このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

低コストポリエチレンテレフタレートラミネートラミネートマイクロ流体工学による多重ゼブラフィッシュイメージングのための設計

1.2K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/67313

⸱

2024年9月27日

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Purdue University, 2Bindley Bioscience Center, Purdue University, 3Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Notre Dame, 4Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

この記事について

サマリー

ポリエチレンテレフタレート(PET)ラミネートを用いたマイクロ流体デバイスの革新的な作製方法により、複数の生きたゼブラフィッシュ胚の捕捉とイメージングのコストと複雑さが大幅に軽減されます。

要約

ゼブラフィッシュの胚は透明であるため、創傷治癒や免疫細胞の遊走などの基本的なプロセスの非侵襲的な生体内イメージングに独自の適しています。マイクロ流体デバイスは、ゼブラフィッシュを含む多細胞生物の長期イメージングをサポートするための捕獲に使用されます。しかし、ソフトリソグラフィーを使用してこれらのデバイスを製造するには、3Dプリンティングの専門的な設備と能力が必要であり、すべてのラボがアクセスできるわけではありません。以前に開発された低コストのポリエチレンテレフタレートラミネートラミネート法をマイクロ流体デバイスの構築に採用したことで、従来の技術のわずかな技術投資で設計の製作と反復が可能になり、アクセシビリティが向上します。この方法で作られたデバイスであるRotational Assistant for Danio Imaging of Subsequent Healing(RADISH)を使用して、薬物治療、手動創傷、および同じ視野で最大4つの胚の長期イメージングに対応します。この新しい設計により、損傷直後の2時間における複数の胚のレーザーアブレーションおよび手動切断創傷の周囲のカルシウム信号の全体的な形態学的特性、および24時間の創傷縁への好中球動員をうまく捉えることができます。

概要

損傷に適切に対応する能力は、単一の細胞から複数の組織まで、あらゆるスケールですべての生物が生存するために重要です。したがって、損傷領域1への食細胞の動員など、創傷とそれに関連する応答は、細胞および組織生物学における重要なトピックです。創傷は、組織バリアが破られた直後に感知され、創傷治癒とその後の再成長4を調整する創傷収縮2,3を含む組織勾配応答を引き起こします。この収縮の機械的性質のため、実験中に使用されるツールは、損傷部位の近くの細胞の動きを物理的に妨げてはなりません。

ゼブラフィッシュの胚は、その手入れの容易さ、遺伝的な扱いやすさ、および光学的透明性5,6により、脊椎動物の創傷反応を含む発生と疾患を研究するための優れたモデルです。しかし、損傷部位の近くの細胞の長期的な挙動を研究するためには、生物全体を長期間固定化する必要があります。低融点アガロースに胚を埋め込むだけで、無傷組織の短期イメージングには十分です。しかし、周囲のゲルマトリックスは、創傷の収縮および弛緩を制限し、経時的に発生中の胚の成長を妨げる7,8,9。

マイクロ流体デバイスは、さまざまな発生段階10、11、12、13、14、15、16でゼブラフィッシュの胚を固定することができ、zWEDGI7などの一部は手動傷害に対応します。ただし、利用可能なデバイス設計にはいくつかの欠点があります。例えば、プラスチックに直接プリントされた多くのデバイスは、光学的透過性が低いため、倒立顕微鏡システムでのイメージングと互換性がありません。さらに、パラレルチャンネルはマルチポジションイメージング10,11を可能にするが、顕微鏡ステージの物理的な動きは画像取得に遅延をもたらす。これらの問題を解決するために反復と最適化を繰り返すことは、特にポリジメチルシロキサン(PDMS)ソフトリソグラフィーを使用した現在のゴールドスタンダードのデバイス製造方法において、すべての新しい設計に必要な財政的および技術的投資を考慮すると困難です。最初のステップであるマスター金型の作成には、多くの場合、3Dモデリングソフトウェアの知識、専用の製造機器へのアクセス、および(使用する材料によっては)金型を使用する前にシラン化などの追加の接着防止処理が必要です。一度注がれたPDMSの硬化には、高温で少なくとも1時間かかり、一般的には、最良の結果を得るためには、真空下またはクランプを使用して、多くの場合、クリーンルームで行う必要があります7,17,18。発生生物学と同様に、これらのコストは、複数のモデルにまたがる多くのユニークなマイクロ流体環境を必要とする実験にとって、急速に法外なものになる可能性があります。

利用可能な代替建材の中で、ポリエチレンテレフタレート(PET)は耐久性があり、毒性がなく、操作が容易です。PETシートは、ほとんどの事務用品店で取り扱っているプラスチックラミネートポーチで、熱活性化接着剤(一般的にはエチレン酢酸ビニル)があらかじめ塗布されています。これらのPETシートを市販のクラフトカッター(ホームクラフター向けに設計されたコンピュータ制御のカッティングプロッター)で成形し、標準的な熱ラミネート装置で層同士を密着させることで、さまざまなデザインを迅速に生成し、反復することができます。したがって、我々は、スタックPET18を含む前述の設計および建設方法を採用して、Subsequent Healing(RADISH)のDanio Imaging用のRotational Assistantを作成しました(図1A、B)。ほぼくさび形のいくつかの拘束チャネルの回転配置は、手動の尾び切断のためのスペースを確保しながら近接性を最適化し、負傷直後のイメージングと、同じ視野内の複数の負傷したゼブラフィッシュ胚の同時長期イメージングに対応します。さらに、この構築方法により、再利用性を維持しながら、初期資本コストとデバイス構築に必要な時間を大幅に削減できます。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

この研究では、受精後3日(dpf)の胚を使用しましたが、2〜14個のdpf胚を使用するように設計できます。ゼブラフィッシュの実験は、国際的に認められた基準で行われました。動物の管理と使用に関するプロトコルは、パデュー大学動物管理・使用委員会(PACUC)によって承認され、NIHの学内研究プログラムにおけるゼブラフィッシュの使用に関するガイドライン(プロトコル番号:1401001018)に準拠しています。

1. PETマイクロ流体デバイスの組み立て

注:このプロトコルの任意の部分は、シアノアクリレートの乾燥時間に敏感なステップ1.8および1.9を除いて、いつでも一時停止することができます。

  1. 選択したソフトウェア(Adobe Illustrator、 図1Aなど)でデバイスのパターンを設計します。胚の年齢とサイズに応じて、チャネルの幅と中央イメージングチャンバーのサイズを調整して、最適にフィットさせます。
    1. 各レイヤーを同じ寸法の個別の画像ファイルとして保存します。使用するシートの厚さと組み立ての順序が明確になるように、各ファイルに名前を付けます。
  2. メーカーの指示に従って切断機を初期化します。
  3. デザインした各パターンをデザインソフトウェアにアップロードしてカットします。
    1. デザイン ワークスペースで、新しくアップロードしたデザインを選択します。同じ厚さのPETシートを対象としたパターンを、同じカットでグループ化します(図2A)。必要に応じて、デザインソフトウェアでパターンのサイズを正しい寸法に再調整します。
    2. カットのパターンの数と種類を確認し、カットした素材を選択します。
      注:PETシートは、「プラスチックラミネートポーチ」などの名前で設計ソフトウェアに選択されていない場合があります。代わりに、厚さと質感が類似している任意の材料(透明シートや非粘着性ビニールなど)を選択できます。
    3. PETシートをカッティングマットに貼り付け、しっかりと押して気泡を取り除き、マットをカッティングマシンにセットします。画面の指示に従って、カッティングマシンにカットを開始するように促します。
    4. カッティングマットから完成したカットを取り除きます。必要に応じて、クラフトナイフやメスの刃を使ってカットパターンを調整します。
      注:RADISHデザインの作成に使用された画像ファイル(図1A)は、ベクターおよびPNGファイル形式(補足ファイル1)としてダウンロードできます。切断機がPETシートを持ち上げたり、引き裂いたり、きれいに切断できない場合は、切断マットの交換を検討してください。
  4. カバーガラスにレイヤーを位置合わせします、補助なしまたは事前にカットされたレジストレーションマークで。ラミネート前に複数の層を一緒に固定できる場合は、それらを同時に位置合わせします。
  5. ラミネート中にずれないように、層をオフィステープで固定します(図2B)。デバイスのサイズとラミネーターの容量に応じて、ラミネーターフィードの詰まりや目詰まりを防ぐために、小さなデザインをより大きなバッキングにテープで取り付けます(図2C)。
    注:ラミネートに使用されるバッキングはカッティングマットと同じではなく、主にラミネーターに牽引力を提供する役割を果たします。厚さがごくわずかの耐熱材料は、裏地として機能します(厚紙、折りたたまれた事務用紙、またはより大きなPETシートを含むがこれらに限定されない)。
  6. ラミネーターの電源を入れ、製造元の指示に従ってラミネートします。次のレイヤーを位置合わせする前に、オフィステープをはがします(図2D)。
  7. 手順1.4から1.6を繰り返して、すべてのレイヤーが接着されるまで繰り返します。
  8. シアノアクリレート接着剤を使用して35/3インチの穴を開けた4mmの皿にデバイスを固定します(図2E、F)。実験的なニーズに応じて、ディッシュの形状とタイプを調整します(例えば、デバイスを収容するのに十分な大きさの容器、つまり24ウェルプレートの1ウェルまたはより大きなシャーレ)。デバイスを皿に完全に密封するために、十分な接着剤を使用してください。
    注意: デバイスの機能のために、デバイスを保持皿に固定する必要はありません。注意:シアノアクリレートは数秒で皮膚と目を結合し、呼吸器系、目、皮膚を刺激します。手と目の保護具を着用し、換気の良い場所で作業してください。
  9. デバイスの外側の端をシアノアクリレート接着剤で完全にコーティングすることにより、PETラミネートを防水します(図2F)。外縁を完全に覆うのに十分な接着剤を使用します。使用する前に、接着剤を少なくとも2時間硬化させます。
    注: シアノアクリレートの煙が排出するための十分なスペースを確保してください。 煙が蓄積すると、シアノアクリレートがデバイスに堆積し、光学的に透明な材料が見えなくなる可能性があります。

2. 大根内の胚の位置決めとイメージングの準備

  1. ゼブラフィッシュの胚を標準的な胚飼育培地E319で育てます。必要に応じて、イメージングの少なくとも1時間前に胚をデコリオネートして、平らにします。この実験では3dpfの胚を使用しましたが、胚は最大14dpfにすることができます(図1E)。
  2. 実験の必要性に応じて胚を染色または治療します。
    注:これらの実験では、外側上皮層の細胞膜を、関連する場所で100 nM MemGlow 560とインキュベートすることにより染色しました。
  3. 164 mg/L MS-222 を使用して胚を麻酔する20.
    注:使用される正確な濃度と麻酔薬は、実験者の好みに応じて調整できます。麻酔薬の濃度を下げることで、長期画像の開発を成功させることができます(ステップ4.1を参照)。
  4. 装着したデバイスが入ったホールディングディッシュに、164 mg/L MS-222 を含む E3 5 mL を入れます。
  5. トランスファーピペットを使用して、麻酔をかけた胚を装置の各保持室に1個ずつ沈殿させます。イメージング中は、胚が液体に沈んだままであることを確認してください。
    注:大根のデザインは、1〜4個の胚を固定することができます。
  6. ヘアループを使用して、胚の尾が中央のイメージングチャンバーに突き出ており、卵黄がくさび形のチャネルにしっかりと固定されるように、胚を向けます(図1C)。
    注:胚の配向は、操作を容易にするために実体顕微鏡下で行うことができます。
  7. 必要に応じて、マイクロピペットを使用して1.5%低溶解アガロースを保持チャンバーに追加して、胚の頭部を固定します。
  8. 胚のあるデバイスを選択したイメージングシステムに移動して、イメージングを開始します。

3. 創傷後のカルシウム過渡現象のイメージング

注:このセクションとセクション4はオプションであり、サンプル実験の候補として提供されています。

  1. イメージングに適したシステムと対物レンズを選択します。
    注:ここでは、逆レーザー走査型共焦点に20倍の対物レンズが装備されています。
  2. サンプルのフォーカスとイメージングパラメータ( レーザー出力:5、 ゲイン:90、 ピンホールサイズ:2 AU、露光時間[スキャン速度:1フレーム/秒]など)を調整して、最適な信号対雑音比と取得速度を実現します。
    注:創傷形成と画像取得の間の遅延を減らすために、サンプルを事前に焦点を合わせ、選択したイメージングシステムの各チャネルのパラメータを 創傷前に 調整することをお勧めします。
  3. Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)xt18 21,22胚を創傷。
    1. 手動離死によって胚を創傷するには、実体顕微鏡で脊索の先端にある尾びれ組織全体にメスの刃で圧力を加え(ビデオ1)、次にデバイスをステージに戻します。
      注意: メスの刃で過度の圧力をかけると、下にあるガラスにひびが入る可能性があります。ガラスにひびが入った場合は、デバイスを廃棄し、手順1.2から再開します。
    2. レーザー刺激によって胚を創傷するには、尾びれの折り目の端の近くに関心領域(ROI)を定義し、利用可能なレーザー出力に応じて刺激します。
      注:ここでは、800 nmで30秒間2.4 Wのレーザー出力で、全層創傷を誘発するのに十分でした。
  4. GFP(励起488nm、発光510nm)およびRFP(励起561nm、発光610nm)チャネルを用いて室温で、フレーム間隔1分、合計1時間で画像化。
  5. (オプション):必要に応じて、トランスファーピペットを使用して頭部付近を優しく吸引するか、皿を回転させてイメージングした後、胚を取り出します。

4. 創傷後の好中球動員のイメージング

  1. イメージングの少なくとも1時間前に、胚を標準濃度の半分の麻酔薬(この場合は82 mg / L MS-222)を含むE3に移します。
  2. イメージングに適した対物レンズを選択します(ここでは、10倍対物レンズを装備した倒立レーザー走査型共焦点)。
  3. サンプルの焦点とイメージングパラメータ( レーザー出力:5、 ゲイン:90、ピンホールサイズ:2 AU、露光時間 [スキャン速度:0.5 frame/s])を調整して、最適な信号対雑音比と取得速度を実現します。
    注:創傷形成と画像取得の間の遅延を減らすために、サンプルを事前に焦点を合わせ、選択したイメージングシステムの各チャネルのパラメータを 創傷前に 調整することをお勧めします。
  4. 実体顕微鏡で尾びれ組織全体にメスの刃で圧力を加えることにより、手動切断により4つの Tol2(mpx:Dendra2)23 胚を創傷し、その後、デバイスをステージに戻します。
  5. GFP(励起488nm、発光510nm)チャネルの室温で、5分間のフレーム間隔で24時間撮影します。
  6. 必要に応じて、転写ピペットを使用して頭部付近を穏やかに吸引するか、または皿を回転させてイメージングした後、胚を取り出します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

レーザー走査型共焦点をRADISHの有無で作製した画質を比較するため、インテンシオメトリックカルシウムバイオセンサーGCaMP6f22,24を外側上皮層に発現する胚をMemGlow 560で染色し、尾びれの全体の厚さを覆う逆レーザー走査型共焦点で1フレームあたり1分間隔でイメージングしました(動画2)。デバイスを使用しない場合(図3A)、デバイスを使用したイメージングと比較して、Zスタックを指定された時間分解能内に収まるようにZスタックを25スライスに制限した結果、サンプルが大幅にドリフトし、バンディングアーティファクトが見られました(図3B)。さらに、Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)xt1821を発現する胚の創...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

PETラミネート法の大前提は、ソフトリソグラフィーやPDMS成形などの従来のマイクロ流体デバイス作成手段と比較して、コスト削減と技術的な参入障壁の最小化です。そのため、このプロトコルで重要なステップは、ラミネート加工中のPET層の正確な位置合わせと、施工後のデバイスエッジの防水加工だけです。方法の他のすべての部分は、実験的ニーズに応じて変更することができる(例えば、若年または高齢の胚の固定化が必要な場合、PET層の厚さを調整して、それに応じてチャネルを狭くまたは広げることができる)。デザインは、材料が熱に安全で、ラミネーター18,27を介して送られるのに十分な薄さである限り、任意の形状で作成し、任意の基材にラミネートすることができます。PETシートは、3次元ではなく2次元の画像ファイルを読み取る市販のクラフトカッターを使用してカットされるため、任意のデバイスの設計と反復は、画像編集プログラムで白黒の形状を操作する機能のみを必要とし、難易度が劇的に低下しま...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

この研究は、国立衛生研究所(R35GM119787からQD)からの研究資金提供によって支援されました。この研究は、全米科学財団(NSF)の生物学統合研究所であるEMBRIO Institute(NSF契約#2120200)の支援を受けた取り組みに基づいています。共焦点イメージングは、Purdue Imaging Facilityで実施しました。Tg(UAS:GCaMP6f)ラインを提供してくださったGuangjun Zhang博士(パデュー大学)に感謝します。(cdh1-tdtomato)xt18ラインを提供してくださったDavid Tobin博士(デューク大学)に感謝します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
直径25mmの丸いカバーガラス#1Chemglass Life SciencesCLS-1760-025取り付け材料。厚さは顕微鏡レンズの仕様に基づいて選択されました。
Adobe Illustrator v28.5デバイスパターンをデザインするためのAdobeN / A
塩化カルシウム二水和物フィッシャーC79E3培地を作るため。
デザインPNGファイル(オンラインミラー)N/AN/Abr/> https://i.ibb.co/FDpQYXc/multipositionalv7-2.png
https://i.ibb.co/5TG4SB6/multipositionalv7-3.png
Design Space for Desktop v8.39CricutN/Aクラフトカッターを駆動するための独自のソフトウェア。
Fusion Plus 7000LGBC1703098サーマルラミネーター。この特定のモデルは、最大シートスタックサイズなどの生活の質の機能のために選択されました。
ドイツの超硬プレミアムブレードCricut10396595クラフトカッター用の交換用ブレード。
グレーベーシックツールセットCricut10307854刈り取り、マットのクリーニング、PETシートの取り付け用のツールセットです。オプション。 
塩化マグネシウム六水和物アクロス有機223211000E3培地を作るため。
メーカー3Cricut10669040Craftカッター。Cricut Maker 3 は、ソフトウェアの使いやすさのために Silhouette Cameo 4 よりも選択されましたが、白黒画像を読み取ることができるクラフト カッターであれば何でも機能します。
MemGlow 560細胞骨格MG02-10細胞膜用の赤色生細胞色素。洗濯は不要です。図3で使用。
No. 22 カーボンメスブレードジカルデザイン

22-079-697		カット調整用のメスブレード。同様のクラフトナイフ(X-acto #2ナイフなど)も機能します。
塩化カリウムフィッシャーBP366E3媒体の製造用。
塩化ナトリウムッシャーBP358E3媒体を作るため。
StandardGrip 粘着カッティングマットCricut10138842クラフトカッター用取り付けマット。LightGrip カッティング マットも機能しますが、除草や除去中に接着剤の強度により最終的なカットが反る可能性があるため、StrongGrip および FabricGrip カッティング マットは避けてください。マットの接着剤は、使用を続けると最終的には摩耗します。必要に応じてマットを交換します。
ステーショナリーテープ 12 mmDeli30014オフィステープ。デリブランドは、ラミネート後の取り外しの容易さについてテストによって選択されました。
瞬間接着剤、液体ロックタイト1364076シアノアクリレート接着剤。<強力>使用する接着剤は液体でなければなりません。ゲル配合物は、デバイスのエッジを十分に密閉または防水しません。
PETサーマルラミネートポーチ、3ミルコッチTP3854PETシート、熱接着剤付き。シーツはサンドイッチされたペアとして届くため、使用前に分離する必要があります。粘着面を下にしてカットします。
PETサーマルラミネートパウチ、5ミルコッチTP5854PETシート、熱接着剤付き。シーツはサンドイッチされたペアとして届くため、使用前に分離する必要があります。粘着面を下にしてカットします。
トリカイン (MS-222)シンデルIC10310680魚の麻酔薬。
厚さのベースベクターエディター。 https://i.ibb.co/QPYj7BL/multipositionalv7-1.png<サー手動フィスス

参考文献

  1. De Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse. Nat Rev Immunol. 16 (6), 378-391 (2016).
  2. Xu, S., Hsiao, T. I., Chisholm, A. D. The wounded worm. Worm. 1 (2), 134-138 (2012).
  3. Belacortu, Y., Paricio, N. Drosophila as a model of wound healing and tissue regeneration in vertebrates. Dev Dyn. 240 (11), 2379-2404 (2011).
  4. Yoo, S. K., Freisinger, C. M., LeBert, D. C., Huttenlocher, A. Early redox, Src family kinase, and calcium signaling integrate wound responses and tissue regeneration in zebrafish. J Cell Biol. 199 (2), 225-234 (2012).
  5. Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H. Early fin primordia of zebrafish larvae regenerate by a similar growth control mechanism with adult regeneration. Dev Dyn. 231 (4), 693-699 (2004).
  6. Gault, W. J., Enyedi, B., Niethammer, P. Osmotic surveillance mediates rapid wound closure through nucleotide release. J Cell Biol. 207 (6), 767-782 (2014).
  7. Huemer, K., et al. zWEDGI: Wounding and entrapment device for imaging live zebrafish larvae. Zebrafish. 14 (1), 42-50 (2017).
  8. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
  9. Hirsinger, E., Steventon, B. A versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development. J Vis Exp. (119), e55210(2017).
  10. Wielhouwer, E. M., et al. Zebrafish embryo development in a microfluidic flow-through system. Lab Chip. 11 (10), 1815-1824 (2011).
  11. Khalili, A., Rezai, P. Microfluidic devices for embryonic and larval zebrafish studies. Brief Funct Genomics. 18 (6), 419-432 (2019).
  12. Choudhury, D., et al. Fish and Chips: a microfluidic perfusion platform for monitoring zebrafish development. Lab Chip. 12 (5), 892-900 (2012).
  13. An integrated microfluidic system for zebrafish larva organs injection. Zhang, G., et al. Proceedings IECON 2017 - 43rd Annual Conference of the IEEE Industrial Electronics Society, 2017-January, , 8563-8566 (2017).
  14. Erickstad, M., Hale, L. A., Chalasani, S. H., Groisman, A. A microfluidic system for studying the behavior of zebrafish larvae under acute hypoxia. Lab Chip. 15 (3), 857-866 (2015).
  15. Mani, K., Hsieh, Y. C., Panigrahi, B., Chen, C. Y. A noninvasive light driven technique integrated microfluidics for zebrafish larvae transportation. Biomicrofluidics. 12 (2), 021101(2018).
  16. Lee, Y., Seo, H. W., Lee, K. J., Jang, J. W., Kim, S. A microfluidic system for stable and continuous EEG monitoring from multiple larval zebrafish. Sensors (Basel). 20 (20), 5903(2020).
  17. Sonnen, K. F., Merten, C. A. Microfluidics as an emerging precision tool in developmental biology. Dev Cell. 48 (3), 293-311 (2019).
  18. Levis, M., et al. Microfluidics on the fly: Inexpensive rapid fabrication of thermally laminated microfluidic devices for live imaging and multimodal perturbations of multicellular systems. Biomicrofluidics. 13 (2), 024111(2019).
  19. E3 medium (for zebrafish embryos). Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), (2011).
  20. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).
  21. Cronan, M. R., Tobin, D. M. Endogenous tagging at the cdh1 locus for live visualization of E-cadherin dynamics. Zebrafish. 16 (3), 324(2019).
  22. Thiele, T. R., Donovan, J. C., Baier, H. Descending control of swim posture by a midbrain nucleus in zebrafish. Neuron. 83 (3), 679-691 (2014).
  23. Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish. J Leukoc Biol. 89 (5), 661-667 (2011).
  24. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  25. Li, L., Yan, B., Shi, Y. -Q., Zhang, W. -Q., Wen, Z. -L. Live imaging reveals differing roles of macrophages and neutrophils during zebrafish tail fin regeneration. J Biol Chem. 287 (30), 25353-25360 (2012).
  26. Mathias, J. R., et al. Resolution of inflammation by retrograde chemotaxis of neutrophils in transgenic zebrafish. J Leukoc Biol. 80, 1281-1288 (2006).
  27. Levis, M., Ontiveros, F., Juan, J., Kavanagh, A., Zartman, J. J. Rapid fabrication of custom microfluidic devices for research and educational applications. J Vis Exp. 2019, (2019).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

さらに記事を探す

マイクロ流体デバイス設計マルチプレックスイメージング創傷治癒好中球遊走カルシウムシグナリング手動切断レーザーアブレーション胚トラップ
低コストポリエチレンテレフタレートラミネートラミネートマイクロ流体工学による多重ゼブラフィッシュイメージングのための設計
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。