環境汚染物質の核内受容体への結合親和性を評価するためのハイスループットスクリーニングアプローチ

Summary

このプロトコルは、核内受容体に結合する特定の蛍光プローブの蛍光分極を環境汚染物質のスクリーニングの読み出しとして使用するハイスループットスクリーニングシステムについて説明しています。

Abstract

環境中には、ますます多くの化合物が検出され、広範囲にわたる汚染を引き起こし、人間の健康にリスクをもたらしています。しかし、その高い環境発生にもかかわらず、その毒物学的影響に関する情報は非常に限られています。毒物学的研究を導くためのハイスループットスクリーニング(HTS)法の開発が急務です。本研究では、HTSシステムを用いた受容体-リガンド結合アッセイを開発し、核内受容体に対する環境汚染物質の結合力を決定しました。この試験は、マイクロプレートリーダー(つまり、さまざまな化学物質を含む96ウェルプレート)を使用して、特定の蛍光プローブの蛍光分極(FP)を測定することにより行われます。このアッセイは、組換えベクターの構築と形質転換、受容体タンパク質(リガンド結合ドメイン)の発現と精製、受容体プローブ結合、および化学物質と受容体の競合的結合の4つの部分で構成されています。2つの環境汚染物質、ペルフルオロオクタンスルホン酸(PFOS)およびリン酸トリフェニル(TPHP)とペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ(PPARγ)との結合力を決定し、アッセイ手順を例示しました。最後に、この方法の長所と短所、およびその潜在的なアプリケーションについても説明しました。

Introduction

環境や人体からは、多くの化学物質が広く検出されており、生態環境や人間の健康への影響について大きな懸念が生じています^1,2,3。それらの高い環境発生にもかかわらず、それらの毒物学的影響に関する情報は乏しいです。そのため、化学毒性の評価を容易にするためのハイスループットスクリーニング(HTS)法の開発が急務となっています。

Tox21およびToxCastプログラムで使用されるHTSバイオアッセイなど、化学毒性評価のためのいくつかのハイスループットスクリーニング(HTS)法が報告されています^4,5。これらの方法は、潜在的な毒物を迅速に特定し、化学的毒性のメカニズムに関する貴重な情報を提供することができます。しかし、これらのHTSバイオアッセイは主に細胞ベースのシステムに依存しており、複雑で高価になる可能性があります。さらに、化学物質の毒性評価にはハイスループットシーケンシング法も使用されていますが、化学物質のハイスループット評価を達成することは依然として困難です⁶。これまでの研究では、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体(PPAR)⁷などの核内受容体を持つ、パーフルオロアルキル化合物およびポリフルオロアルキル化合物(PFAS)^7,8,9、ビスフェノールA(BPA)^10,11、粒子状物質(PM)¹²など、いくつかの環境汚染物質の結合力を決定するための蛍光分極(FP)ベースの受容体-リガンド競合的結合アッセイが開発されました^。 8,9,10,13、ファルネソイドX受容体(FXR)^11,12、および甲状腺受容体(TR)^14,15。このアプローチは、効率的で費用対効果が高く、メカニズムに関する洞察を提供します。

この研究では、受容体-リガンド結合アッセイのプロトコルが、小さな蛍光プローブの蛍光分極(FP)の検出に基づいて説明されています。FPベースの受容体-リガンド結合アッセイの原理を図1に示します。小さな蛍光分子が平面偏光によって励起されると、放出された光は急速な分子回転により高度に脱分極します。しかし、トレーサーがより大きな受容体に結合すると、その回転は遅くなります。トレーサーが大きな受容体に結合しているときは高いFP値が検出され、トレーサーが空いているときは低いFP値が観察されます。ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ(PPARγ)を精製して、プローブを受容体に結合させました。ロシグリタゾン(Rosi)、パーフルオロオクタンスルホン酸(PFOS)、およびリン酸トリフェニル(TPHP)を使用して、プローブと受容体の結合を競いました。PPARγの特異的アゴニストであるRosiは、受容体競合的結合アッセイのポジティブコントロールとして使用されました。さらに、PFOSおよびTPHPは、過去の研究8,9,10,11,12,13,14,15,16,17において、PPARγの弱いアゴニストとして以前に同定されている。さらに、それらは環境曝露で知られる化合物のさまざまな構造カテゴリに属しており、ヒト集団での検出率が比較的高いことで注目に値します。これらの化合物を使用して、競合結合アッセイの広範な適用性をさらに検証しました。この手順は、組換えベクターの構築と形質転換、受容体タンパク質(リガンド結合ドメイン)の発現と精製、受容体プローブ結合、および化学物質と受容体の競合的結合の4つのステップで構成されています。

Protocol

試薬と機器の詳細は 、材料表に記載されています。

1. 組換えベクターの構築と形質転換

注:PPARγは、古典的な核内受容体構造を持つリガンド依存性転写因子であり、標的遺伝子を調節するDNA結合ドメインと、リガンドによって活性化されるリガンド結合ドメインで構成されています。リガンドが活性化すると、PPARγは別の核内受容体であるレチノイドX受容体(RXR)とヘテロ二量体を形成し、PPARγの応答要素に結合することで、下流の標的遺伝子の転写を調節します^9,16。

1. PPARγ-LBDのプライマーを設計し( 表1を参照)、PPARγ-LBD DNAセグメントを増幅します( 表2 および 表3を参照)。
2. His×6タグ付きpET28aベクターを制限エンドヌクレアーゼXhoIおよびBamHI18で消化することにより、直鎖化します。
3. 市販のクローニングキットを用いて、PPARγ-LBD DNAセグメントをHis×6タグ付きpET28aベクターにクローニングし、組換えプラスミドpET28a-PPARγ-LBD-6×His¹⁸を得ます。
4. 組換え発現プラスミドpET28a-PPARγ-LBD-6×HisをBL21(DE3) 大腸菌 細胞にトランスフェクションし、タンパク質発現¹⁸を行います。
5. 5 μLの組換えベクターをコンピテントBL21(DE3)細胞に加え、氷上で30分間インキュベートし、42°Cで45秒間ヒートショックを行った後、すぐに氷に戻します。
6. 900 μL の LB 培地を加え、37 °C で 1 時間 (160-200 rpm) 振とうした後、~3000 x g で室温で 5 分間遠心分離します。
7. 上清を捨て、バクテリアペレットを100μLのLB培地に再懸濁し、固体培地に広げます。プレートを反転させ、37°Cで12〜16時間培養します。
8. シーケンシングの同定とその後のタンパク質発現および精製のために、個々のコロニーを選択します。

2. 受容体タンパク質の発現と精製

1. 形質転換BL21(DE3)細胞を、100 μg/mLアンピシリンを添加した200 mL LB培地で、オービタルシェーカー(230 rpm)で37°Cで1〜2時間インキュベートします。
2. OD₆₀₀ が0.4-0.6吸光度単位に達したときに、10 μMのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加して細胞を誘導し、16°Cで16時間インキュベートします。
3. 細菌懸濁液を回収し、8000 × g、4°Cで10分間遠心分離します。
4. 20 mLの可溶性溶解バッファー(50 mMのNaH₂PO₄、300 mMのNaCl、10 mMのイミダゾール、pH 8.0)で細胞を溶解し、200 μLのフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)と200 μLのリゾチームを加えます。5mLピペットを使用して細菌ペレットを再懸濁し、次いで30%の電力で20分間超音波処理を進める。
5. カラム容量の5倍に等しい溶解バッファーを添加して、ニッケルカラムを平衡化します。このプロセスを2回繰り返して、取っておきます。
6. 超音波処理した細菌懸濁液を8000 × g で4°Cで15分間遠心分離し、細菌上清溶解物(CL)を得ます。
7. CLをニッケルカラム(タンパク質吸着用)にロードして、フロースルー(FT)を取得します。
8. カラム容量の 5 倍の洗浄バッファー (50 mM の NaH₂PO₄、300 mM の NaCl、20 mM のイミダゾール、pH 8.0) でカラムを洗浄し、洗浄溶出液 (W1-W6) を得ます。
9. カラムを 1 mL の溶出バッファー(50 mM NaH₂PO₄、300 mM NaCl、250 mM イミダゾール、pH 8.0)で洗浄して標的タンパク質を溶出し、タンパク質画分(E1-E5)を取得します。
10. 各フラクション(CL、FT、W1-W6、E1-E5)の20 μLアリコートを採取し、SDS-PAGE¹⁸ とCoomassie Brilliant Blue染色を使用して分析します。PPARγ-LBDは、変性ゲル上で34.9 kDaのタンパク質として動作します。

3. 受容体結合アッセイ

注:このアッセイでは、C1-BODIPY-C12を部位特異的蛍光プローブとして使用して、受容体-リガンド結合系を確立しました。PPARγの特異的配位子であるC1-BODIPY-C12は、C1位の脂肪酸にBODIPY蛍光基が組み込まれた脂肪酸の蛍光類似体です。

1. 精製したヒトPPARγ-LBDをTris-HClバッファー(20 mMのTris、100 mMのNaCl、pH 8.0)で1 nM〜6400 nMの濃度範囲に希釈します。また、C1-BODIPY-C12プローブをTris-HClバッファーで50 nMの濃度に希釈します。
2. 希釈したPPARγ-LBD溶液(55 μL/ウェル)とC1-BODIPY-C12プローブ溶液(55 μL/ウェル)を96ウェルのブラックプレートに混合します。室温で5分間インキュベートします。
3. マイクロプレートリーダーで蛍光偏光(FP)を測定します。
4. 受容体濃度に対するFP値をプロットし、統計およびグラフ作成ソフトウェアを使用してHill勾配方程式との特異的結合を使用して曲線を適合させ_、KD 値を計算します。

4. 競合的結合アッセイ

注:このアッセイでは、800 nMのヒトPPARγ-LBDおよび50 nM C1-BODIPY-C12プローブを受容体結合に使用した。ロシグリタゾン(Rosi)、リン酸トリフェニル(TPHP)、およびパーフルオロオクタンスルホン酸(PFOS)を使用して、プローブのPPARγへの結合を競合させました。

1. Tris-HClバッファー中の3つの化合物を0〜200μMの濃度範囲で希釈します。
2. 最終濃度800 nMのヒトPPARγ-LBDと50 nMのC1-BODIPY-C12プローブで受容体-プローブ結合溶液を調製します。
3. 受容体プローブ結合溶液(ウェルあたり55 μL)と化合物溶液(ウェルあたり55 μL)を96ウェルブラックプレートに混合します。室温で5分間インキュベートします。
4. マイクロプレートリーダーで蛍光偏光(FP)を測定します。
5. FP値をリガンド濃度の関数としてプロットします。グラフ化および分析ソフトウェアによって処理されたシグモイドモデルを使用して、競合曲線から各リガンドの半値阻害濃度(IC₅₀)を取得します。

Results

PPARγ-LBDのタンパク質発現と精製
PPARγ-LBDは、BL21(DE3)でヒスチジンタグタンパク質として不均一に発現していました。可溶性画分中にタンパク質が検出され、精製されたPPARγ-LBDは、SDS-PAGE上に見かけの分子量約34.9 kDa(図2)の単一バンドを示し、タンパク質の予測分子量と一致しました。

C 1-BODIPY-C₁₂プローブのPPARγ-LBDへの結合
受容体結合アッセイでは、PPARγ-LBDに結合できるBODIPY標識脂肪酸であるC1-BODIPY-C12を蛍光プローブとして使用し、環境汚染物質とhPPARγ-LBDの結合力を研究しました。 図3Aに示すように、PPARγ-LBDを添加すると蛍光分極(FP)値が20から250に増加し、C1-BODIPY-C12が受容体に結合していることを示しています。結合曲線は 800 nM PPARγ-LBD で飽和に達し、解離定数_(KD) は 253.5 nM ± 10.05 nM でした。したがって、800 nM PPARγ-LBDがその後の競合的結合アッセイに選択されました。

環境汚染物質のPPARγ-LBDへの競争的結合
PPARγの特異的アゴニストであるロシグリタゾン(Rosi)は、競合するリガンド結合アッセイで蛍光プローブを置換するためのポジティブコントロールとして使用されました。 図3Bに示すように、Rosiは、6.89μMのIC₅₀ を使用して、C1-BODIPY-C12プローブのPPARγ-LBDへの結合を用量依存的に阻害し、アッセイの実現可能性を実証しました。次に、PPARγ-LBDに対するTPHPとPFOSの結合親和性を決定しました。 図3C、Dに示すように、TPHPおよびPFOSは、C1-BODIPY-C12プローブのPPARγ-LBDへの結合も用量依存的に阻害し、IC₅₀ 値はそれぞれ60.45μMおよび37.27μMでした。

図1:蛍光偏光(FP)ベースの受容体競合的結合アッセイの概略図。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図2:精製したPPARγ-LBDのSDS-PAGE分析。 Mはタンパク質分子量マーカーです。Clは細胞溶解物、FTはフロースルー画分、W1-W6は洗浄液、E1は溶出液、E2-E4は精製されたPPARγ-LBDタンパク質です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:蛍光分極(FP)ベースの受容体結合曲線と競合結合曲線。 (A)C 1-BODIPY-C₁₂のヒトPPARγ-LBDへのFPベースの結合曲線。(B-D)Rosi、TPHP、およびPFOSのFPベースの競合結合曲線とHuman PPARγ-LBD。エラーバーは、3つの独立した実験の標準偏差(SD)を示します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

身分証明書	シーケンス
pET28a-ヒトPPARG-P1	CAAATGGGTCGCGGATCCATGATCGACCAGCTGAATCCAGAGTCC
pET28a-ヒトPPARG-P2	GTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAGTACAAGTCCTTGTAGATCTC
PPARγ-LBDヌクレオチド配列	AGACGACATTCCCTCTAGAATAATTTTTTTTTAACTTTAAGGAGAT ATACCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCATキャットCACAGgcggcctg GTGCCGCGCGGCAGCCATTGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAA TGGGTCGCGGATCCATCGACCAGCTGAATCCAGAGTCCGCTGAC CTCCGGGCCCTGGCAAACATTTGTATGACTCATACATAAAGTCCTTCC CGCTGACCAAAGCAAAGGCAGGGCGATCTTGAGGAAGACAACA GACAAATCACCATTCGTTATCTATGACATGAATTCCTTAATGATGGGAGA AGATAAAATCAAGTTCAAACACACACCCCCCTCGCAGGAGCAGAGCAA AGAGGTGGCCATCCGCATCTTTCAGGGCTGCCAGTTTCGCTCCGTGG AGGCTGTGCAGGAGATCACAGAGTATGCCAAAGCATTCCTCTTTTTG TAAATCTTGACTTGAACGACCAAGTAACTCTCCTCCAAATGGAGTCCA CGAGATCATTTACACAATGCTGGCCCCTCCTTGATGAATAAAGATGGGGT TCTCATTCCGAGGGCCAAGGCTTCATGACAAGGGAGTTTCTAAAG AGCCTGCGAAAGCCTTTTGGTGACTTTATTGGACCCAAGTTTGAGT TTGCTGTGAAGTTCAATGCACTGGAATTAGATGACAGCGACTTGGCAA TATTTATTGCTGTCATTATTCTCAGTGGAGACCGCCCAGGTTTGCTGAA TGTGAAGCCCATTGAAGACATTCAACTCTACAAGCCCTGG AGCTCCAGCTGAAGCTGAACCCTGAGTCCTCACCTGTTTG CCAAGCTGCTCCAGAAAATGACAGACCTCAGACAGATTGTCACGGA ACACGTGCAGCTACTGCAGGTGATCAAGAACGGAAACCGACATG AGTCTTCACCCGCTCCTGCAGGAGATCTACAAGGACTTGG CTCGAGGCCACCCの

表1:PPARγリガンド結合ドメインのプライマーとヌクレオチド配列。

実験用試薬名	容量/用量
pET28a-ヒトPPARG-P1	1 μL
pET28a-ヒトPPARG-P2	1 μL
2×ファンタマックス マスターミックス	12.5 μL
cDNAの	2 μL
ddHの2O	8.5 μL

表2:PCR実験試薬システム。

実験の名前	温度	時間
プレデニテーション	95°C	3分間
変性	95°C	15秒
アニーリング	65°C	15秒
延長	72°C	6分間
店	12°C	--

表3:PCR実験反応プログラム。

Discussion

蛍光分極(FP)、表面プラズモン共鳴(SPR)、および核磁気共鳴(NMR)は、タンパク質と化合物との間の直接結合相互作用を評価するために使用される一般的な技術^{である19,20}。FPは、創薬や化学スクリーニングのための分子間相互作用の研究に広く利用されています21,22,23。それに比べて、SPRおよびNMRアッセイは高価で時間がかかるため、ハイスループットスクリーニング(HTS)アプリケーションにはあまり適していません。このプロトコールでは、FPをベースとしたレセプターリガンド解析法とマルチウェルプレート検出システムにより、化学物質のHTSを可能にしました。

受容体結合アッセイに適したプローブを選択することは非常に重要です。プローブは、核内受容体の特異的リガンドと蛍光基の2つの成分で構成されている必要があります。典型的には、このようなプローブは、本研究で用いたC1−BODIPY−C12プローブに例示されるように、商業的に入手することができる。C1-BODIPY-C12は、脂肪酸の蛍光類似体であり、C1位にBODIPY蛍光基が組み込まれており、PPARγの特異的リガンドです。市販の蛍光プローブが選択肢にない場合は、既知の特定のリガンドに蛍光基を結合させることにより化学合成する必要があります。

核内受容体の古典的な構造には、標的遺伝子発現の調節に関与するDNA結合ドメインと、典型的には受容体のC末端に位置するリガンド結合ドメイン(LBD)が含まれる²⁴。共調節因子結合部位は、一般に、核内受容体の転写活性化機能ドメイン内に見出され、そこで核内共調節因子と相互作用する²⁵。これらの共調節因子は、受容体の転写活性を増強または抑制し、それによって遺伝子発現を調節することができます。LBDは、受容体タンパク質の特定の領域に位置し、リガンド結合時の受容体の構造変化を調節し、それが次にその転写活性を活性化または阻害します。LBDは、特定の低分子リガンドを認識し、結合するために重要な明確に定義されたドメインであるため²⁴、この研究では、受容体競合的結合アッセイでは受容体LBDのみを使用した。このアプローチでは、PPARγのリガンド結合ドメインを発現および精製することで、アッセイコストが削減されました。

この方法で使用される試薬には、タンパク質精製用のバッファー、C1-BODIPY-C12プローブ、Tris-HClなどがあり、市販されており、安価であるため、このアッセイにとって大きな利点があります。蛍光偏光(FP)検出は、マルチウェルプレート(96ウェルまたは384ウェル)で行われ、プレートあたり3〜5分の高速読み取り時間で、テストのスループットと効率が向上します。受容体-リガンド結合アプローチは非常に柔軟性があり、受容体タンパク質が利用可能であれば、さまざまな受容体に容易に適応させることができます。この適応性により、この手法を用いて実施できる研究の幅が広がります。全体として、これらの利点(使いやすさ、コスト効率、高スループット容量、迅速な処理、受容体適応の柔軟性)の組み合わせにより、この方法は有毒な環境汚染物質をスクリーニングするための有望なオプションとなっています。

本結果は、PFOSおよびTPHPがPPARγに結合できることを実証しており、これは分子ドッキングおよびレポーター遺伝子アッセイ^9,26からの以前の知見と一致している。さらに、この論文に記載されている方法は、いくつかの環境汚染物質と核受容体との結合力を評価するために利用されています。例えば、FPベースの受容体-リガンド競合的結合アッセイを用いて、19種類のパーフルオロアルキル化合物およびポリフルオロアルキル化合物(PFAS)および7種類のビスフェノールA(BPA)化合物のペルオキシソーム増殖因子活性化受容体β/δ(PPARβ/δ)^7,10、12種類のPFASからPPARγ9,13、7種類のBPA化合物、および3種類の粒子状物質(PM_2.5)成分のファルネソイドX受容体(FXR)¹¹への結合力^、12、および8つのポリ臭化ジフェニルエーテル(PBDE)および6つのポリ塩化ビフェニル(PCB)の甲状腺受容体(TR)^14,15が決定されている。これらの知見は、環境汚染物質と核内受容体との間の結合相互作用をスクリーニングするためのこの方法の可能性を浮き彫りにしています。

以前の研究では、PPARγの蛍光分極(FP)アッセイ法が報告されており、これはゲルろ過を使用して結合を測定することを含み、単一の化合物の結合を検出するために少なくとも1.5時間を必要とする²³。対照的に、この方法では、少なくとも12種類の化合物とPPARγの結合親和性を10分以内に検出できます。さらに、市販のアッセイキット( 資料表を参照)の中には、800 μL × 20 μL のフォーマットで 3,000 ドルを超えるものもあります。これらの方法は、非常に高価で時間がかかります。この研究では、これらの既存の方法に対する改善点を示しています。

この方法の潜在的な制限の1つは、蛍光プローブが受容体のリガンドでなければならず、蛍光プローブが環境汚染物質と直接相互作用しないことです。したがって、プローブと環境汚染物質が溶液内で分離されていることを確認することが重要です。さらに、このアッセイはin vitroの状況を反映しており、受容体はin vivo27でヘテロ二量体であるため、in vivoでの相互作用を完全に捕捉することはできません。したがって、この方法は迅速なスクリーニングツールとして機能しますが、in vivoでの受容体活性化および関連する毒物学的メカニズムのさらなる調査が必要です。

別の欠点は、結合親和性を評価する際に蛍光偏光(FP)アッセイで観察される「右方向シフト」現象であり、測定された親和性の体系的な過小評価につながる可能性があります。これまでの研究では、ロシグリタゾンとPPARγとの結合親和性は、リガンド-受容体結合親和性を測定するための高感度な方法である時間分解蛍光共鳴エネルギー移動(TR-FRET)アッセイ²⁸を用いて評価されました。しかし、TR-FRETアッセイは比較的時間がかかり、面倒なため、検出前に反応溶液を室温で4時間インキュベートする必要があります。FPアッセイはTR-FRETアッセイに比べて感度が劣りますが、核内受容体に結合する環境リガンドのハイスループットスクリーニングにより適しています。それにもかかわらず、FPアッセイでは、一部の弱い環境リガンドを見逃す可能性があります。さらに、以前の研究では、PFOSとPPARγとの結合親和性は、リガンド受容体結合親和性を測定するための別の高感度な方法である平衡透析(EqD)²⁹を使用して決定されました。しかし、EqDは高価な分析機器(LC-MS/MS)に依存しているため、その用途は限られており、ハイスループットスクリーニング機能も得られません。

この蛍光偏光(FP)アッセイは「右シフト」現象を示し、一般的に計算されるIC₅₀ 値が高くなる可能性がありますが、相対親和性ランキングやその後のリスク評価予測には影響しません。さらに、FPアッセイは費用対効果が高く、時間効率が高く、複数の核内受容体に対する幅広い化合物の親和性をスクリーニングすることができます。全体として、FPベースの環境リガンドのハイスループットスクリーニングにより、有毒な環境汚染物質の迅速な同定が容易になります。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
C1-BODIPY-C12プローブ	サーモフィッシャーサイエンティフィック、中国	102209-82-3	PPARγ-LBDに結合し、蛍光を発します。
Coomassie Brilliant Blue R-250	Solarbio, China	6104-59-2	タンパク質バンドを染色します。
GraphPad プリズム	ドットマティクス
https://www.graphpad.com/features イミダゾール	Solarbio, China	I8090	タンパク質精製プロセス用のバッファーを準備します。
イソプロピル β-D-1-チオガラクトピラノシド	Solarbio, China	367-93-1	Induce the expression of PPARγ-LBD
Microplate reader	Biotek , USA	Synergy H1	FP値の検出
NaCl	上海試薬	7647-15-5	精製プロセスのための緩衝液を準備します。
NaH2PO4 · 2H2O	上海試薬	13472-35-0	タンパク質精製プロセス用のバッファーを準備します。
Ni NTAビーズ6FF	スマートライフサイエンス、中国	SA005005	タンパク質精製。
オリジン 8.5	OriginLab, Northampton, MA, U.S.A. (アメリカ、マサチューセッツ州ノーサンプトン
パーフルオロオクタンスルホン酸(PFOS)	J&K Scientific Ltd, China	1763-23-1	検出された環境汚染物質
フェニルメチルスルホニルフッ化物 (PMSF)	Solarbio, China	P0100	タンパク質の分解を阻害する。
PPARγ-Competitor Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	PV6136	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/PV6136
PPARγ-LBD Ligand Screening Assay Kit	Cayman	600616	https://www.caymanchem.com/product/600616
Rosiglitazone (Rosi)	aladdin, China	122320-73-4	PPAR&γのアゴニスト;
シェーカー	ZHICHENG, 中国	ZWY-211C	細菌培養の拡大とタンパク質発現の誘導
リン酸トリフェニル (TPHP)	マックリン, 中国	T819317	検出された環境汚染物質
Tris	Solarbio, China	T8230	タンパク質精製プロセスのための緩衝液を準備します。
Tryptone	OXOID Limited、中国	LP0042B	Lysogeny Broth(LB)培地を準備します。
超音波洗浄機	キンバリー、中国	LHO-1	細菌を破壊して完全な溶解を達成します
尿素	Solarbio, 中国	U8020	タンパク質精製プロセス用のバッファーを準備します。
酵母抽出物	OXOID限定、中国	LP0021B	リソジェニーブロス(LB)培地を準備します。