NMRベースのメタボロミクスを用いた重症患者における代謝異常物の同定と定量

Summary

核磁気共鳴(NMR)分光法は、さまざまな疾患を持つ患者の代謝産物の調節不全を特定するために使用されます。この技術により、乱れた代謝物の定量化が可能になり、病態生理学的な洞察が解き明かされます。ここでは、患者の代謝特性評価のためのNMRベースのアプローチの段階的な手順について説明します。

Abstract

メタボロミクスは、病態生理学的状態に対する個人の反応を反映する重要なアプローチとして浮上しています。核磁気共鳴(NMR)分光法は、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、重症急性膵炎(SAP)、急性腎障害(AKI)、敗血症などの疾患に苦しむ重症患者の代謝調節不全を特定するツールとして進化してきました。研究群と対照群の血清サンプルからのスペクトルデータは、800 MHz NMR分光計を使用して記録され、NMR処理および分析ツールを使用して処理されます。さらに、単変量検定や多変量検定などの厳密な統計解析を行い、有意な代謝物を特定し、NMR代謝物定量ソフトウェアを用いて正確に同定・定量します。さらに、パスウェイ解析では、病気の重症化をもたらす乱れた生化学的サイクルが強調されています。この包括的なアプローチを通じて、研究者はこれらの重篤な疾患に関連する代謝変化についてより深い洞察を得ることを目指しており、疾患に対する理解を深め、診断および治療戦略を改善するための道を開く可能性があります。

Introduction

世界中で効率的な疾患診断を提供するための継続的な努力にもかかわらず、標的療法はまだその真の可能性を達成していません。トランスクリプトミクス、プロテオミクスなどのさまざまなアプローチにより、いくつかのバイオマーカーが同定されましたが、感度と特異性が欠如していたため、これらは十分な臨床的有用性を保持していませんでした^1,2。標的療法は、一部の多因子疾患では大きな課題であり、最終的には死亡率の上昇につながります。幅広い不均一性を持つ複雑な疾患の根底にあるメカニズムと病態生理学について、より深く理解する必要があります。このように、メタボロミクスの進化は治療法の開発に革命をもたらし、最終的には急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、敗血症、重症急性膵炎(SAP)などのさまざまな重篤な疾患の治療計画を調整するのに役立つ可能性があります。

メタボロミクスは、さまざまな生体液、細胞、または組織抽出物にわたる低分子量分子(アミノ酸、脂質、ペプチド、有機酸、ビタミンなどの代謝物)を同定および定量することを目的とした包括的なアプローチです。これらの代謝産物は、通常1500 Da未満の重量で、生物の生物学的状態の進行的な輪郭を反映して、生化学的プロセスで積極的な役割を果たします。それらには、主要な酵素プロセスの基質、生物学的経路の中間体、および細胞代謝の副産物が含まれます。その結果、メタボロミクスは、食事の影響、薬物相互作用、および病状の詳細なフィンガープリントを捉えます。代謝物の変化は、代謝と生物学的経路の非常に感度の高い指標であり、表現型の発現と結果として生じる病態生理学的異常との相関を可能にします^3,4。代謝物の初期変動は、疾患の重症度の初期指標として役立つ可能性がありますが、時間的な変化は、治療の有効性、疾患の進行、および臨床転帰のモニタリングに役立つ可能性があります^5,6,7。このように、メタボロミクスは、臨床、生理学、生化学のエンドポイント8,9,10,11,12,13を通じて疾患を再定義することにより、臨床アッセイやその他のさまざまなオミクスアプローチを強化します。メタボロミクスの分析能力は、代謝物濃度の変化による疾患感受性をモニターおよび決定するために採用されています^14,15。

このような状況において、質量分析(MS)と核磁気共鳴(NMR)分光法の両方が、生体サンプル中の代謝物プロファイリングの主要な分析プラットフォームとして浮上しています。これらの方法は、代謝物16,17,18の標的および非標的の両方の同定および定量に使用されます。各プラットフォームにはそれぞれ長所と短所がありますが、NMRの非破壊的な性質は、さまざまなin vivo研究や、特にメタボロミクス研究の初期段階における未知の化合物の構造解析に適しています。MSの前に必要なサンプルの分画、誘導体化、イオン化はバイアスを引き起こし、しばしばサンプル損失を引き起こし、NMR分光法が最小限のサンプル調製またはサンプル調製なしで捕捉できる動的特徴に影響を与える可能性があります。NMRの主な制限は、MSと比較して感度が低いことであり、MSは検出限界が低いため、存在量が少ない代謝物を検出するのが困難です¹⁹。しかし、高分解能超伝導磁石、極低温冷却NMRプローブ、感度を向上させる技術などの進歩により、この制限は緩和されました20,21,22。ゲノミクスとプロテオミクスの補完的なアプローチとして、NMR分光法を用いた代謝プロファイリングは、好ましい手法として注目を集めている23,24,25。NMRは、サンプル調製、再現性、再現性が最小限に抑えられているため、感度の課題にもかかわらず、代謝物の固有の動的特徴を捕捉するための貴重なツールとなっています²⁶。

いくつかの研究グループはメタボロミクスを成功裏に実施し、ARDS^{28、29、30、31、32、33}、肺炎³⁴、敗血症⁷、胆石³⁵、膵炎^{36などのさまざまな}疾患の患者の調節不全の代謝プロファイルを特定している.重症患者を対象としたNMRベースのメタボロミクス研究は、全身性炎症反応症候群(SIRS)から集中治療室(ICU)の死亡率と罹患率の主な原因である多臓器機能不全症候群(MODS)への進行を追跡するのに役立っています³⁷。Stringerらによる研究では、血漿サンプルを使用して、敗血症誘発性急性肺損傷(ALI)患者の代謝変化を対照患者と比較して調べました³⁸。このパイロット研究で上昇した主要な代謝物は、関与する代謝経路と臨床スコアとの関連を反映しています。この研究は、ARDS³²の肺損傷メカニズムの初期段階から敗血症を区別するために、血清メタボロミクスに拡張されました。さらに、ARDSの別の研究では、急性肺損傷/ ARDSと健康なコントロールを明確に区別する強力な血清バイオマーカーが特定され、肺損傷の急性発症に対応する全身代謝変化に関する洞察が得られました^39,40。

NMR分光法は、代謝フィンガープリントに関する堅牢で偏りのない情報を提供するハイスループットで自動化された分析技術であり、根底にある病態生理学^{を明らかにします38}。NMRデータの臨床応用と生物学的解釈は、豊富な情報を含む高品質のスペクトルを取得することにかかっています。したがって、正確で均一で、適切に定式化されたデータの収集、処理、および分析を確保することが重要です。したがって、この研究の目的は、代謝物の同定と定量のためにNMRベースのメタボロミクスの重要なステップを活用することです。この試験では、適切なサンプルの選択、収集と保存、サンプルの処理と調製、データの取得と分析、目的の代謝物の特定と定量化、そして最終的には臨床状況での結果の解釈による関連性のある洞察を導き出すなど、臨床メタボロミクス研究に必要なプロトコルの主要なステップに焦点を当てています(図1)。これらの各ステップは、メタボロミクスにおけるNMR分光法を活用して、重要な生物学的および臨床的洞察を明らかにするために不可欠です。

Protocol

倫理的承認(IECコード:2022-71-PhD-126)は、ラクナウのSanjay Gandhi Postgraduate Institute of Medical Sciences(SGPGIMS)のIECから取得されました。患者またはその親族から書面によるインフォームドコンセントが得られ、研究目的でデータを公開しました。さらに、研究は機関のガイドラインに従って実施されました。

1. 研究デザインと倫理的クリアランス

1. 各グループのサンプルサイズを決定します。参加者の選考基準を慎重に検討し、設定してください。さらに、研究デザインでヒトまたは動物のサンプルを含める必要がある場合は、サンプル収集を開始する前に、適切な機関倫理委員会(IEC)から倫理的許可を得てください。
2. 動脈血中の酸素分圧 (PaO2) と吸気酸素分率 (FiO2) (P/F) の比率に基づくベルリン 2012 の定義の診断基準に基づいて、軽度、中等度、重度に分類された ARDS 患者を選択します。P/F 範囲が 300-200 の ARDS 患者は軽度、200-100 は中等度、100 未満は重度³⁸ と見なされます。ここでは、軽度と中等度のARDS患者の2つのグループに焦点を当てています( 表1を参照)。
   注:この研究では、血液サンプルから得られた血清を使用してNMRベースのメタボロミクスを実行します。この研究では、参照のために含まれた参加者の平均年齢は42歳(±10.9歳)で、性別分布は男性2人、女性6人でした。

カテゴリ	P/Fレシオ
軽度	300-200
適度	200-100
重度	100-0

表1:ARDS患者の分類。

2. サンプルの選別、採取、処理

1. 以下で説明する手順に従って、血清の単離を行います。
   1. 実験のために、プレーン(添加物なし)と滅菌バイアルに入った滅菌針を使用して、動脈から2 mLの血液サンプルを採取します。サンプルを室温で30分間凝固させます。この研究では、軽度のARDSと診断された4人の患者と、中等度のARDSと診断された4人の患者が選択されました。
   2. サンプルを3100 x g で15分間遠心分離し、血清²⁵を分離します。血清を滅菌微量遠心チューブに移し、少量(すなわち、400-500μL)のアリコートを作成し、それらを適切に標識し(患者名、CR番号、日別ポイントなど)、将来の分析のために-80°Cで保存します。
      注:この時点で、実験は都合の良いときに一時停止および再開できます。
2. NMR実験の前に、以下の手順で血清サンプルを処理します。
   1. NMR実験を行う前に、サンプルを解凍してください。血清のアリコート250μLを生理食塩水リン酸緩衝液250μL(100%D₂O、0.9%NaCl、50 mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.4を含む)と混合して、pHの変動を最小限に抑えます。
   2. 混合物を数秒間(~15秒)ボルテックスして、均一に混合されていることを確認します。最後に、調製したサンプルを、0.05 mMの濃度でプロピオン酸トリメチルシリル(TSP)を含む同軸インサートを備えたきれいなNMRチューブに移します。これは、キャリブレーションおよび定量⁴¹の外部標準として機能します。
      注:参考までに、分析種と相互作用しない不活性で非反応性の化合物を使用します。その他の一般的に使用される参照化合物には、テトラメチルシラン(TMS)およびトリメチルシリルプロパンスルホン酸ナトリウム(DSS)が含まれます。

3. NMR実験

注:血清サンプル中の小分子の同定に焦点が当てられているため、高分子シグナルを抑制するCarr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)パルスシーケンスを使用しました。この研究のすべての血清サンプルは、極低温冷却された三重共鳴TCI 5 mm広帯域逆プローブヘッドとシールドされたzグラジエントを備えた800 MHz NMR分光計を使用して記録されました。

1. サンプルを磁石に入れます。コマンドwrpa(実験番号を記載)を記述し、Enterキーを押して、cpmgパルスプログラムを使用した陽子実験を設定します。「 タイトル」オプションをクリックして、患者の名前と必要なその他の詳細を伝えます。
2. コマンド「Lock」を書き込み、Enterキーを押して、オプション「90%_H2O」および「10%_D2O」をさらに選択して、磁場をロックします。ATMMでプローブを手動で調整および一致させることで、無線周波数パルスの効率を最適化し、感度を最大化します。トプシムをクリックして1Dグラデーションシミングを実行します。
3. 5秒の緩和遅延、12ppmのスペクトル掃引幅、300μsのエコー時間など、以下の集録パラメータを設定します。これらのパラメータはすべて、上部パネルで [Acquisition Parameters ]オプションを選択することで簡単に変更できます。
4. 指数ウィンドウ関数を使用して 0.3 Hz の線幅拡張を適用し、128 回のスキャンで 64,000 ポイントにデータを収集します。これらのパラメータは、上部パネルで [Acquisition Parameters ]オプションを選択することで、同様に変更できます。 [Acquisition Parameters]をクリックすると、仕様のリストが表示され、前述の属性と他のパラメータを最適化中に変更できます。
5. NMRプロセッシングおよび分析ツールを使用してNMRスペクトルを取得します。最終的なスペクトルが得られたら、コマンド apk と absn を書き込み、Enter キーを押して、それぞれ位相補正とベースライン補正を実行します。上部パネルにある [Calibrate Axis ]オプションをクリックし、TSPピークを自動または手動で0 ppmにキャリブレーションします。
6. 取得したデータをシステムからワークステーションに転送し、そこでさらなる処理と分析が行われます。
   注:実験フェーズは完了し、一時停止できます。データの前処理、分析、解釈を便利に行うことができます。

4. データの前処理

1. NMRプロセッシングおよび分析ツール、およびNMR代謝物定量ソフトウェアを使用してデータ前処理を行います。
   1. 時には自動修正だけでは不十分で、その場合は手動修正も必要になります。位相補正を手動で行うには、NMR処理および解析ツールの上部メニューバーにある 「プロセス 」オプションをクリックします。次に、[ 位相の調整]をクリックし、マウスをドラッグして、スペクトルが位相補正されるまで観察します。完了したら、同じメニューバーにある[ 保存して戻る ]オプション(アイコンの形で表示)をクリックします。
   2. 手動ベースライン(Whittaker法)補正を行うには、NMR代謝物定量ソフトウェアのプロセッサーモジュールでスペクトルファイルを開きます。 「ベースライン補正」オプションを選択します。次に、オプション「 Whittaker Method」を選択します。次に、スペクトル全体のピークの基部にドットを配置します(通常は血清の場合、またはスペクトル内の代謝物の利用可能性に応じて0.0〜10 ppm)ベースを調整します。すべてのスペクトル ファイルのベースラインが補正されたら、それらを 1 つのフォルダーに保存します。さらに、プロセッサーまたはNMR代謝物定量ソフトウェアのプロファイラーモジュールを使用して、特定の形式で保存された同じファイルを使用して、さらなる処理を行うことができます。
   3. 同じソフトウェアのプロファイラーモジュールを使用してビニングを実行します。「 ツール」オプションを選択し、「 バッチ処理」を選択し、「 スペクトルビニング」を選択します。
2. 統計分析に使用する最終的なビニングシートを生成するには、スペクトルビニングをクリックした後、ベースライン補正されたすべてのスペクトルファイルを含むフォルダを選択します。
3. スペクトルを、0.01〜0.04 ppmの範囲で定義されたスペクトル幅を持つ同じサイズのビンのセット数に分割します(研究に従って最適化できます)。このプロセスにより、スペクトルデータが簡素化および整理され、より一貫性のある分析が容易になります。バケットのサイズと開始および終了のppm値を指定し、出力ビニングシートを保存するフォルダを指定します。
4. スペクトル干渉42,43,44を防ぐために、水と溶媒TSP(4.8-5.2および0.0-0.7 ppm)に対応する化学シフト領域を除外します。
5. このスプレッドシートには、1 つの行にサンプル名が含まれ、他の行には異なるビン値と ppm が含まれています。このシートを統計分析に使用する前に、サンプルを分析用のグループに整理し、カンマ区切り(CSV)形式でのみ保存して変更してください。
   注:たとえば、軽度のグループと中等度のARDS患者グループを比較する場合、データを軽度と中等度のラベルで整理し、シリアル番号を追加し、ファイルをCSV形式で保存しました。

5. 統計分析

注: 前の手順で取得したビニング シートは、統計分析の入力ファイルとして機能します。本研究では、メタボロミクス統計解析ソフトウェアの統計解析(一因子)モジュールを用いた。

1. 統計分析の前に、sum、log、およびParetoを使用して正規化ステップを実行しますが、異なる研究⁴⁵によって異なる場合があります。
2. 単変量解析と多変量解析を実行して、異なるグループを区別し、同定された代謝物の精度を判断します。
   1. 主成分分析 (PCA)、部分最小二乗判別分析 (PLS-DA)、および直交部分最小二乗判別分析 (OPLS-DA) を実行して、代謝プロファイルの違いの原因となるすべての代謝物について、予測の変数重要度 (VIP) スコアをもたらすグループ間の識別を観察します。
   2. スチューデントt検定やANOVAなどの単変量法を実行し、p値が0.05未満であるという基準に基づいて有意な代謝物を特定します。どちらの試験でも、代謝物の相対濃度の違いを示すボックスウィスカープロットが得られます。
   3. バイオマーカー分析を実行すると、レシーバー動作特性曲線(AUROC)グラフの下の面積が得られます。0.8 > の AUC (曲線下面積) 値は有意な⁴⁶ と見なされます。
   4. 基準 VIP スコア>1、ボンフェローニ補正 p 値<0.05⁴⁴、および AUC > 0.8⁴⁶ を使用して、有意な代謝物の最終リストを選択します。
3. 以下に説明するように代謝物を特定します。.
   1. ビニングは、名前ではなくppm値の形で重要な代謝物を提供します。Biological Magnetic Resonance Bank(BMRB)⁴⁷やHuman Metabolome Database(HMDB)などのデータベースを使用して、特定のppm値に対応する代謝物を特定します。
   2. これら以外に、以前に公開された文献^42,44を同定および検証に使用する。
   3. NMR代謝物定量ソフトウェアのプロファイラーモジュールを使用して、同定された代謝物とそのppm値を確認します。

6. NMR代謝物定量ソフトウェアによる代謝物の定量

注:ソフトウェアのプロファイラーモジュールは、同定された代謝物を定量するために広く使用されています。

1. 定量を開始する前に、プロセッサーモジュールを使用して、研究用に選択した参照化合物(この研究で使用したtsp)をキャリブレーションします。「 CSI(化学形状インジケーター)のキャリブレーション」オプションをクリックします。参照化合物の濃度(この研究では0.05 mM)に言及してください。次に、ソフトウェアピークをスペクトル基準ピークにドラッグし、その高さと幅を適切に調整します。スペクトル基準ピークがソフトウェアのピークに適合したら、[ Accept]をクリックします。
2. プロファイラーモジュールで目的のスペクトルを開き、研究に適した化合物ライブラリを選択します。
3. 画面下部に代謝物のリストが表示されます。このリストから目的の代謝物を選択します。選択すると、選択した代謝物の可能なppmがスペクトルの上隅に表示されます。
4. 上隅の Ppm値 を選択し、スペクトルを代謝物の特定のppmスケールにズームインします。
5. この時点で、2つのピークが画面に表示されます。1つは記録されたデータを表し、もう1つはソフトウェアのピークを表す点線で表示されます。両方のピークを揃えます。ソフトウェアのピークをドラッグし、サンプルに存在するピークと一致するように高さと位置を調整します。
6. 適切に整列すると、代謝物の濃度は、その代謝物のmM単位の見出しの下に表示された値から取得できます(図1)。
7. すべての代謝物とサンプルについて同じ手順に従い、定量化された値をスプレッドシートにエクスポートします。出力ファイルを生成するには、[ツール]メニューの[バッチ操作]オプションをクリックします。出力ファイルを保存するフォルダを指定します。

7. パスウェイ解析

注:分析後に同定された有意な代謝物は、疾患群の結果に直接影響を与える主要な経路を決定するために利用されます。この目的のために、メタボロミクス統計解析ソフトウェアのパスウェイ解析モジュールとKEGGデータベースが一般的に使用されます。

1. 得られた重要な代謝物のリストをモジュールに入力します。パスの名前を含むリストが生成されます。
2. インパクトファクターが0.1より大きいという基準に基づいて、最終的な経路を選択します。有意な影響値は、疾患関連の経路を示しています³⁰。
3. 得られた経路を徹底的に分析し、疾患の重症度に関連する調節不全を解明します。この方法の欠点の1つは、有意な代謝物が3未満の場合に調節不全の経路を特定するのが非効率的であることです。
4. これに対処するために、同定された代謝物およびその疾患の重症度との相関関係は、以前に発表された文献を使用して決定することもできる。徹底的な文献調査を行い、同定された代謝物があなたの興味と同じ傾向をたどっているかどうかを観察してください。

図1:NMRベースのメタボロミクスにおける基本的なステップ。 この図は、NMRベースのメタボロミクスにおける主要なステップである、サンプルの収集と調製、NMR分光法の実施、データの前処理、統計分析の実施、代謝物の同定と定量化、生物学的意義の解釈を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Results

メタボロミクス研究を実施するには、サンプルサイズと分析する特定のグループを決定することが不可欠です。適切なサンプルサイズを選択することは、疾患の重症度と正確に相関する有意な結果を得るために不可欠である⁴⁸。しかし、この特定の研究では、主に参照を目的としていたNMRベースのメタボロミクスを使用した代謝物の同定と定量に関与するステップを示すために、小さなサンプルサイズを使用しました。この研究では、ICU 入院の 1 日目に、ARDS の軽度および中等度の段階にある患者間の代謝の違いを調べました 合計 8 人の被験者を含む。プロトコールに従って、すべてのサンプルのNMRスペクトルを取得および処理し、最終的にビニング結果を含むスプレッドシートを作成しました。

次に、ビニングシートを入力ファイルとして使用し、sum、log、およびParetoを使用してデータを正規化する厳密な統計分析を実行しました。PCA(図2A)とOPLS-DA(図2B)を実施したところ、前者はクラスタリングを示しましたが、後者ではグループ間の明確な識別が明らかになり、代謝の違いが強調されました。順列検定の統計分析(20倍)では、R2Y=0.99、Q2=0.47の値が得られました。その後、スチューデントのt検定(図2C)とバイオマーカー分析(図2D)を行い、調節不全の代謝物を特定しました。プロトコールのセクションで概説した基準に従って、結果を有意な代謝物にフィルタリングしました(表2)。

(A)軽度のARDS患者(赤色で表される)および中等度のARDS患者(緑色で表される)の直交部分最小二乗判別分析(OPLS-DA)。(C)ボックス兼ウィスカープロットは、血清サンプル中の陽子核磁気共鳴分光法によって検出された軽度と中等度のARDS患者間の代謝物の相対濃度の違いを強調しています。x軸は研究グループを表し、y軸はICU入院1日目に軽度のARDS患者(赤色で表される)と中等度のARDS患者(緑色で表される)を比較したときの相対濃度を示しています。(D) ICU 入院の 1 日目に軽度と中等度の ARDS 患者を比較したバイオマーカー分析を実施した後に得られた重症度を予測する有意な代謝物の曲線下面積 (AUC) プロット。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

S.No。	名前	スペクトル位置 (ppm)	p値	要人	AUC 値
1	乳酸	1.34	0.04	1.99	1
2	イソロイシン	1.42	0.03	2.01	0.875

表 2: ICU 入院の 1 日目に軽度と中等度の ARDS 患者を比較した後に得られた有意な代謝物のリスト。

結果はppm値で得られたため、以前の文献を使用して代謝物を割り当て、プロファイラーを通じて検証しました。割り当て後、乳酸とイソロイシンが有意な代謝物として得られ、これは以前のいくつかのARDS研究でも報告されています^30,40。十分に分離された、重なり合わないピークを確実に選択しました。同定後、プロトコルに記載されている基準を使用して、有意な代謝物のリストをフィルタリングしました。次に、プロファイラーモジュールを使用してスペクトルを開き、目的の代謝物を検索し、ソフトウェアのピークをスペクトルで得られたピークに適合させることにより、目的の代謝物を定量しました。これにより、代謝産物の定量化された値をmMで提供しました。サンプル名、代謝物名、および濃度を含むスプレッドシートを参照用に作成しました。ソフトウェアで定量した後、プロテオミクスなどの他のアプローチによる検証を行うことができます。

さらに、同定された代謝物を徹底的に分析して、疾患の重症度との相関関係を判断し、これらの代謝物が積極的に関与している生化学的経路を特定します。材料および分析法のセクションに記載されている基準を使用した後に同定された有意な代謝物は 2 つだけであったため、ソフトウェアを使用したパスウェイ解析は不可能でした。したがって、狂った代謝サイクルを強調するために徹底的な文献調査が行われました。この研究で特定された2つの代謝物は、ARDSの重症度とうまく相関していました。乳酸の増加は肺の炎症と嫌気性呼吸を示し、一方、イソロイシンの増加は肺の損傷、感染、およびエネルギー代謝に関連するタンパク質異化作用を示した⁴⁰。これらの代謝経路を理解することには、2つの目的があります。まず、病気の複雑さを明らかにし、その生物学的メカニズムについての洞察を提供します。第二に、臨床医が患者に合わせた治療を指導することで治療の進歩を支援し、最終的には臨床転帰を改善します。

Discussion

メタボロミクスは、疾患中に乱れる代謝サイクルを標的として、代謝物を効率的に同定・定量します。結果の品質は、メタボロミクスアプローチの各ステップの細心の注意を払って実行することに依存します。サンプルの選択と収集から経路の特定まで、すべての段階が、病気の原因となる主要な要因を正確に特定するために重要です。メタボロミクスを行う前に、文献の徹底的なレビューが不可欠であり、すべての段階で細心の注意を払う必要があります。

メタボロミクス研究の設計では、サンプルの選択は、考慮すべき臨床状態の標的代謝フィンガープリントまたは非標的代謝フィンガープリントのいずれであっても、重要な情報を抽出し、理想的なサンプル調製を確保するために重要です。適切な初期サンプル処理が重要であり、研究⁴⁹を通じてすべてのサンプルについてプロトコルに一貫して従う必要があります。臨床サンプルを扱う際には、特に注意が必要です。NMRベースのメタボロミクスに一般的に使用されるサンプルには、生体液、細胞抽出物、および組織抽出物^{が含まれます50,51}。脳脊髄液(CSF)と尿は、多くの場合、最小限の前処理を必要とし、腎臓関連の病気、神経変性疾患、薬物毒性などの状況で頻繁に研究されています。全血、血漿、血清は、広範囲の重篤な疾患に関する包括的な情報を提供し、収集が容易なため好まれています。精液、唾液、胆汁、透析液、羊水、呼気凝縮液、肺吸引液、滑液、ミニ気管支肺胞洗浄液(mBALF)など、他の幅広い生体液が、NMR 52,53,54を用いてその特異性と精度のために広く使用されています。各生体流体は、研究または実験デザイン⁵⁵に応じて、収集、入手可能性、および情報量に関する利点と課題を提示する。この研究では、血液サンプルは通常、全身レベルで情報を提供し、日々の極端な変動によって大きな影響を受けないため、ARDS患者の血清サンプルに焦点を当てています。一方、尿サンプルはさまざまな変動の影響を受け、食事、ライフスタイル、投薬、および環境要因^{の影響を受ける可能性があります27}。また、酵素活性や微生物の分解を避けるためには、適切なサンプル保存も重要です。サンプルは通常、-80°Cで凍結融解サイクルを最小限に抑えて凍結保存されるため、代謝の分解を防ぎ、サンプルの安定性が維持されます。サンプルは-80°Cで長期間保存できるため、NMR実験を便利に行うことができます。ただし、最適な結果を得るには、できるだけ早く実験を計画して実行することをお勧めします。

本研究では、800 MHz NMR分光計を用いてデータを取得し、高分解能のスペクトルデータを取得しました。この実験では、上記と同じ取得パラメータを厳守しました。ただし、このプロトコルで概説されているのと同じ取得パラメータを、他の磁場強度で動作するNMR分光計を使用して適用できることに注意することが重要です。低磁場で操作する場合は、スキャン回数を増やすことで解像度を向上させることができます。電界強度が高いほど分解能が向上する可能性がありますが、パルスシーケンス、緩和遅延、温度制御など、取得プロセスの主要な側面は異なる機器間で一貫しており、結果の再現性と信頼性が保証されます。

標準化された手順に従うことは、偏差がその後のデータ分析と評価を妨げる可能性があるため、再現性と公平性を維持するために不可欠です。NMR実験の各ステップは、スペクトルの品質がそれらに依存するため、細心の注意を払って実行する必要があります。シミングはピーク形状を定義するため、シミングには特別な注意を払う必要があり、サンプルと研究のデザインに従って取得パラメーターを最適化する必要があります。サンプル中の代謝濃度が低いサンプルの場合、スキャンの数を増やすことができます。NMRでのデータ取得には、サンプルの選択と必要な特定の情報に合わせた1D実験と2D実験の両方の標準的な最適化が含まれます。さまざまなNMR実験は、生体流体から高品質のスペクトルを取得し、不要な高分子の影響を最小限に抑えるために最適化されています。CPMGパルスシーケンス⁵⁶ は、血清、血漿、脳脊髄液などのサンプルに適しています。この技術は、横方向の緩和時間が長く、低分子量代謝物の共鳴を不明瞭にする可能性のある脂質やタンパク質などの高分子からの広範なシグナルを抑制します。

データの前処理には、均一で均質なデータ分析とその解釈を確保するために使用される中間的な方法が含まれます。このプロセスには、不整合が発生しやすい望ましくない信号やスペクトル領域の回避、ピークシフトの修正が含まれます。生体液では、不要な領域を除外することは、多くの場合、4.6 ppm から 5 ppm の範囲を支配するシグナル (水など) を除去することを意味します。pH、温度、塩濃度、希釈係数、イオン組成の変動によって引き起こされるピークシフトは、恒常性 pH のバッファーを使用することで最小限に抑えることができます。さらに、標準参照化合物、ピークアライメント、ビニングを使用すると、ピークシフトを減らすことができます。ピークアライメントは、同じ条件下で取得した異なるスペクトル間でパターンを相関させるために重要です。

スペクトル処理は、解析の後半で正確なビニングを確保するために適切に行う必要があります。すべてのスペクトルは均一にキャリブレーションおよびアライメントする必要があり、ベースと位相の補正は手動または自動で実行できます。適切な位相補正と塩基補正、およびキャリブレーションが重要です。ベースライン補正を行うことは、代謝物の同定および定量に影響を及ぼし得る歪みを避けるために不可欠である⁵⁷。位相補正は、歪んだピークや反転したピークが結果の解釈に影響を与えないようにするために必要です。重要な代謝物を選択するための基準を慎重に決定し、それに応じて結果をフィルタリングします。ビニングはppm値の形で結果を提供するため、プロトコルに記載されているさまざまなソースを使用して代謝物の名前を正確に識別します。同じppm値に複数の代謝物が存在する場合は、ピーク形状でそれらを同定します。

統計解析を実行する前に、代謝物濃度の大きさや変動の違いによるデータセットの変動を減らすために、誘導されたかどうかにかかわらず、正規化が行われます。このプロセスには、データの分布と変動性に基づいて選択される、センタリング、スケーリング、および変換のさまざまな方法が含まれます。目標は、関心のある生物学的要因を維持しながら、不要な系統的バイアスを最小限に抑えることです。PCA、PLS-DA、OPLS-DAなどの多変量法を使用して、VIP値が1より大きい微分代謝物を確立します。モデルの予測可能性と交差検証は、R2 (適合度) と Q2 (予測性) の値を使用して決定され、順列検定統計量はモデルを検証します。Pearson 相関ベースのヒートマップは、サブ表現型と結果として得られるエンドタイプのアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションされた代謝物を列挙することにより、モデルのロバスト性を評価します。

スチューデントのt検定やANOVAなどの単変量法(ボンフェローニ補正やFDR(偽発見率)の最小化、Benjamini-Hochbergなど)は、偽陽性の可能性を減らすために使用されます。これらの方法は、分子内または分子と他の交絡因子との相関関係とは無関係に、潜在的に重要な特徴の大まかな尺度を提供します。有意な代謝物は、0.05未満のp値に基づいて同定され、その後、結果サブグループ⁴⁵の代謝エンドタイプを立証するために使用されます。

個々の箱ひげプロットとAUROCを使用して、アウトカムサブグループにおけるエンドタイプの特異性と感度を評価します。臨床スコアはAUROCのモデルと組み合わされ、モデルの精度が検証されます。AUC 値 > 0.8 は有意な⁴⁶ と見なされます。同定された代謝物の識別精度と有効性をテストするために、他のさまざまなテストがオンラインで利用できます。それらのいくつかは、ランダムフォレスト分類、ヒートマップ、相関などです⁴⁵。

重要な代謝物の定量には、ピークインテグレーションを含むさまざまなアプローチが利用されていますが、これは高度な性質を持つため、初心者にとっては困難な場合があります。代謝物の特徴的なピークを同定するには、個々の化学シフトを参照して正確に同定します。これらの特性ピークの面積を基準ピークTSPの面積に対して求めます。代謝物の絶対濃度(Cm)を計算するには、次の式を使用します。

cm=Im.nr.Cr/Ir.nm

ここで、Crは溶液中の参照化合物(TSP)の濃度、ImおよびIrはそれぞれ代謝物および参照(TSP)の積分ピーク面積(NMR処理および分析ツールを使用して取得可能)、nmおよびnrは代謝物および参照ピークを表すプロトンの数であり、それぞれ²⁴です。

あるいは、自動NMR代謝物定量ソフトウェアを使用して、参照標準TSPの濃度に基づいて単一または複数のスペクトルの代謝物濃度を取得します。この研究論文では、代謝物の定量化にソフトウェアを使用することに焦点を当てていますが、目的の代謝物がソフトウェアライブラリに存在しない場合は問題が発生する可能性があります。また、ソフトウェアは有料であるため、認可されたライセンスを持つ研究者のみが使用できます。

メタボロミクスは、疾患の重症化に寄与する代謝サイクルの調節不全を特定することにより、さまざまな疾患の複雑さを解明する上で役立つことが証明されています。しかし、これらの知見を臨床に応用することは困難でした。現在、医学界では、疾患の転帰を向上させるための個別化医療アプローチが強調されています。以前は調節不全の代謝物を特定するだけで十分でしたが、現在の取り組みでは、疾患特異的な範囲を定義するための正確な定量化に焦点を当てています。この情報は、臨床医が治療戦略をカスタマイズする際に非常に貴重です。定量化技術の進歩は研究活動を促進し、世界中の多くの研究グループが専用ソフトウェアを使用してこれらのアプローチを成功裏に採用しています。

この進歩は、メタボロミクスが個別化医療に大きな影響を与え、臨床転帰を改善する可能性を強調しています。さらに、メタボロミクスのデータをゲノミクスやプロテオミクスなどの他のオミクスデータと統合することで、疾患のメカニズムをより包括的に理解し、治療介入をさらに洗練させることが期待されます。テクノロジーが進化し続けるにつれて、臨床現場でのメタボロミクスの精度と有用性は向上し、より効果的でパーソナライズされたヘルスケアソリューションへの道が開かれると予想されます。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centirfuge	Sigma aldrich	3-18KS
Chenomx NMRスイート	NMR Suite, v9, Chenomx Inc., エドモントン, カナダ		NMR代謝物定量ソフトウェア
同軸インサート	Sigma aldrich	Z278513
Deuterim oxide	Sigma aldrich	151882
Eppendorf tubes	Tarsons	500020
Metaboanalyst	Wishart Research Group		Metabolomics 統計解析ソフトウェア
NMRチューブ	Wilmad	Z412007	5mm径
ピペット	エッペンドルフ研究プラス	3123000039	0-100 μl
サンプル収集バイアルター	ソンクライオチルバイアル	523194
ジ化ナトリウム	シグマアルドリッチ	S2002
ナトリウム結晶	シグマアルドリッチ	S9625
ナトリウム二塩基	性シグマアルドリッチ	567550
ナトリウムモノ塩基性	シグマアルドリッチ	S0751
トップスピン3.6.4	ブルカーNMR		処理および分析ツール
Tsp塩	シグマアルドリッチ	269913