成体マウスからの海馬ミクログリアの単離と全細胞パッチクランプ記録

サマリー

本プロトコルは、成体マウスから初代海馬ミクログリアを単離し精製する方法を説明し、続いて、これらの急性に単離された細胞の全細胞パッチクランプ記録を実施するための指示が続きます。

要約

ミクログリアは、脳内に常在する免疫細胞で、ニューロンと相互作用して中枢神経系(CNS)の恒常性を維持しています。研究によると、ミクログリアの表面にはミクログリアの活性化を調節するカリウムチャネルが発現していますが、これらのカリウムチャネルの異常は神経疾患につながる可能性があります。現在、ミクログリアの全細胞パッチクランプ記録は、急性に分離されたミクログリアの電気生理学的評価を行うことが困難であるため、主に胎児または新生仔マウスの培養初代ミクログリアで行われています。この研究では、成体マウスから海馬ミクログリアを単離し、単離された細胞に対して全細胞パッチクランプ記録を実施するためのわかりやすいプロトコルを紹介します。簡単に言うと、脳を斬首後にマウスから取り出し、海馬を両側に解剖し、成体マウスの脳解離キットを用いてミクログリアを単離した。次に、ミクログリアを磁気活性化セルソーティング(MACS)法を使用して精製し、カバースリップに播種しました。ミクログリアの単離の成功は、抗CD11抗体および抗Iba1抗体による免疫蛍光染色によって確認されました。カバースリップを記録チャンバーに入れ、急性に分離されたミクログリアの全細胞カリウム電流を電圧クランプ条件下で記録しました。

概要

原始卵黄嚢の骨髄系前駆細胞に由来するミクログリアは、中枢神経系に存在し、全神経細胞の約10%から15%を占めている^1,2。機能的には、局所環境の監視、免疫防御機能の発揮、ニューロン^への栄養とサポートの提供^{に加えて、ミ}クログリアはニューロンに直接接触してニューロン表面受容体と対応するリガンド結合を調節し、サイト^カインの分泌を介してニューロンと間接的に相互作用することもできる5。in vitroおよびin vivoでの研究により、ミクログリアはさまざまな種類のカリウムチャネルを発現し、これが負の膜電位^の維持に寄与し6、ミクログリアの活性化を調節することが実証されています。さまざまな^脳疾患で異常なミクログリアカリウムチャネルが観察されていることを考えると7、研究者はこれらのカリウムチャネルを標的とする可能性のある薬剤を特定し、ミクログリア機能を調節する戦略を開発することが重要です。

ミクログリアの従来の消化および精製方法は、多くの場合、脳全体を使用しますが、これは異なる脳領域にわたるミクログリアの不均一性を見落としています⁸。血清含有培地での in vitro 解離および長期培養は、ミクログリアを^{活性状態9}に置くが、これはミクログリアの生理学的特性および真の状態を正確に反映していない可能性がある。

さらに、初代培養された新生児ミクログリアおよび細胞株¹⁰では、外向き整流カリウム電流が記録されていますが、胎児または新生仔マウスの脳組織の長期培養からのデータは、成熟ミクログリアのデータと異なる場合があります。本プロトコルは、ミクログリアを急性に分離し、成体マウス脳組織を用いてミクログリアカリウム電流の全細胞記録を直ちに行うことを目的としています。

生化学的およびカリウムチャネル特性を、小組織11,12,13,14,15からのミクログリアの単離および精製に適した方法を用いて調べた。したがって、このプロトコルは、研究者が生理学的および疾患条件下でのミクログリアの生化学的および機能的特性を解明するためのガイダンスを提供します。このプロトコルでは、海馬チャネルとカリウムチャネルを例として使用しますが、他の脳領域やチャネル/細胞の電気生理学的特性の研究にも適用できます。

プロトコル

すべての実験は、華南師範大学の生命科学動物管理および使用委員会によって承認され、動物福祉の適切な基準が維持されました(倫理承認:SCNU-SLS-2023-048)。この研究では、生後3〜5か月の雄または雌のC57BL / 6Jマウスを使用しました。使用した試薬や機器の詳細は 、資料表に記載されています。

1. 溶液の調製

1. 160 mMのKF、10 mMのHEPES、10 mMのEGTAおよび2 mMのMgCl₂を含む50 mLの細胞内溶液を調製します。1 MのKOH溶液でpHを7.2に調整し、D-スクロース^13,16で浸透圧を300 mOsmに調整します。-20°Cで保存してください。
2. 0.5% ウシ血清アルブミン(BSA)と 2 mM のエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含む PBS 中に 50 mL の磁気活性化セルソーティング(MACS)バッファーを調製します。
3. ポリ-L-リジン(PLL)を水で1:1000に希釈して調製します。
   注:カバーガラスは実験の前日にPLLでコーティングする必要があります。コーティングされたスリップを37°Cで一晩インキュベートします。2日目にPLLをリサイクルし、コーティングされたスリップを37°Cで乾燥させます。

2. 脳組織からの単一細胞懸濁液の調製

1. マウスに2.5%クロラール水和物(0.15 mL/10 g、i.p.)(制度的に承認されたプロトコルに従う)。マウスのつま先をつまんだり皮膚をつまんだりすることによる角膜反射と疼痛反射の消失は、深い麻酔を確認します。動物を仰向けで解剖台に置き、手足を固定します。
   1. 胸部を露出させ、心臓¹⁷ に氷冷滅菌PBSを灌流して、血管内循環血液細胞を除去します。頭を持ち、ハサミで脳の正中線に沿って皮膚を切り、頭蓋骨を露出させます。
   2. 頭蓋骨の後部を両側に切り、小さなはさみで眼窩の間を切ります。矢状縫合糸に沿って頭蓋骨を切断し、ピンセットで頭蓋骨を取り除きます。ピンセット¹⁷で脳組織をすばやく抽出します。
2. 氷冷PBSが入った10cmの培養皿に脳組織を入れます。ピンセットで大脳皮質を両側に解剖し、海馬組織を分離し、細かく切開します。ピースを15 mLの遠心分離チューブに移します。
   注:大脳皮質の両側解剖は、脳の両半球の海馬組織の三日月を明らかにします。
3. 海馬組織の小片を氷冷したハンク平衡塩溶液(HBSS)2mLに再懸濁し、300 × g で3分間(室温)遠心分離してから、HBSSを廃棄します。
4. 1950 μLの酵素混合物1を、海馬組織片が入った15 mLの遠心チューブに加えます。遠心分離管を37°Cの水浴中で5分間連続して振とうします。
   注:酵素混合物1は、50 μLの酵素Pと1900 μLのバッファーYを37°Cに予熱したものです(市販のキットの一部として存在し、 材料の表を参照)。
5. 遠心分離管をウォーターバスから取り外します。調製したばかりの酵素混合物230 μLを15 mLの遠心チューブに加えます。1 mLのピペットチップで組織片を20回上下にピペットで動かし、37°Cで連続振とうしながら水浴中で5分間インキュベートします。
   注:酵素混合物2は、20μLのバッファーYと10μLの酵素Aの組み合わせです。上記の2つの消化ステップは、脳組織を細胞懸濁液に変換します。総消化時間は15分を超えてはなりません。
6. 遠心分離チューブを取り外し、大きな組織片が残らなくなるまで、1 mLピペットで懸濁液を複数回上下にピペットで動かします。
7. 70 μmの細胞スクリーニングフィルターで細胞懸濁液をろ過し、濾液を清潔な50 mL遠心分離チューブに集めます。
   注:このステップでは、未消化の組織の大きな部分をすべて取り除きます。
8. 濾液を新しい15 mL遠心チューブに移し、4°C、300 × g で10分間遠心分離します。上清を1mLのピペットで捨てます。
9. 15 mL HBSSで20回ピペッティングして細胞懸濁液を洗浄し、4°C、300 × g で10分間遠心分離します。上澄みを捨てて、
   細胞ペレットをMACSバッファー1mLに再懸濁します。
   注:このステップは、その後の実験で使用されるシングルセル懸濁液を提供します。

3. ミクログリアの急性分離

1. 1 mLのシングルセル懸濁液を2 mLの微量遠心チューブに移し、4°C、300 × g で3分間遠心分離します。上清を捨てます。
2. シングルセルペレットを90 μLのMACSバッファーに再懸濁します。CD11b/cマイクロビーズ10μLを添加し、懸濁液を4°Cで水平シェーカーで15分間インキュベートします。
3. ソーティングカラムを適切なMACSセパレーターの磁場に置き、500μLのMACSバッファーでカラムを2回湿らせます。
4. 1 mLのMACSバッファーをチューブに直接加えてシングルセル懸濁液を洗浄し、4°C、300 × g で3分間遠心分離します。上清を完全に吸引します。
5. 細胞ペレットを500 μLのMACSバッファーに再懸濁します。
6. 再懸濁した細胞懸濁液を磁場中でソーティングカラムに移し、1mLピペットを使用します。フロースルーを破棄します。カラムを磁場中に留まっている間に、500 μLのMACSバッファーで3回洗浄します。
   注:フロースルーにはラベルのないセルが含まれています。カラムは磁場から取り除かずに洗浄する必要があります。
7. ソーティング列を磁場から取り外します。1 mLのMACSバッファーをカラムに加え、ピストンでゆっくりと押し込みます。フロースルーを収集します。
   注:フロースルーには、標識された細胞(すなわち、ミクログリア)が含まれます。ミクログリアの純度を向上させるために、新しいソーティングカラム(オプション)を使用してこのプロセスを繰り返すことができます。
8. 選択した細胞を、PLLでコーティングされたカバースリップを含む24ウェルプレートに播種します。200 μLの培地を加え、95% O₂、5% CO₂、湿度60-80%の37°Cインキュベーターで20分間インキュベートします。このステップにより、ミクログリアをカバーガラスに付着させ、その後の全細胞パッチクランプおよび免疫蛍光実験を行うことができます。

4. 免疫蛍光

1. プレートウェルから培地を吸引し、シェーカーで0.1 M PBSで細胞を3回すすぎます。
2. PBSを廃棄し、ミクログリアを4%パラホルムアルデヒド(PFA)でカバーガラスに室温(RT)で20分間固定します。
3. 固定剤をはがし、カバースリップを0.1M PBSで3回すすぎます。
4. PBSを廃棄し、0.2% Triton X-100およびPBS中の5% BSAを含む200 μLのブロッキングバッファーで細胞を透過処理し、シェーカー上のRTで1時間。
5. ミクログリアをブロッキングバッファーと抗Iba1および抗CD11b一次抗体¹⁸ と共に4°Cで一晩インキュベートします。
6. 翌日、一次抗体を取り出し、シェーカーのRTでカバースリップをPBSで3回すすぎます。
7. 蛍光色素共役二次抗体を含むブロッキングバッファーとミクログリアを室温で2時間インキュベートし、インキュベーションの最後の15分間にDAPI色素を添加します。
8. 二次抗体を取り出し、カバースリップをPBSで3回すすぎます。カバースリップを顕微鏡スライドに取り付けてイメージングします。

5. ミクログリアにおけるカリウム電流の全細胞パッチクランプ記録

1. 細胞内溶液を解凍し、氷の上に保ちます。
2. 垂直プー^ラー17を使用して、薄肉のホウケイ酸ガラスキャピラリーからパッチピペット(電極)を引き抜きます。
   注:電極抵抗は10MΩ未満である必要があります。
3. カバースリップを記録チャンバーに移し、160 mMのNaCl、4.5 mMのKCl、2 mMのCaCl₂、1 mMのMgCl₂、および10 mMのHEPESを含む細胞外溶液を添加します。使用前に1 M NaOH溶液でpHを7.2に調整し、^13,16を使用し、浸透圧をD-スクロースで300 mOsmに調整します。
4. 40倍対物レンズを使用して、水顕微鏡で球状ミクログリアを見つけます。
5. 電極に細胞内溶液を充填し、電気生理学セットアップのアンプヘッドステージに取り付けて、正圧を加えます。4倍対物レンズに切り替えて、電極の位置を確認します。
   1. 電極を浴溶液に下げ、アンプを電圧クランプモードに設定して、 浴 モードで膜試験を実行します。40倍対物レンズに戻し、電極の先端をミクログリアに近づけます。
      注:電極の先端がミクログリア細胞に非常に近い場合、抵抗はわずかに増加するはずです。
   2. セルを保持するために小さな負圧を加えます。抵抗が100MΩに達したら、メンブレンテストで バス モードから パッチ モードに切り替えます。抵抗が300MΩに達したら、負圧を解放します。
   3. 抵抗が電極とミクログリア膜との間にギガオームシール(つまり、>1GΩ)の形成を示している場合は、メンブレンテストで パッチ モードから セル モードに切り替えます。
6. 少量の吸引を加え、電気ショックを起こして膜を破裂させます。大きな容量性過渡現象の出現は、膜の破裂が成功したことを示しています。
7. 電圧に切り替えますamp モードにして、録音プログラムを開きます。カリウム電流を200ミリ秒記録します。電位をテストするには、1 Hz で -120 mV から +40 mV まで 20 mV 刻みで電圧ステップを印加します。
8. 取得したデータを適切なソフトウェアを使用してオフラインで分析します。

結果

簡単に言うと、このプロセスには、成体マウスの脳からの海馬ミクログリアの単離と、それに続くこれらの細胞の全細胞パッチクランプ記録が含まれます(図1)。この手順は、生後3〜5か月のC57BL / 6J成体マウスの海馬を解剖することから始まります。具体的には、灌流後に脳全体を取り出し、氷冷したPBSを含む培養皿に入れます(図2A)。海馬から細胞を急性に分離するために、大脳皮質を切除し、三日月形の海馬組織を無傷で単離します(図2B)。

最適な細胞品質とその後の高品質な全細胞パッチクランプ記録のためには、シングルセル懸濁液の調製中の消化時間を制御することが重要です。この研究では、酵素混合物中の海馬組織を一貫して手動で攪拌し、消化時間を15分以内に厳密に制限しました(図3)。次に、細胞をMACS法を使用して単離し、86.20%±0.68%^19,20の純度を達成しました。これらの選別された細胞がミクログリアであることを確認するために、ミクログリアの検出に広く使用されている抗Iba1抗体および抗CD11b抗体を用いた免疫蛍光法により、ミクログリア表面マーカーを試験した¹⁸。その結果、単離された細胞はCD11bおよびIba1陽性であり、ミクログリアの単離が成功したことが確認されました(図4)。

最後に、急性に分離されたミクログリアが追跡実験に高品質であるかどうかを評価するために、ミクログリアカリウム電流を評価するための全細胞パッチクランプ記録の実行方法について説明します。記録されたミクログリアの平均膜容量は10.42±2.05でした(図5)。その結果、ミクログリアカリウム電流を記録できることが示され、急性に分離されたミクログリアが神経生物学的研究に適していることが示されました。

図1:実験手順の概要。 脳組織を注意深く抽出し、海馬を両側に解剖するという4つの主要なステップがあります。海馬組織を消化して、プロトコルのセクションで詳述されているように、酵素混合物を使用して単一細胞懸濁液を調製します。標的細胞は、磁気活性化細胞選別法によって単離されます。また、急性に単離された細胞のカリウム電流は、全細胞パッチクランプ記録によってアッセイされます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:海馬の解剖(A)生後3〜5か月のマウスの脳全体。(B)孤立した両側海馬。スケールバー:0.5 cmこの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:海馬組織の消化を示す概略図。 重要な実験ステップの図は、海馬組織が1細胞懸濁液に消化されることを確認するために、最大15分間の連続振とうで37°Cで酵素混合物を添加することにより、この 図の拡大版を表示するためにここをクリックしてください。

図4:急性に分離された海馬ミクログリアの同定。 海馬から精製されたCD11b(緑)とIba1(赤)陽性細胞を示す代表的な共焦点画像により、単離された細胞がミクログリアであることが確認されました。スケールバー:10μmこの 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:全細胞ミクログリアカリウム電流の記録 (A) 記録電極は、単離された海馬ミクログリアの表面に配置されています。スケールバー:20μm.(B)電圧クランプ条件下での急性分離された海馬ミクログリアの代表的なカリウム電流。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

胎児または新生児マウスから培養されたミクログリアは、成体ミクログリアの研究には明らかに適していません。さらに、異なる脳領域にわたるミクログリアの不均一性を考慮する^と、全脳から分離されたミクログリアは、特定の脳構造におけるミクログリアの特性を正確に表していない可能性がある。このプロトコルは、海馬ミクログリアを単離し、特にこれらの細胞の電気的特性を評価する方法を提供します。これには、ミクログリアカリウムチャネルによって支配される電流を記録する方法が含まれています。

初代細胞培養およびその後の実験中にこれらの細胞の特性を損なわないように、単一細胞懸濁液を調製する際に組織の消化を厳密に制御する必要があることはよく知られています。通常、単一細胞懸濁液は、膵臓酵素の消化と物理的な均質化を通じて全脳から得られます。しかし、海馬などの特定の脳領域からミクログリアを分離する場合、物理的な均質化だけでは、意味のある実験に十分な量の細胞を生み出せません。さらに、膵臓酵素は活発な消化活性を持っており、細胞の生存率に影響を与える可能性があります。

これらの問題に対処するために、この研究では比較的穏やかな解離手順を採用し、成体マウス脳解離キットを使用して消化時間を15分以内に手動で制御しました。このアプローチにより、ミクログリアが活性状態に維持され、これはその後の全細胞パッチクランプ記録に重要です。軽度の解離手順は、速度と費用対効果の点でも利点を提供します。

初代ミクログリアの精製方法には、層状振とう法(SSM)²²、密度勾配遠心法(DGCM)²³、蛍光活性化細胞選別法(FACS)^11,24などがあります。これらのうち、SSMはニューロンまたはグリア細胞の精製に広く使用されています。しかし、SSMの大きな制限は、高レベルの純度²⁵を達成できないことである。同様に、DGCMも純度レベルが低くなります。FACS法では、細胞を15分から1時間染色した後、高速セルソーターでソーティングする必要がありますが、これは細胞生存率を損なう可能性があります。対照的に、このプロトコルはMACS法を利用しているため、分離時間が短縮され、器具や染色手順の反復的で時間のかかる使用を回避できます。その結果、高純度のミクログリアが得られますが、いくつかの代替方法と比較して潜在的に少量です。

この手法には制限があります。例えば、磁気活性化セルソーティング(MACS)法では、得られるミクログリアが比較的少なく、急性に分離されたミクログリアを長期間培養することはできません。しかし、このアプローチは、長期間培養された細胞に頼るのではなく、成体マウスの海馬から新たに調製されたミクログリアの電気生理学的特性を調べることができるという点で価値があります。

全細胞パッチクランプ法は、神経科学、薬理学、細胞生物学などの分野で細胞、特にニューロンの電気生理学的特性を研究するための重要かつ広く使用されているツールである²⁶。全細胞パッチクランプ記録は、急性解剖された脳切片、初代培養、および細胞株の特性を調査するために、数多くの研究で採用されてきました。しかし、成体マウスの脳から急性に分離されたミクログリアの全細胞パッチクランプ記録は、私たちの調査まで不足していました。

この研究は、成体の海馬ミクログリアを単離するためのプロトコルを提供するだけでなく、これらの単離されたミクログリアにおけるカリウム電流の記録が成功したことも示しています。特に、このプロトコルは、海馬以外の脳構造のミクログリアの研究に適用される可能性があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
100 mmペトリ皿	Corning	353003
15 mL Falcon チューブ	BD	352096
24ウェルプレート	BD	353047
35 mm ペトリ皿	Corning
353001-50 mL Falcon チューブ	BD	352070
70 μm細胞スクリーニング	Miltenyi	130-095-823	細胞選別前に細胞塊を除去するには
、成体マウス脳解離キット	Miltenyi	130-107-677
抗CD11b抗体	Bio-Rad	MCA74	ヤギ抗マウスIgGも利用できます。内因性免疫グロブリンを遮断するため。
抗IBA1抗体	SYSY	234308	ヤギ抗モルモットIgG)も入手可能です。内因性免疫グロブリンを遮断するため。
Axon Digidata 1440A	USA
Axon MultiClamp 700B Amplifier	USA
BSA アルブミン フラクション V	BioFrox	4240GR500	血清
C57BL/6 マウス	広東省医療実験動物センター
CD11 b/c マイクロビーズ	Miltenyi	130-105-634
クロラール水和物ア	ブシン abs47051394		マウスの麻酔として広く使用されています
Clampfit 10.6	米国
共焦点顕微鏡	Zeiss	LSM 800
培地	フィッシャーサイエンティフィ	C11995500BT-DAPI
色素	Beyotime	C1002
電極プーラー	Narishige	PC-10
HBSS	Servicebio	G4203
水平シェーカー	SCILOGEX	SLK-O3000-S
画像解析ソフト	フィジー
MACS カラム	Miltenyi	130-042-201
MACS セパレーター	Miltenyi	130-042-102
パラホルムアルデヒド	Fisher Scientific	T353-500	1X PBS、pH 7.2-7.4 の新鮮な 4% 溶液を使用します。
ポリ-L-リジン	Beyotime	C0313	カバースリップコーティング
Triton X-100	Sigma	X100