、シングルセルサイトメトリーアプリケーションは、共培養の組成をモニタリングするための最も強力なツールであることは明らかで、毎秒1,000〜10,000個の細胞をカウントすることができます。これは、パートナーの数が2人以上に増えた場合、またはパートナーの形状や直径が類似している場合に特に当てはまります。特に、共培養のモニタリングを可能にする代替手段はたくさんあります。共培養物中の蛍光標識微生物の増殖は、例えば、蛍光測定またはマイクロバイオリアクター47によって連続的に追跡することができる。しかし、これらはしばしば2つのパートナーの共培養に限定され、蛍光マーカーの選択など、慎重な実験計画が必要です。Ampliconシーケンシング(16S rRNAシーケンシング)およびその他の次世代シーケンシング技術と高度なバイオインフォマティクスの組み合わせは、合成コミュニティの特性評価のための別のオプションです48,49,50。これらの技術はハイスループットアプローチに適しており、長期培養、進化上の問題、または複数の微生物パートナーとの突然変異の追跡における確立された相互作用に対処できます。

まとめると、合理的に設計された単純な微生物の共培養は、自然界を支配する多種コミュニティ内ではアプローチがより困難になり得る種間ダイナミクスを調査するための強力な「ボトムアップ」アプローチを提供する51,52,53。ここでは、シアノバクテリアおよび従属栄養パートナーの新規ペアの確立および分析のために科学界によって容易に適応できる合理化されたプロトコルが提供される。人工微生物の共培養から得られる可能性のある基本的な洞察を活用するだけでなく、合成的に設計された微生物コンソーシアムが、バイオテクノロジーへの応用のための文献でしばしばそれらに帰せられる可能性と一致するかどうかを判断するために、多くの研究が必要であることは明らかです。

開示事項

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著者は何も開示していません。

謝辞

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この研究は、Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) - SFB1535 - Project ID 458090666 (project B03 to KS, AM, AND IA), AND MAJOR RESEARCH INSTRUMENTATION INST 208/808-1 の資金提供を受けました。DCDは現在、SFB1535のメルカトルフェローとしてHHUデュッセルドルフを訪れています。EJKに対する追加の支援は、National Science Foundation Awards #1845463および#2334680によって提供されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10x Ph1対物レンズCarl Zeiss AG46 04 01-9904
525/40 nm バンドパスフィルターBeckman Coulter, Inc.A01-1-0051FITCフィルター(488nmレーザー内)
660/10nmバンドパスフィルターベックマン・コールターA01-1-0055APCチャネル(638 nmレーザー内)
710/50 nm バンドパスフィルターベックマン・コールターB71092PC5.5チャネル(561 nmレーザ)
Multisizer 4eBeckman Coulter, Inc.A35473蓋付きサンプルカップ
アパーチャチューブ 30 μマルチサイザー4eベックマンコールター株式会社C92760キャピラリー
オートクレーブラボアソシエイツEQM-ARBP材料の滅菌用
ッフルフラスコROTILABO®、ストレートネック、250ミリリットルロスGmbH + Co. KGLY95.1
BG11 / CoYBG11コンポーネント異なるサプライヤー表1 を参照してください。
ボトルトップ滅菌フィルターSigmaaldrich、オートクレーブ
キャピラリー45&マイクロを使用したくない場合は、滅菌培地にZ222593します。mオムニ ライフサイエンスOLS 5651738
CASY セルカウンター モデル TTCSchaerfe Systems
CASY カップオムニ ライフサイエンスOLS 5651794
CASYcleanオムニ ライフサイエンスOLS 5651786洗浄液
CASYton ソリューションオムニ ライフサイエンスOLS5651808 アイソトニック ソリューション 
遠心分離管(50 mL)SigmaaldrichCLS430828
CO2BOC270182-Lシアノバクテリア無菌培養および共培養
CONTRAD® 70Beckman Coulter, Inc.81911ディープ クリーン ソリューション
カバー ガラス 20 × 26 x 0.4 mmVWR International GmbH631-1190計数室用カバー
ガラス キュベットSarstedt 67.742
シアノバクテリア BG-11 淡水溶液Merck KGaAC3061
CytExpert Software v. 2.6Beckman Coulter, Inc.サイトメーターアプリケーションソフトウェア
CytoFLEX Sheath FluidBeckman Coulter, Inc.B51503Sheat fluid
Cytometer CytoFLEX SBeckman Coulter, Inc.
BE51180 DxH クリーナー マルチサイザー 4eベックマン・コールター用628022洗浄液
エッペンドルフチューブ遠心分離機 (小)LabstacCEN16-152mL未満の培養
EthanolCarl Roth GmbH + Co. KGK928.1
FACS tubesBeckman Coulter, Inc.半自動モード用2523749
フロークリーン洗浄剤 500mlベックマン・コールターC48093毎日のクリーンソリューション
メディアの準備のためのメスシリンダーSigmaaldrichZ131121
HEPPSOMerck KGaAR426725
Infors MultiTron photoincubatorInfors AG白色 LED ライト
IPTGMerck KGaAI6758アリコートを準備し、-20°Cで保存します。C、解凍して氷の上に保ちます 
アイソトンII マルチサイザー4e用ベックマン・コールター社8448011アイソトニックソリューション 
Kaluza v. 2.2ベックマン・コールター社B16406サイトメトリーデータ解析ソフトウェア
KimWipesVWR International GmbH115-2221糸くずの出ない組織
KOHMerck KGaA221473 KPO
3Noah Chemicals7790-53-6
測定ビーカーVWR213-3747
マイクロテストプレート、96ウェル、スリップオンリッド、フラットベース、PS、透明SARSTEDT AG & Co. KG82.1581.001
顕微鏡ベースCarl Zeiss AG47 09 18-9902/16
Microsope ヘッドCarl Zeiss AG47 30 14
Milli-Q 浄水システムMerck MilliporeC85358
Mulitisizer 4e パーティクルカウンターBeckman Coulter, Inc.B23005CASYセルカウンターの代替品
ノイバウアー改良、深さ0.02 mmアシストドイツカウンティングチャンバー
ノイバウアー改良、深さ0.1 mmPaul Marienfeld GmbH & Co. KG640010カウンティングチャンバー
レディ・トゥ・ユース デイリーQC フルオロスフィアベックマン・コールター社C65719QC
SCHOTTボトルDutscher90347保管
用リファレンスSpecord®200プラス分光光度計分析イエナGmbHOD600/750
ショ糖メルクKGaA84100
テーブルトップ遠心分離機(大)LabstacCEN18-06R
、アミノ酸なしで、硫酸アンモニウムなしでサーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社
用アキュベット用Mバカールはを供給する 物 チューブのは、培養バイオマス酵母窒素塩基を収集します 11743014

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