2D-TAUゲル電気泳動によるヒストンプロテオフォームの解明

サマリー

この方法は、ヒストンプロテオフォームの特性評価と調査のためのシンプルで迅速な戦略を示しています。

要約

ヒストンは、メチル化、アセチル化、リン酸化、アシル化、ユビキチン化など、ヌクレオソームの動態を制御し、細胞の運命を決定するさまざまな翻訳後修飾(PTM)を受けます。クロマチンの機能単位であるヌクレオソームは、DNAと球状コアを構成する4対のヒストン(H3、H4、H2A、H2B)、クロマチン構造を安定化するリンカーヒストンH1から構成されています。ヒストンのアミノ(N)末端テールは球状コアドメインから突き出ており、クロマチンランドスケープに影響を与える明確なPTMを受けます。いくつかの証拠は、ヒストンPTM恒常性がすべての生理学的活性を維持するために重要であることを示唆しています。ヒストンPTMの調節解除は、異常な細胞増殖、浸潤、および転移の主な原因です。したがって、ヒストンPTMsを特徴付ける方法を開発することは非常に重要です。ここでは、ヒストンアイソフォームの単離と分析に有効な手法について説明します。この分析法は、2つの直交する分離の組み合わせに基づいており、ヒストンアイソフォームの濃縮とそれに続く質量分析の同定を可能にします。Shechterらによって最初に報告されたこの技術は、サイズと電荷に基づいて塩基性ヒストンタンパク質を分離できる酸性尿素ポリアクリルアミドゲル(TAU-GEL)と、分子量によってタンパク質を分離できるドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル(SDS-PAGE)を組み合わせたものです。その結果、ヒストンアイソフォームの2次元マップが得られ、ゲル内消化とそれに続く質量分析、およびウェスタンブロット分析に適しています。その結果、ヒストンアイソフォームの2次元マップが得られ、ゲル内消化とそれに続く質量分析の同定、およびウェスタンブロット分析の両方に適しています。このプロテオミクスアプローチは、単一のヒストンアイソフォームの濃縮と新しいヒストンPTMの特性評価を可能にする堅牢な方法です。

概要

がんの発症、進行、および化学療法抵抗性は、ヒストンPTMを含む遺伝的およびエピジェネティックなイベントに関連しています。ヒストンは、クロマチンダイナミクスを調節し、細胞の運命を決定するさまざまなPTMを受けます¹。

ヌクレオソームはクロマチンの機能単位であり、DNAを核にパッケージ化することを可能にするDNAとタンパク質の分子複合体です。ヌクレオソームコアを構成する4対のヒストン(H3、H4、H2A、H2B)と、クロマチン構造の安定化を助けるリンカーヒストンH1で構成されています。ヒストンのアミノ(N)末端尾部は、球状のコアドメインから突出し、クロマチンランドスケープに影響を与える特定の翻訳後修飾を受ける²。

これまでに、少なくとも23種類のヒストンPTMが知られています。これらのPTMは、主にメチル化、アセチル化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、SUMO化、およびADP-リボシル化^からなる共有結合修飾です3。さらに、エピゲノムの恒常性と代謝再配線との間の密接な相関関係が最近提案されており、ヒストンPTM^の可能な数の指数関数的な増加を説明しています4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 .ヒストンPTMは、モディファイア酵素によって堆積、消去、および形質導入され、それぞれライター、イレイサー、リーダーと呼ばれます。それらはクロマチン構造の物理的および化学的特性に影響を及ぼし、腫瘍抑制遺伝子および癌遺伝子14,15,16の発現を含む遺伝子発現プロファイルに影響を与える。

ヒストンプロテオフォームの数は、ヒストン変異体としてヌクレオソームに取り込まれると増加します。これらの変異体は、標準的なヒストンの非対立遺伝子アイソフォームであり、クロマチンの化学的および物理的特性を変化させることにより複雑さを増します。標準的なヒストンと比較して、ヒストン変異体は、独自の翻訳後修飾を受けるか、特定のクロマチン成分と相互作用する機能ドメインを持ち、ヌクレオソーム¹⁷のダイナミクスと安定性に影響を与えます。

がん細胞では、ヒストンPTMおよび変異体の調節解除が遺伝子発現プロファイルに影響を及ぼし、異常な細胞増殖、浸潤、転移、および薬剤耐性経路の活性化につながる3,18,19,20。ヒストンまたはクロマチンリモデリング複合体内の変異は、細胞の表現型を変化させ、腫瘍性の形質転換に寄与する可能性があります。ヒストンメチル化などのエピジェネティックな変化の蓄積は、薬剤耐性経路を活性化する重要な要素^です21,22,23。SWI/SNF複合体内の変異は、29の遺伝子によってコードされる15のサブユニットから構成され、多くの腫瘍タイプにわたるヒトのがんの20%以上に影響を与えます。この10年間で、エピジェネティックに基づく薬物戦略(エピドラッグ)が開発され、ヒストン修飾パターンに異常があるがんを標的とした多くの薬剤が米国食品医薬品局(FDA)によって承認されています²³。

ヒストンタンパク質の分析は非常に困難であり、要求の厳しい研究分野となっています。最近では、質量分析法がヒストンプロテオフォームの特性評価と研究に適した方法となっています。しかし、抜本的な抽出条件は、一部のバリアントの溶解性の低さや配列相同性が高いことと相まって、その分析を困難にしています。

過去10年間で、ヒストンプロファイリングと調査のために、質量分析に基づくいくつかの方法が開発されてきました24,25,26,27。この研究では、ヒストンプロテオフォームの2次元マップを作成するための費用対効果が高く信頼性の高い方法を提示します。これにより、新しい翻訳後修飾を発見する可能性を高めることができます。

2D TAU電気泳動は、酸性条件下での分離とSDS PAGEを組み合わせたものです。最初の次元では、培地の酸性状態は、塩基性タンパク質に正味の正電荷を与えます。ヒストンは非常に塩基性タンパク質であり、培地と比較して等電点(pH)が高いため、正に帯電し、電場下で移動します。2次元では、ヒストンはSDSによって変性され、分子量に基づいて分離されます。得られた2Dマップは、質量分析分析および免疫学的研究^28,29のための単一スポット分解能で特定のプロテオフォームを濃縮するためのツールとして使用できる。電気泳動後、2D TAUスポットを脱染し、トリプシン消化し、質量分析法で分析することができます。あるいは、2D TAUマップをニトロセルロース/PVDFフィルターにブロットし、免疫染色²⁷によって調査することができる。

この文脈では、これらの方法は、代謝再配線と相関する新規の翻訳後修飾の同定と分析を改善するための戦略的である可能性があります^30,31。

私たちは、DNAの分解とタンパク質溶解性の向上に役立つ超音波処理ステップを組み込むことにより、元の方法をさらに改善しました。さらに、高純度のタンパク質サンプルを得るために、ヒストン抽出のためのインキュベーションステップを延長しました。さらに、私たちのプロトコルでは、より良い分解能を達成するために、最初の次元を低電圧でより長い時間実行しました。得られたゲルは、標準的なヒストンPTMを調査し、糖化などの新規修飾を特徴付けるために使用されました^10,32。

全体として、ヒストンを抽出・精製する方法を開発し、続いて2次元マップを用いてヒストンプロテオフォームを分離しました。この作業には、質量分析のためのゲル内消化の手順や、2次元ウェスタンブロット分析の手順も含まれています。

プロトコル

1. ヒストン抽出

1. 80%がコンフルエントである少なくとも1 x 10⁶ 細胞からヒストン抽出を行います。この実験では、ATCCのMCF-10A細胞株を使用しました。プレーティング後、1 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を3回洗浄します。氷上ですべてのステップを実行します。
2. 10 mM Tris-HCl pH 8.0、1 mM KCl、および1.5 mM MgCl₂を含む細胞溶解バッファーを調製します。使用直前に1 mMジチオエリスリトールとプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を添加します。
3. 細胞含有シャーレに800 μLの細胞溶解バッファーを加え、細胞をこすり落とし、1.5 mLチューブに集めた後、ローテーター上で300 rpm、4°Cで1時間インキュベートします。
4. 10,000 x g、4°Cで、1.5 mLチューブ用のローテーターを備えた予冷マイクロ遠心分離機で10分間遠心分離します。
5. ペレットを400 μLの細胞溶解バッファーで洗浄し、10,000 x g、4°Cで10分間遠心分離します。上清を捨てます。洗浄手順を3回繰り返します。
   注:すべてのステップで、1.5 mLチューブ用のローテーターを備えた予冷された微量遠心分離機(4°C)を使用してください。材料の損失を避けるために、ペレットは慎重に取り扱ってください。
6. ペレットを640 μLの0.2 M H₂SO₄ に再懸濁し、ローテーター上で300 rpm、4°C、16時間インキュベートします。
   注意: 硫酸は危険な化学物質です。薬品ドラフトの下でご使用ください。
7. 16,000 x g、4°C、10分間遠心分離します。上清を新しいチューブに移し、次の手順まで保管します。核の破片を捨てます。
8. 212 μLのトリクロロ酢酸を一滴ずつ添加してヒストンを沈殿させます(TCAの最終濃度は33%)。チューブを10倍反転させて溶液を混合します。氷上で、暗闇の中で16時間インキュベートします。
   注意: TCAは危険な化学物質です。化学薬品のヒュームフードの下で使用してください。
9. ヒストンをペレット化するには、予冷した遠心分離機で16,000 x g 、4°Cで10分間遠心します。 上清を慎重に取り除き、ペレットを200μLの冷たいアセトンで3回洗浄します。
10. ペレットを冷たいアセトンで再懸濁し、次に30秒のオン/オフを3サイクルで高出力2回超音波処理し、氷上で10分間の一時停止を交互に行います。
    注:この手順は超音波装置を使用して行われました。このステップは、ヒストンに包まれたDNAを排除するために不可欠です。
11. 16,000 x g で 10 分間遠心分離し、アセトンを廃棄し、サンプルを 100 μL の再蒸留水に再懸濁します。製造元の指示に従って、Bradfordアッセイ法を使用してタンパク質濃度を決定する³³。
    注:遠心分離後、ペレットが白くまたは半透明に見えることがあります。白く不透明な沈殿物は、2D 分離を損なう可能性のある塩分汚染物質の存在を示している可能性があります。その場合は、ペレットが半透明になるまでアセトン洗浄手順を繰り返します。
12. 製造元の指示に従って、70μgのヒストンを凍結乾燥します。凍結乾燥機を30°Cに60分間セットします。チューブの容量を確認し、サンプルが完全に凍結乾燥されるまで30°Cでステップを繰り返します(通常、サンプルを完全に凍結乾燥するには90分が必要です)。60分後、プロセスはサンプルに依存するため、10分ごとに容量を確認してください。
    注:ヒストンタンパク質の量が少ない場合は、2 x 10⁶ 細胞から開始します。この場合、1 x 10⁶ セルに使用したのと同じ量の試薬を使用してください。手順中に使用されるすべての化学物質の純度を確認してください。すべての試薬はHPLCグレードでなければなりません。

2. ミニ2Dゲルトリトン酸尿素(TAU)電気泳動

1. 以下に説明するように、mini vertical polyacrylamide gel electrophoresis system 用のmini-TAUゲルを調製します。
   1. 分離ゲルを調製:6 M尿素、15%アクリルアミド/ビスアクリルアミド(29:1)、5%氷酸酢酸、0.25%Triton X-100(v / v)、0.4%TEMED(v / v)、0.1%APS(p / v)。溶液を調製するには、尿素をアクリルアミド/ビスと超純水1mLに溶解し、室温で穏やかに攪拌します。他のコンポーネントを追加し、音量を調整します。mini-TAUゲルの場合は、10 mLの溶液を調製します。プリセットされたゲルプレートに溶液を充填し、上部からわずか1.5cmのところに気泡が形成されないようにします。溶液を1mLのイソプロパノールで覆い、ゲルを平らにします。
   2. スタッキングゲルを調製:6 M尿素、6%アクリルアミド/ビスアクリルアミド(29:1)、5%氷酸酢酸、0.25%Triton X-100(v / v)、0.4%TEMED(v / v)、0.1%APS(p / v)。溶液を調製するには、尿素をアクリルアミド/ビスと1mLの超純水に溶解します。他のコンポーネントを追加し、音量を調整します。ゲルプレートにスタッキング溶液を充填し、プレートの間に10ウェルのゲルコームを置き、ゲル溶液がコームの歯の半分まで来るまで挿入します。ゲルを4°Cで16時間重合させます。
      注意: 井戸が規則的に形成されるように、コームを慎重に挿入します。
2. 6 M 尿素、5% 氷酸酢酸、および再蒸留水を溶解して、100 μL の TAU サンプルバッファーを調製します。調製した凍結乾燥サンプルを30 μLのTAUサンプルバッファーに溶解します。
3. ミニカセットにTAUランニングバッファー、5%酢酸最終濃度を充填します。TAU-gelのウェルをランニングバッファーで満たされたシリンジで洗い流し、マイクロピペットを使用してサンプルをウェルにロードします。
4. 電気泳動チャンバーを電源に接続し、プラス(赤)電極を下部に配置します。IPがpH>すると、タンパク質は正に帯電するため、正極から負極への移行になることに注意してください。まずゲルを30Vで70分間、次に25Vの定電圧で17時間泳動します。
   注意: この間、時々電源を切り、使い捨ての注射器を使用してゲルウェルをすすいでください。シリンジを使用してゲルの底面から気泡を取り除くように注意し、サンプルの損失や分離されたタンパク質の汚れの存在を避けてください。
5. ゲルプレートからゲルを取り出し、きれいなメスで目的の線を切ります。ゲルの破損を防ぐために、ゲルは慎重に取り扱ってください。対象ラインは無色であるため、サンプルをウェル番号1にロードして、対象レーンを正確に特定してカットします。
   注:mini-TAUゲルでの分離を確認するには、サンプルを二重に調製して分析します。これらのゲルの1つは、Coomassie Brilliant Blueを使用して染色できます。分離のパターンを 図 1A に示します。
6. レーンを 15 mL の 0.5 M Tris-HCl pH 8.8 で 15 分間洗浄します。
7. 6 M 尿素、0.5 M Tris-HCl、pH 6.8、30% グリセロール、20% SDS、および 2% ジチオエリスリトールを使用して、15 mL の平衡化バッファー 1 を調製します。6 M 尿素、0.5 M Tris-HCl、pH 6.8、30% グリセロール、20% SDS、および 2% ヨードアセトアミドを使用して、15 mL の平衡化バッファー 2 を調製します。使用直前に平衡化バッファー1および2を準備します。平衡化バッファー2を暗所に保管します。
8. 穏やかに撹拌しながら、ゲルレーンを10 mLの平衡緩衝液1で15分間インキュベートし、次いでデカントします。穏やかに攪拌しながら、10 mLの平衡緩衝液2とゲルレーンを暗所で15分間インキュベートし、その後デカントします。
9. 表1に従って、分離SDS 15%アクリルアミドゲルを調製します。ゲルプレートをセットし、分離ゲル溶液を充填します。長いゲルプレートの端から1.5cmになるまで溶液を満たします。表面に1mLのイソプロパノールを敷いてゲルを平らにし、重合させます。
10. ゲル重合後、イソプロパノールをデカントし、3MM Chr Cellulose Chromatography Paperでウェルを乾燥させます。ステップ8で得られたレーンをゲルウェルに挿入します。
11. 1x Tris/glycine/SDSバッファーに0.5%低融点アガロースを溶かし、0.003%ブロモフェノールブルー5μLのシール溶液で、レーンを分離ゲルにシールします。アガロースゲル重合を30分間行います。
    注:ゲルの汚れを防ぐために、アガロースのシーリング中に気泡が形成されないようにしてください。
12. ゲルプレートをカセットに入れ、1x Tris/グリシン/SDSバッファーを充填します。ブロモフェノールブルー染料が底に達するまで、ゲルを120Vで泳がせます。プレートからゲルを静かに取り出し、余分なアガロースを廃棄し、質量分析または免疫学的アッセイ用のブロットと互換性のある手順を使用してゲルを銀染色します。

3. 銀染色 ³²

1. 以下の試薬を準備します - 固定剤:50%メタノール、5%酢酸、45%脱イオン水;洗浄液:メタノール50%、脱イオン水50%。増感剤:脱イオン水中の0.02%Na₂S₂O₃ 5H₂O;銀試薬:0.1%硝酸銀を冷水(4°C)脱イオン水に溶かします。現像液:0.04%ホルマリンおよび2%Na₂CO₃、ホルムアルデヒド(37%)(使用直前に添加)0.4mLの脱イオン水および1000mLまで充填する。ストップ試薬:5%酢酸;ゲル保存溶液:1%酢酸。
   注:染色に使用する薬品は危険ですので、すべての手順を薬品ドラフトの下で行ってください。
2. 表 2 の手順に従って、以下の点を考慮してください。すべてのインキュベーションを穏やかに攪拌して行ってください。現像ステップを開始する前に、停止試薬を準備します。これにより、適切な強度でゲルの発達が保証されます。開発段階では、スポットが黄色のシグナルとして現れ、インキュベーションの終了時には薄茶色になります。異なるスポットの強度は、ヒストンプロテオフォームの量によって異なります。ゲルは、スポット切除およびゲル内消化の準備ができています(図1B)

4. ゲル内消化

1. 次の溶液を準備します:50 mM重炭酸アンモニウム(NH₄HCO3)/ 50%(v / v)アセトニトリル;10 mM ジチオスレイトール (DTT) in 50 mM NH₄HCO₃;50 mM NH₄HCO₃ 中の 55 mM ヨードアセトアミド (IAA);0.1%TFA;50 mM NH₄HCO₃、pH 8;HPLCグレードのアセトニトリル;1mLシリコンチューブ。
   注意: 髪の毛や皮膚からの人間のケラチン汚染を回避するには、清潔な手袋を使用し、清潔な場所で作業してください。
2. 清潔なメスを使用して染色したゲルから目的のヒストンスポットを切除し、それらを新しいシリコンチューブ(1.5 mL)に入れます。アイソフォームの相互汚染を避けるために、1つのスポットを切り取り、1つのチューブに入れるように注意してください。
3. 各ゲルスポットに250 μLの50 mM NH₄HCO₃/50%アセトニトリルを添加し、室温のサーモミキサーで穏やかに攪拌しながらインキュベートします。溶液をデカントし、この手順を3回繰り返します。ゲル片は透明に見えます。
4. アセトニトリル(200 μL)を添加してゲルスポットを脱水します。この段階で、ゲル片は不透明な白色を帯びます。
5. アセトニトリルをデカントし、10分間風乾させます。ゲル片はチューブ内で乾燥しているように見えます。ヒストンタンパク質は平衡化ステップ中に還元およびアルキル化されているため、還元とアルキル化は必須ではありません。
6. ゲルスポットを20 μLのトリプシン溶液(0.1 mM HCl)またはゲル片を覆うのに十分な容量で再水和します。チューブをサーモミキサーに入れ、穏やかに攪拌しながら、37°Cで最低4時間から16時間インキュベートします。
7. トリプシンペプチドを含む上清を新しいチューブに移します。.50 μLの抽出溶液(60%アセトニトリル、1%TFA)をゲル片に加え、超音波水浴で4°Cで10分間2回超音波処理します。
8. 追加のトリプシンペプチドを含む上清を新鮮なチューブに移します。凍結乾燥機を使用して、プールされた抽出ペプチドを乾燥させます。凍結乾燥機を30°Cにセットし、溶液を乾燥させます。凍結乾燥されたペレットがチューブ内に現れます。
   注: この手順はボリュームに依存します。一般的には1時間で十分ですが、サンプルが完全に乾燥するまで10分ごとに容量を確認してください。
9. 各チューブに15 μLの0.1 % TFAを加え、25°Cのサーモミキサーで静かにインキュベートします。 上清をバイアルに移し、LC-MS/MS 分析を行います。

5. 2DTAUウェスタンブロット

1. トランスファーバッファー、250 mM Tris base、92 mM グリシン、および 10% メタノールを、再蒸留水で調製します。
2. ニトロセルロースメンブレンと濾紙をゲルの寸法にカットします。
3. ゲルを平衡化し、メンブレン、濾紙、および濾紙を転写緩衝液に15分間浸します。ニトロセルロースまたはPVDFメンブレンのいずれかを使用してください。PVDF(ポリフッ化ビニリデン)メンブレンを使用する場合は、100%MetOHに浸して活性化します。
4. 次のようにセミドライ転写用のカセットにゲルサンドイッチを準備します:負極/フィルターペーパー/ゲル/ニトロセルロース膜/フィルターペーパー/正極。ゲルとメンブレンの間の気泡を取り除き、良好な結果が得られるようにします。
5. カセットをセミドライユニットにセットし、ブロットを25Vで30分間泳動します。最後に、ブロッティングサンドイッチを分解し、免疫学的アッセイのためにメンブレンを保存します。Ponceau染色で転写効率を確認します。メンブレンの右上に記号を付けて、フィルターの向きを適切に保ちます。
6. 実験に応じて、一次抗体および二次抗体とインキュベートします(図2)。

結果

図1Aでは、ヒストンタンパク質が1Dゲル内でどのように移動するかを観察することができます。これは、最初の次元の実行時間を理解するための重要な準備ステップです。分離の適切な時間が決まったら、2 番目のディメンションを実行します。ヒストンプロテオフォームの2Dマップは、独特のトポグラフィーパターンを示しています(図1B)。図1Bの各スポットは、特定のヒストンタイプを表しています。各ヒストンプロテオフォームが見つかるゲルの正確な領域を観察します。各ヒストンプロテオフォームの質量分析同定は、Perri et ^al.32で報告されています。したがって、この状態の各スポットは、特定のヒストンタイプに関連付けられています。標準的なスポットと並んで追加のスポットが存在することは、新しい変更の存在を示している可能性があります。ゲル画像はデンシトメトリーを使用して取得でき、得られた画像は画像解析ソフトウェアを使用して分析できます。

2D TAU マップの信頼性は、スポットの丸みに依存します。ランが正しく実行されている場合、スポットは個別のシグナルとして表示され、水平および垂直のストリーキングは見えません。逆に、サンプル、溶液、およびアガロースのオーバーレイ中の不純物は、ゲルに縞や縞模様を引き起こす可能性があります。ゲルの品質は、画像のデジタル化とそれに続く定量的および定性的な分析に影響を与えます。さらに、ウェスタンブロット解析やMS調査の成功にも影響を与える可能性があります。この分析法の信頼性を検証するために、分離されたヒストンプロテオフォームのニトロセルロースメンブを、一次抗体アセチル化リジン(Ac-K2-100)ウサギ^mAb32 でプローブしました(図2)。抗ウサギHRP二次抗体を使用して、ヒストンシグナルを検出しました。予想通り、デンシトメーターを使用すると、ブロット中に存在する各ヒストンバリアントの特異な翻訳後修飾を定量化することができます。

図1:1Dおよび2D TAUgel. (A)1D TAUgelを使用して得られたヒストントポグラフィーパターンの代表的な画像。(B)2D TAUgelを用いて得られたヒストントポグラフィーパターンの代表画像。データの同定はPerri et al. ³²によって報告されています。予想通り、各スポットは特定のヒストンタンパク質を表しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:代表的な2DTAUウェスタンブロット。この画像では、各ヒストンタンパク質のリジンアセチル化のレベルを観察することができます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

試薬	濃度:15%
40% アクリルアミド/Bis	3.75
1.5 M トリス pH 8.8	2.5ミリリットル
ミリクウォーター	3.6ミリリットル
10%のSDS	100μL
10%のAPS	50 μL
テメド	5 μL

表1:分離ゲル溶液組成。

歩	時間
メタノール50%/酢酸5%の固定	1時間
30%エタノールを洗浄します	2 x 20分
脱イオン水を洗浄	1 x 20分
増感剤チオ硫酸塩試薬	1分間
脱イオン水を洗浄	3 x 20秒
銀硝酸銀	30分
脱イオン水を洗浄	3 x 1分
開発開発者	25-30分注:斑点が見えるまでゲルを現像します(薄茶色)
停止ソリューション	1 x 10分
脱イオン水を洗浄	2 x 5分
脱イオン水を洗浄	1時間

表2:銀染色法。

ディスカッション

過去10年間で、がん患者の治療は、がんの発生と進行を促進するさまざまな分子変化を特定することにより、革命をもたらしました。現代の腫瘍学における最も重要な進歩は、包括的な分子解析に基づく治療法の開発です。ゲノミクスとプロテオミクスの技術的進歩は、早期発見、監視、予後、および薬物モニタリングのための特定のバイオマーカーのプロファイリングにおいて重要な役割を果たしてきました。プロテオミクスは、特定の条件下での細胞、組織、または生物の完全なタンパク質補体の分析として定義され、タンパク質相互作用、翻訳後修飾、および局在化の研究も含まれます³⁴。プロテオミクスの特定の領域はエピプロテオミクスであり、これにはヒストンの翻訳後修飾の体系的な研究が含まれます。これらは、がんの発生と進行に関連しています³⁵。この論文では、細胞の表現型に寄与する特定のヒストンアイソフォームを同定する方法を概説しています。

この分析法の重要なステップは、溶解性が低く塩基性が高いヒストンを抽出することです。その主な制限は、2Dマップの複雑さとバリアントの数が少ないため、MS/MS分析が困難になる可能性があります。

全体として、このアプローチの主な利点は、どの研究室でも実施でき、適切な予防策を講じてミニゲル装置を所有できることです。この文脈で、この方法は、施設内の大規模な施設の恩恵を受けられない多くの科学者が、エピプロテオームに関する知識の向上を目指して、新しいエピマーカーを特定するのに役立つと確信しています。さらに、この手法は、サービスとして外部委託可能な質量分析と組み合わせることで、新規なプロテオフォームを発見することができます。また、免疫学的アッセイと併用して、市販の抗体が利用可能な特定の翻訳後修飾の変化を確認することもできます。

この方法は、乳がんの発症に関連するヒストン修飾の典型的な変化を研究するために使用されてきました²⁸、およびマウス胚性幹細胞³⁶におけるH1の修飾を調べるために使用されています。さらに、この方法は、急速に成長する線維芽細胞におけるヒストンカルボニル化³⁷のレベルを測定し、ヒストン糖化やヒストンMARylation38などの新しいヒストン修飾を探索するために成功裏に採用されています。

私たちの視点から、この方法は、新規ヒストンPTM、特にアセチル化、マロニル化、メチル化、脂質化、乳酸化、酪化などの特定の代謝経路の異常な活性化に関連するもののプロファイリングにうまく適用できると確信しています。最終的には、この方法は、個々のプロテオフォームを単離するためのマイクロ調製ツールとしても機能し、代謝関連PTMの分析を容易にする可能性があり、それによってこの重要な研究領域の理解を深めることができます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1,4-ジチオエリスリトール	SIGMA- ALDRICH	D8255	メンテナンス用試薬 −縮小状態のSHグループ。ジスルフィドを定量的に低減します。
1,5 M Tris-HCL バッファー、pH 8.8	BIO-RAD	161-0798	分離ゲルバッファー
10x Tris/Glycine/SDS	バイオ・ラッド	1610772	このプレミックスされた10x Tris/glycine/SDSランニングバッファーを使用して、SDS-PAGEによるタンパク質サンプルの分離を行います。
2-プロパノール	SIGMA-ALDRICH	33539	2-プロパノール(イソプロパノール)は二次アルコールです。さまざまな燃料電池で使用するための燃料の代替としてテストされています。2-プロパノールに溶解したCuO粉末は、Cuコロイドのレーザーアブレーション支援合成に使用されています。Zn(NO3)2との2-プロパノールの懸濁液は、P25-TiO2の均一に厚い層でコーティングされた二酸化チタン被覆ステンレス鋼(P25-TiO2 / SS)光陽極の製造に採用されています。
アクリルアミド/ビス溶液30%	BIO-RAD		1610158 2.6% 架橋剤。電気泳動純度試薬
酢酸 氷河	カルロ・エルバ・レアジェンツ	401392	酢酸は、多くの工業用途を持つ重要な化学試薬です。
アセトン	Panreac Applichem	211007.1214	アセトン は、さまざまな実験室、製造、および洗浄用途での汎用性で有名な溶剤です。
HPLC用アセトニチル	VWR	83640320	LC-MS グレード
Agarose	Invitrogen	15510-027	Agarose は ヘテロ多糖類 分子生物学で頻繁に使用されます。
重炭酸アンモニウム	SIGMA-ALDRICH	A6141	最小 99,0%
過硫酸アンモニウム	SIGMA-ALDRICH	A3678	分子生物学用、電気泳動用、≥98%
Bioruptor plus	Diagenode	B01020001 - B01020002- B01020003	sonicator
Dithiothreitol	SIGMA- ALDRICH	D9163-5G	タンパク質中のジスルフィド結合を減少させるために使用される還元剤。
ドデカシルバーステインキット	BIO-RAD	161-0480	Dodecaシルバーステインキットは、ポリアクリルアミドゲル中のタンパク質のノナグラムレベルの検出に使いやすいです。
グリセロール	GE-ヘルスケアライフサイエンス	171325010L	グリセロールは単純なトリオール化合物であり、勾配ゲル、タンパク質安定剤、および貯蔵緩衝成分の鋳造を支援するために関与しています。
HOLTホスファターゼ阻害剤	Thermo SCIENTIFIC	78428	Thermo Scientific Halt Phosphatase Inhibitor Cocktailは、細胞溶解または組織タンパク質抽出中およびその後のタンパク質のリン酸化状態を保持します シングルユースカクテル(100X).
HALTプロテアーゼ阻害剤	Thermo SCIENTIFIC	78430	Thermo Scientific Halt Protease Inhibitor Cocktail(100X)は、細胞溶解およびタンパク質抽出中のタンパク質分解を防ぐためにサンプルに添加するプロテアーゼ阻害剤の濃縮ストック溶液です。シングルユースカクテル(100X).
塩酸	SIGMA-ALDRICH	H1758	BioReagent、分子生物学用
ヨードアセトアミド	SIGMA-ALDRICH	I6125	≥99% (NMR), 結晶性
KCl	SIGMA-ALDRICH	P9541	塩化カリウム, KCl, is 一般的に実験室のルーチンで使用されます。pH電極の保存緩衝液として、また導電率測定の参照溶液としての使用は十分に確立されています。
MCF10細胞株	atcc	CRL-10317	1984年に線維嚢胞性乳房を有する白人女性36歳の乳腺から単離された上皮細胞株。この細胞株は、ミシガンがん財団によって寄託されました。
MgCl2	SIGMA-ALDRICH	208337	塩化マグネシウムは無色の結晶性固体です。
N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン	SIGMA-ALDRICH	T9281	電気泳動用、約99%
リン酸生理食塩水緩衝液 1X	Corning	15373631	1 X PBS(リン酸緩衝生理食塩水)は バッファ付き 平衡塩溶液 解離前の細胞の洗浄、細胞や組織の輸送、計数のための細胞の希釈、試薬の調製など、さまざまな生物学的および細胞培養アプリケーションに使用されます。
ヘキサシアノバクテリア酸カリウム	SIGMA-ALDRICH	60299	電子受容体、電子輸送を伴うシステムで採用
SDS 溶液 20% (w/v)	BIO-RAD	161-0418	ドデシル硫酸ナトリウム。電気泳動純度試薬
チオ硫酸ナトリウム、試薬プラス99%	SIGMA-ALDRICH	21,726-3	オ硫酸ナトリウム、試薬プラス99%
硫酸	SIGMA-ALDRICH	339741	硫酸、試薬、 非常に腐食性の酸で、黄色がかったわずかに粘性のある液体として提供されます。水に溶け、二プロトン酸です。それは非常に強い腐食性、脱水および酸化特性を有するだけでなく、吸湿性である。
トリクロロ酢酸	SIGMA-ALDRICH	T6399-5G	トリクロロ酢酸 (TCA) は タンパク質1,2および核酸3の沈殿試薬として使用されます。
トリフルオロ酢酸	Riedel-de Haën	34957	トリフルオロ酢酸
Triton X-100	SIGMA- ALDRICH	T9284-1L	Triton X-100は、タンパク質の抽出と可溶化に最も頻繁に使用される非イオン性ポリオキシエチレン界面活性剤です。
ブタの膵臓からのトリプシン	SIGMA-ALDRICH	T6567	Proteomics Grade, BioReagent, ジメチル化
尿素	SIGMA-ALDRICH	33247	尿素はカオトロピック剤で、タンパク質の変性に使用されます。それはタンパク質の二次、三次および四次構造における水素結合を乱します。また、DNAの二次構造に存在する水素結合を乱すこともあります