低コストポリエチレンテレフタレートラミネートラミネートマイクロ流体工学による多重ゼブラフィッシュイメージングのための設計

サマリー

ポリエチレンテレフタレート(PET)ラミネートを用いたマイクロ流体デバイスの革新的な作製方法により、複数の生きたゼブラフィッシュ胚の捕捉とイメージングのコストと複雑さが大幅に軽減されます。

要約

ゼブラフィッシュの胚は透明であるため、創傷治癒や免疫細胞の遊走などの基本的なプロセスの非侵襲的な生体内イメージングに独自の適しています。マイクロ流体デバイスは、ゼブラフィッシュを含む多細胞生物の長期イメージングをサポートするための捕獲に使用されます。しかし、ソフトリソグラフィーを使用してこれらのデバイスを製造するには、3Dプリンティングの専門的な設備と能力が必要であり、すべてのラボがアクセスできるわけではありません。以前に開発された低コストのポリエチレンテレフタレートラミネートラミネート法をマイクロ流体デバイスの構築に採用したことで、従来の技術のわずかな技術投資で設計の製作と反復が可能になり、アクセシビリティが向上します。この方法で作られたデバイスであるRotational Assistant for Danio Imaging of Subsequent Healing(RADISH)を使用して、薬物治療、手動創傷、および同じ視野で最大4つの胚の長期イメージングに対応します。この新しい設計により、損傷直後の2時間における複数の胚のレーザーアブレーションおよび手動切断創傷の周囲のカルシウム信号の全体的な形態学的特性、および24時間の創傷縁への好中球動員をうまく捉えることができます。

概要

損傷に適切に対応する能力は、単一の細胞から複数の組織まで、あらゆるスケールですべての生物が生存するために重要です。したがって、損傷領域¹への食細胞の動員など、創傷とそれに関連する応答は、細胞および組織生物学における重要なトピックです。創傷は、組織バリアが破られた直後に感知され、創傷治癒とその後の再成長⁴を調整する創傷収縮^2,3を含む組織勾配応答を引き起こします。この収縮の機械的性質のため、実験中に使用されるツールは、損傷部位の近くの細胞の動きを物理的に妨げてはなりません。

ゼブラフィッシュの胚は、その手入れの容易さ、遺伝的な扱いやすさ、および^{光学的透明性5,6}により、脊椎動物の創傷反応を含む発生と疾患を研究するための優れたモデルです。しかし、損傷部位の近くの細胞の長期的な挙動を研究するためには、生物全体を長期間固定化する必要があります。低融点アガロースに胚を埋め込むだけで、無傷組織の短期イメージングには十分です。しかし、周囲のゲルマトリックスは、創傷の収縮および弛緩を制限し、経時的に発生中の胚の成長を妨げる^7,8,9。

マイクロ流体デバイスは、さまざまな発生段階^{10、11、12、13、14、15、16}でゼブラフィッシュの胚を固定することができ、zWEDGI⁷などの一部は手動傷害に対応します。ただし、利用可能なデバイス設計にはいくつかの欠点があります。例えば、プラスチックに直接プリントされた多くのデバイスは、光学的透過性が低いため、倒立顕微鏡システムでのイメージングと互換性がありません。さらに、パラレルチャンネルはマルチポジションイメージング^10,11を可能にするが、顕微鏡ステージの物理的な動きは画像取得に遅延をもたらす。これらの問題を解決するために反復と最適化を繰り返すことは、特にポリジメチルシロキサン(PDMS)ソフトリソグラフィーを使用した現在のゴールドスタンダードのデバイス製造方法において、すべての新しい設計に必要な財政的および技術的投資を考慮すると困難です。最初のステップであるマスター金型の作成には、多くの場合、3Dモデリングソフトウェアの知識、専用の製造機器へのアクセス、および(使用する材料によっては)金型を使用する前にシラン化などの追加の接着防止処理が必要です。一度注がれたPDMSの硬化には、高温で少なくとも1時間かかり、一般的には、最良の結果を得るためには、真空下またはクランプを使用して、多くの場合、クリーンルーム^{で行う必要があります7,17,18}。発生生物学と同様に、これらのコストは、複数のモデルにまたがる多くのユニークなマイクロ流体環境を必要とする実験にとって、急速に法外なものになる可能性があります。

利用可能な代替建材の中で、ポリエチレンテレフタレート(PET)は耐久性があり、毒性がなく、操作が容易です。PETシートは、ほとんどの事務用品店で取り扱っているプラスチックラミネートポーチで、熱活性化接着剤(一般的にはエチレン酢酸ビニル)があらかじめ塗布されています。これらのPETシートを市販のクラフトカッター(ホームクラフター向けに設計されたコンピュータ制御のカッティングプロッター)で成形し、標準的な熱ラミネート装置で層同士を密着させることで、さまざまなデザインを迅速に生成し、反復することができます。したがって、我々は、スタック^PET18を含む前述の設計および建設方法を採用して、Subsequent Healing(RADISH)のDanio Imaging用のRotational Assistantを作成しました(図1A、B)。ほぼくさび形のいくつかの拘束チャネルの回転配置は、手動の尾び切断のためのスペースを確保しながら近接性を最適化し、負傷直後のイメージングと、同じ視野内の複数の負傷したゼブラフィッシュ胚の同時長期イメージングに対応します。さらに、この構築方法により、再利用性を維持しながら、初期資本コストとデバイス構築に必要な時間を大幅に削減できます。

プロトコル

この研究では、受精後3日(dpf)の胚を使用しましたが、2〜14個のdpf胚を使用するように設計できます。ゼブラフィッシュの実験は、国際的に認められた基準で行われました。動物の管理と使用に関するプロトコルは、パデュー大学動物管理・使用委員会(PACUC)によって承認され、NIHの学内研究プログラムにおけるゼブラフィッシュの使用に関するガイドライン(プロトコル番号:1401001018)に準拠しています。

1. PETマイクロ流体デバイスの組み立て

注:このプロトコルの任意の部分は、シアノアクリレートの乾燥時間に敏感なステップ1.8および1.9を除いて、いつでも一時停止することができます。

1. 選択したソフトウェア(Adobe Illustrator、 図1Aなど)でデバイスのパターンを設計します。胚の年齢とサイズに応じて、チャネルの幅と中央イメージングチャンバーのサイズを調整して、最適にフィットさせます。
   1. 各レイヤーを同じ寸法の個別の画像ファイルとして保存します。使用するシートの厚さと組み立ての順序が明確になるように、各ファイルに名前を付けます。
2. メーカーの指示に従って切断機を初期化します。
3. デザインした各パターンをデザインソフトウェアにアップロードしてカットします。
   1. デザイン ワークスペースで、新しくアップロードしたデザインを選択します。同じ厚さのPETシートを対象としたパターンを、同じカットでグループ化します(図2A)。必要に応じて、デザインソフトウェアでパターンのサイズを正しい寸法に再調整します。
   2. カットのパターンの数と種類を確認し、カットした素材を選択します。
      注:PETシートは、「プラスチックラミネートポーチ」などの名前で設計ソフトウェアに選択されていない場合があります。代わりに、厚さと質感が類似している任意の材料(透明シートや非粘着性ビニールなど)を選択できます。
   3. PETシートをカッティングマットに貼り付け、しっかりと押して気泡を取り除き、マットをカッティングマシンにセットします。画面の指示に従って、カッティングマシンにカットを開始するように促します。
   4. カッティングマットから完成したカットを取り除きます。必要に応じて、クラフトナイフやメスの刃を使ってカットパターンを調整します。
      注:RADISHデザインの作成に使用された画像ファイル(図1A)は、ベクターおよびPNGファイル形式(補足ファイル1)としてダウンロードできます。切断機がPETシートを持ち上げたり、引き裂いたり、きれいに切断できない場合は、切断マットの交換を検討してください。
4. カバーガラスにレイヤーを位置合わせします、補助なしまたは事前にカットされたレジストレーションマークで。ラミネート前に複数の層を一緒に固定できる場合は、それらを同時に位置合わせします。
5. ラミネート中にずれないように、層をオフィステープで固定します(図2B)。デバイスのサイズとラミネーターの容量に応じて、ラミネーターフィードの詰まりや目詰まりを防ぐために、小さなデザインをより大きなバッキングにテープで取り付けます(図2C)。
   注:ラミネートに使用されるバッキングはカッティングマットと同じではなく、主にラミネーターに牽引力を提供する役割を果たします。厚さがごくわずかの耐熱材料は、裏地として機能します(厚紙、折りたたまれた事務用紙、またはより大きなPETシートを含むがこれらに限定されない)。
6. ラミネーターの電源を入れ、製造元の指示に従ってラミネートします。次のレイヤーを位置合わせする前に、オフィステープをはがします(図2D)。
7. 手順1.4から1.6を繰り返して、すべてのレイヤーが接着されるまで繰り返します。
8. シアノアクリレート接着剤を使用して35/3インチの穴を開けた4mmの皿にデバイスを固定します(図2E、F)。実験的なニーズに応じて、ディッシュの形状とタイプを調整します(例えば、デバイスを収容するのに十分な大きさの容器、つまり24ウェルプレートの1ウェルまたはより大きなシャーレ)。デバイスを皿に完全に密封するために、十分な接着剤を使用してください。
   注意: デバイスの機能のために、デバイスを保持皿に固定する必要はありません。注意:シアノアクリレートは数秒で皮膚と目を結合し、呼吸器系、目、皮膚を刺激します。手と目の保護具を着用し、換気の良い場所で作業してください。
9. デバイスの外側の端をシアノアクリレート接着剤で完全にコーティングすることにより、PETラミネートを防水します(図2F)。外縁を完全に覆うのに十分な接着剤を使用します。使用する前に、接着剤を少なくとも2時間硬化させます。
   注: シアノアクリレートの煙が排出するための十分なスペースを確保してください。 煙が蓄積すると、シアノアクリレートがデバイスに堆積し、光学的に透明な材料が見えなくなる可能性があります。

2. 大根内の胚の位置決めとイメージングの準備

1. ゼブラフィッシュの胚を標準的な胚飼育培地E3¹⁹で育てます。必要に応じて、イメージングの少なくとも1時間前に胚をデコリオネートして、平らにします。この実験では3dpfの胚を使用しましたが、胚は最大14dpfにすることができます(図1E)。
2. 実験の必要性に応じて胚を染色または治療します。
   注:これらの実験では、外側上皮層の細胞膜を、関連する場所で100 nM MemGlow 560とインキュベートすることにより染色しました。
3. 164 mg/L MS-222 を使用して胚を麻酔する²⁰.
   注:使用される正確な濃度と麻酔薬は、実験者の好みに応じて調整できます。麻酔薬の濃度を下げることで、長期画像の開発を成功させることができます(ステップ4.1を参照)。
4. 装着したデバイスが入ったホールディングディッシュに、164 mg/L MS-222 を含む E3 5 mL を入れます。
5. トランスファーピペットを使用して、麻酔をかけた胚を装置の各保持室に1個ずつ沈殿させます。イメージング中は、胚が液体に沈んだままであることを確認してください。
   注:大根のデザインは、1〜4個の胚を固定することができます。
6. ヘアループを使用して、胚の尾が中央のイメージングチャンバーに突き出ており、卵黄がくさび形のチャネルにしっかりと固定されるように、胚を向けます(図1C)。
   注:胚の配向は、操作を容易にするために実体顕微鏡下で行うことができます。
7. 必要に応じて、マイクロピペットを使用して1.5%低溶解アガロースを保持チャンバーに追加して、胚の頭部を固定します。
8. 胚のあるデバイスを選択したイメージングシステムに移動して、イメージングを開始します。

3. 創傷後のカルシウム過渡現象のイメージング

注:このセクションとセクション4はオプションであり、サンプル実験の候補として提供されています。

1. イメージングに適したシステムと対物レンズを選択します。
   注:ここでは、逆レーザー走査型共焦点に20倍の対物レンズが装備されています。
2. サンプルのフォーカスとイメージングパラメータ( レーザー出力:5、 ゲイン:90、 ピンホールサイズ:2 AU、露光時間[スキャン速度:1フレーム/秒]など)を調整して、最適な信号対雑音比と取得速度を実現します。
   注:創傷形成と画像取得の間の遅延を減らすために、サンプルを事前に焦点を合わせ、選択したイメージングシステムの各チャネルのパラメータを 創傷前に 調整することをお勧めします。
3. Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)^{xt18 21,22}胚を創傷。
   1. 手動離死によって胚を創傷するには、実体顕微鏡で脊索の先端にある尾びれ組織全体にメスの刃で圧力を加え(ビデオ1)、次にデバイスをステージに戻します。
      注意: メスの刃で過度の圧力をかけると、下にあるガラスにひびが入る可能性があります。ガラスにひびが入った場合は、デバイスを廃棄し、手順1.2から再開します。
   2. レーザー刺激によって胚を創傷するには、尾びれの折り目の端の近くに関心領域(ROI)を定義し、利用可能なレーザー出力に応じて刺激します。
      注:ここでは、800 nmで30秒間2.4 Wのレーザー出力で、全層創傷を誘発するのに十分でした。
4. GFP(励起488nm、発光510nm)およびRFP(励起561nm、発光610nm)チャネルを用いて室温で、フレーム間隔1分、合計1時間で画像化。
5. (オプション):必要に応じて、トランスファーピペットを使用して頭部付近を優しく吸引するか、皿を回転させてイメージングした後、胚を取り出します。

4. 創傷後の好中球動員のイメージング

1. イメージングの少なくとも1時間前に、胚を標準濃度の半分の麻酔薬(この場合は82 mg / L MS-222)を含むE3に移します。
2. イメージングに適した対物レンズを選択します(ここでは、10倍対物レンズを装備した倒立レーザー走査型共焦点)。
3. サンプルの焦点とイメージングパラメータ( レーザー出力:5、 ゲイン:90、ピンホールサイズ:2 AU、露光時間 [スキャン速度:0.5 frame/s])を調整して、最適な信号対雑音比と取得速度を実現します。
   注:創傷形成と画像取得の間の遅延を減らすために、サンプルを事前に焦点を合わせ、選択したイメージングシステムの各チャネルのパラメータを 創傷前に 調整することをお勧めします。
4. 実体顕微鏡で尾びれ組織全体にメスの刃で圧力を加えることにより、手動切断により4つの Tol2(mpx:Dendra2)²³ 胚を創傷し、その後、デバイスをステージに戻します。
5. GFP(励起488nm、発光510nm)チャネルの室温で、5分間のフレーム間隔で24時間撮影します。
6. 必要に応じて、転写ピペットを使用して頭部付近を穏やかに吸引するか、または皿を回転させてイメージングした後、胚を取り出します。

結果

レーザー走査型共焦点をRADISHの有無で作製した画質を比較するため、インテンシオメトリックカルシウムバイオセンサーGCaMP6f^22,24を外側上皮層に発現する胚をMemGlow 560で染色し、尾びれの全体の厚さを覆う逆レーザー走査型共焦点で1フレームあたり1分間隔でイメージングしました(動画2)。デバイスを使用しない場合(図3A)、デバイスを使用したイメージングと比較して、Zスタックを指定された時間分解能内に収まるようにZスタックを25スライスに制限した結果、サンプルが大幅にドリフトし、バンディングアーティファクトが見られました(図3B)。さらに、Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)^xt1821を発現する胚の創傷直後のカルシウム過渡現象を調べるために大根を使用し、内因性E-カドヘリンを赤で、頂端上皮の細胞質カルシウムを緑で強調した。胚は、メスの刃(図4Aおよびビデオ3)またはIRレーザーによる直接レーザーアブレーション(図4B)を使用して中央チャンバーの側面と平行に損傷を与え、その後、尾びれの折り目の全厚さを通して画像化しました。

大根の長期イメージングの有効性を実証するために、創傷後24時間、創傷端への免疫細胞の動員を調査しました。3 dpfのゼブラフィッシュ胚4個、Tol2(mpx:Dendra2)を発現して好中球を緑色²³で標識するために、尾部離断により損傷を受け、24時間連続して画像化しました(図5)。傾きや浮遊など、通常3dpfから4dpfの胚に関連するイメージングアーチファクトは著しく欠如しており(ビデオ4)、実験では組織の再成長が妨げられることなく継続されました。創傷縁への好中球動員は画像全体を通して継続し(図5B)、ほとんどの遊走細胞は創傷後24時間までに離脱し(図5C)、予想される炎症の解消^{と一致します25,26}。

図1:PETラミネートマイクロ流体デバイス(RADISH)の設計と使用 (A)個々のPET層の配置と厚さ、組み立て、デバイスの取り付けと使用を示す概略図。(B)最終製品、35mmの皿の3/4インチのカットアウトに取り付けられています。(C)3 dpf胚、(D)5 dpf胚、(E)14 dpf胚をデバイス内に収容。スケールバー = 1,000 μm (C,D,E)。略語:PET =ポリエチレンテレフタレート。RADISH = その後の治癒のダニオイメージングのための回転アシスタント。dpf = 受精後日数。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:PETデバイスアセンブリのステップバイステップの写真イラスト(A)ラミネート前の個々のPET層。(B)オフィステープを使用して25mmのカバーガラスに固定されたPET層。(C)ラミネート用のプラスチックバッキングに固定された進行中のデバイス。(D)完成したPETラミネート装置。(E)デバイス取り付け前の35mmディッシュを変更。(F)完成したデバイス。略語:PET=ポリエチレンテレフタレート。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:RADISHデザインにおける3 dpf胚のレーザー走査型共焦点画像の品質向上 (A)RADISHを使用せずにMemGlow 560で染色した3 dpf Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) 胚の代表画像。(B)ラディッシュにマウントしたMemGlow 560で染色した Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) 胚の代表画像。スケールバー = 100 μm。略語:RADISH =その後の治癒のダニオイメージングのための回転アシスタント。dpf = 受精後日数。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:RADISH設計と複数の創傷技術との互換性。 (A) 3 dpf Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)^xt18 胚は、手動尾びれ離断によって負傷した。(B)レーザーアブレーションによって負傷した胚。(C,D)同じ胚が4分後に現れ、傷害後のカルシウム過渡現象の進行を示しています。スケールバー = 100 μm。略語:RADISH =その後の治癒のダニオイメージングのための回転アシスタント。dpf = 受精後日数。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:食細胞遊走のイメージングのための胚の長期捕捉。 (A) Tol2(mpx:Dendra2) 胚は創傷直後、同じ胚は(B)25分後、(C)12時間後、(D)24時間後。スケールバー = 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:図1Aに示すように、RADISHデバイス設計用のベクターファイルとPNGファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ビデオ1:RADISHデバイス設計を使用した手動尾フィン切断の明視野ビデオ。 略語:RADISH = その後の治癒のダニオイメージングのための回転アシスタント。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ビデオ2:図3の非マウント3 dpf Tg(krt4:Gal4、UAS:GCaMP6f)胚の非マウント胚とマウントされた3 dpf Tg(krt4:Gal4、UAS:GCaMP6f)胚の比較、1フレーム/分で取得。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ビデオ3:図4のメス切断またはレーザーアブレーションによって負傷したTg(krt4:Gal4、UAS:GCaMP6f)x (cdh1-dTomato)^xt18胚のカルシウム過渡現象、1フレーム/分で取得。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

動画4:Tol2(mpx:Dendra2)胚における白血球動員と尾びれ再生の長期イメージング 略語:RADISH =その後の治癒のダニオイメージングのための回転アシスタント。HPW = 負傷後数時間。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

PETラミネート法の大前提は、ソフトリソグラフィーやPDMS成形などの従来のマイクロ流体デバイス作成手段と比較して、コスト削減と技術的な参入障壁の最小化です。そのため、このプロトコルで重要なステップは、ラミネート加工中のPET層の正確な位置合わせと、施工後のデバイスエッジの防水加工だけです。方法の他のすべての部分は、実験的ニーズに応じて変更することができる(例えば、若年または高齢の胚の固定化が必要な場合、PET層の厚さを調整して、それに応じてチャネルを狭くまたは広げることができる)。デザインは、材料が熱に安全で、ラミネ^{ーター18,27}を介して送られるのに十分な薄さである限り、任意の形状で作成し、任意の基材にラミネートすることができます。PETシートは、3次元ではなく2次元の画像ファイルを読み取る市販のクラフトカッターを使用してカットされるため、任意のデバイスの設計と反復は、画像編集プログラムで白黒の形状を操作する機能のみを必要とし、難易度が劇的に低下します。このソフトウェア選択の柔軟性と使用される材料の商業的利用可能性は、一般的なマイクロ流体デバイスのアクセシビリティの劇的な増加を表しており、PDMS金型製造¹⁷の開始機器コストが2000ドル以上であるのに対し、この論文の執筆時点では500ドル未満の初期費用で、あらゆる研究室や教室での使用を可能にしています。

さらに、この方法を使用して単一の使用可能なデバイスを作成するのに必要な時間は、一般的なソフトリソグラフィーと比較して大幅に短縮されます。必要なソフトウェアに精通していると仮定すると、1つのユニークなPETラミネートマイクロ流体デバイスを概念化、製造し、シアノアクリレートの硬化時間 を含め て~3時間ですぐに使用できます。元の設計ファイルに必要な編集の規模にもよりますが、イテレーションにかかる時間はさらに少なく、追加の時間投資を最小限に抑え、追加の機器を必要とせずに、複数のバリアントデバイスを並行して作成できます。この方法を使用して作成されたデバイスは、さまざまな理由(接着不良や、多くの層を持つ形状や長いアスペクト比の形状に対する内部応力など)により、PDMSで作成されたデバイスよりも耐久性が低くなりますが、その安価な性質とスケーラブルな製造により、はるかに簡単に交換できます。商業クラフトカッターは、同じ正確なカットを何度も繰り返す能力で販売されており、PETには有効期限がないため、完成したデザインの個々のレイヤーを事前にまとめて準備して、将来の任意の時点で組み立てて使用することができ、必要な全体的な時間投資をさらに削減できます。

ただし、速度と変動性には精度が犠牲になります。従来のPDMS成形と比較したPETラミネートの主な制限は、空間分解能です。市販のクラフトカッターは、約500μm未満の形状の鋭角に苦戦することが多く、PETラミネートシートは33μm以下の厚さ(パッケージ上の寸法に含まない接着剤自体の厚さを含まない)では入手できないため、この手法を適用できるスケールは大幅に制限されます。また、最大層数はラミネーターのサイズによっても制限され、メーカーによって異なる場合があります。

レジストレーションとアライメント技術、材料サプライヤー、ソフトウェアのバリエーションを含むプロトコルの最終バージョンは、ユーザーの好みに大きく依存します。しかし、この手法のアクセシビリティと全体的な柔軟性により、適応のコストを削減できます。個々のユーザーは、独自のニーズに合わせてアプローチを適応させるために、必要なだけ反復することをお勧めします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
直径25mmの丸いカバーガラス#1	Chemglass Life Sciences	CLS-1760-025	取り付け材料。厚さは顕微鏡レンズの仕様に基づいて選択されました。
Adobe Illustrator v28.5	デバイスパターンをデザインするための	Adobe	N / A
塩化カルシウム二水和物	フィ	ッシャーC79E3	培地を作るため。
デザインPNGファイル(オンラインミラー)	N/A	N/A	br/> https://i.ibb.co/FDpQYXc/multipositionalv7-2.png https://i.ibb.co/5TG4SB6/multipositionalv7-3.png
Design Space for Desktop v8.39	Cricut	N/A	クラフトカッターを駆動するための独自のソフトウェア。
Fusion Plus 7000L	GBC	1703098	サーマルラミネーター。この特定のモデルは、最大シートスタックサイズなどの生活の質の機能のために選択されました。
ドイツの超硬プレミアムブレード	Cricut	10396595	クラフトカッター用の交換用ブレード。
グレーベーシックツールセット	Cricut	10307854	刈り取り、マットのクリーニング、PETシートの取り付け用のツールセットです。オプション。
塩化マグネシウム六水和物	アクロス有機	223211000	E3培地を作るため。
メーカー3	Cricut	10669040	Craftカッター。Cricut Maker 3 は、ソフトウェアの使いやすさのために Silhouette Cameo 4 よりも選択されましたが、白黒画像を読み取ることができるクラフト カッターであれば何でも機能します。
MemGlow 560	細胞骨格	MG02-10	細胞膜用の赤色生細胞色素。洗濯は不要です。図3で使用。
No. 22 カーボンメスブレード	ジカルデザイン	22-079-697	カット調整用のメスブレード。同様のクラフトナイフ(X-acto #2ナイフなど)も機能します。
塩化カリウム	フィッシャーBP366E3		媒体の製造用。
塩化ナトリウム	ッシャーBP358E3	媒体を作るため。
StandardGrip 粘着カッティングマット	Cricut	10138842	クラフトカッター用取り付けマット。LightGrip カッティング マットも機能しますが、除草や除去中に接着剤の強度により最終的なカットが反る可能性があるため、StrongGrip および FabricGrip カッティング マットは避けてください。マットの接着剤は、使用を続けると最終的には摩耗します。必要に応じてマットを交換します。
ステーショナリーテープ 12 mm	Deli	30014	オフィステープ。デリブランドは、ラミネート後の取り外しの容易さについてテストによって選択されました。
瞬間接着剤、液体	ロックタイト	1364076	シアノアクリレート接着剤。<強力>使用する接着剤は液体でなければなりません。ゲル配合物は、デバイスのエッジを十分に密閉または防水しません。
PETサーマルラミネートポーチ、3ミル	コッチ	TP3854	PETシート、熱接着剤付き。シーツはサンドイッチされたペアとして届くため、使用前に分離する必要があります。粘着面を下にしてカットします。
PETサーマルラミネートパウチ、5ミル	コッチ	TP5854	PETシート、熱接着剤付き。シーツはサンドイッチされたペアとして届くため、使用前に分離する必要があります。粘着面を下にしてカットします。
トリカイン (MS-222)	シンデル	IC10310680	魚の麻酔薬。