比色分析によるエラスターゼ酵素活性の調節の定量化

Summary

このプロトコルは、化合物がエラスターゼ活性を阻害または活性化する能力を決定するための比色アッセイ方法の開発について説明しています。

Abstract

エラスターゼは、セリンプロテアーゼであり、エラスチンの分解に不可欠な役割を果たします。エラスチンは、肺、皮膚、血管の組織の弾力性を維持するのに役立つ細胞外タンパク質です。エラスターゼ活性の厳密な調節は、組織の恒常性維持にとって重要であり、調節不全は肺気腫、しわ、アテローム性動脈硬化症などの病状に寄与する可能性があります。天然に存在する植物化学物質などの一部の化合物は、治療介入の可能性を示しており、大きな関心を集めています。エラスターゼに対するさまざまな化合物の調節効果を解明することは、抑制性か刺激性かを問わず、エラスターゼ関連障害を標的とする新しい治療および美容戦略を開発するために重要です。エラスターゼ活性を測定するための広く受け入れられている方法は、比色エラスターゼアッセイです。このアッセイでは、特定の基質を使用してエラスターゼを分解し、検出可能な黄色の化合物であるp-ニトロアニリン(pNA)を放出します。生成されるpNAの量は、サンプル中のエラスターゼ活性を反映しており、比色測定で測定できます。このアッセイには、シンプルさ、高感度、迅速な結果、さまざまな研究ニーズへの適応性など、いくつかの利点があります。比色エラスターゼアッセイは、化合物がエラスターゼ活性にどのように影響するかを研究するための貴重なツールであり続けています。その使いやすさと有効性により、このアッセイはこの分野の研究の基礎となっています。

Introduction

エラスターゼは、肺、皮膚、血管など、体内のさまざまな組織に弾力性を与えるタンパク質であるエラスチンの分解に重要な役割を果たすセリンプロテアーゼ酵素です。エラスターゼ活性は、組織の恒常性を維持するために厳密に制御されており、調節不全は、肺気腫、アテローム性動脈硬化症、皮膚のしわなどの病理学的および真皮的な状態につながる可能性があります¹。

エラスターゼにはいくつかの種類があり、それぞれに特定の特性と機能があります。好中球によって産生される好中球エラスターゼは、免疫応答と炎症に重要です。これらの酵素は、さまざまな細胞外タンパク質を分解することができ、慢性炎症性疾患^{に関与しています2}。一方、膵臓エラスターゼは、小腸でのタンパク質消化に役割を果たします³。これらのエラスターゼを区別することは、さまざまな疾患に対する特定の治療法を開発するために重要です。

健康的なレベルのエラスチンとエラスターゼ活性を調節する経路は、肌の弾力性を維持し、早期老化を防ぐのに役立ちます。老化、紫外線、炎症、遺伝的素因、環境汚染物質、栄養などの要因は、エラスターゼ⁴の活性と分解に大きく影響します。新....

Protocol

本試験に使用した試薬および機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1. 0.2 Mトリス塩基反応バッファー(RB)の調製

1. 分析天びんを使用して、対応するトリス塩基を計量します。
2. トリスベースをビーカーに移し、メスシリンダーを使用して脱イオン水を追加します。
3. トリスベースが完全に溶解するまで、マグネチックスターラーで溶液を攪拌します。
4. pHを8.0に調整し、4 N HClを滴下します。pHメーターを使用してpHを監視します。
5. 所望のpHに達したら、溶液をメスフラスコに移し、脱イオン水で所望の容量マークまで充填します。
6. バッファーをラベル付きの保存ボトルに移し、使用するまで室温で保管します。

2. サンプル調製

1. 分析天びんを使用して、必要な量のサンプルを正確に計量します。この研究では、各サンプル1mgで十分です。
2. サンプルをRBに溶解して目的の濃度にします。さまざまなサンプル濃度を試験できますが、1 mg/mLが適切な参考値です。
3. ボルテックスミキサーを使....

Results

プロトコールが完了すると、適切な計算を実行し、エラスターゼ活性を調節するサンプルの能力を定量化するために必要な吸光度データを取得できます。 図3 は、さまざまなコントロールとサンプルを使用したウェルの位置を示しています。この例で使用されているような色付きサンプルの場合、色が410 nmでのpNAの黄色の測定に干渉する可能性があるため、分光光度干渉を最小限に抑えるためにカラーコントロールを追加する必要があります。

吸光度の結果が得られ、各サンプルの阻害率が計算され、その結果がコントロールに基づいて正規化されたら、 図4 と同様の棒グラフを生成する必要があります。阻害率の値が高いほど、サンプル中のエラスターゼ阻害活性が強いことを示します。100%に近い値は強い阻害を示し、0%に近い値はエラスターゼの阻害が弱いかまったくないことを示します。.負の阻害値は、エラスターゼの活性化を示します。 図4 のグラフは、ネガ.......

Discussion

本方法では、植物化学物質のエラスターゼ酵素に対する調節効果を比色分析法を用いて調べる。エラスチンの分解に重要なセリンプロテアーゼであるエラスターゼは、さまざまな臓器の組織の弾力性を維持する上で重要な役割を果たしています。この研究で説明されている比色エラスターゼアッセイは、エラスターゼ活性を測定するためのシンプルで高感度かつ迅速な方法を提供します。

これに関連して、研究者は、植物抽出物や純粋な植物化学物質などのモジュレーターに焦点を当て、エラスターゼ活性を調節する可能性を秘めています。これらのモジュレーターは、天然の治療薬または化粧品の開発における応用の可能性を示しています²²。いくつかの研究は、緑茶抽出物²³を含むさまざまな植物抽出物および植物化学物質を実証しています。ブドウ、ザクロ、フェンネル種子抽出物²⁴;クルクミン²⁵;.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 ウェル 細胞培養プレート	コーニング インコーポレイテッド	3599	平底 蓋付き、ポリスチレン
細胞イメージング マルチモードリーダー	Agilent	BioTek Cytation 1	Gen5ソフトウェアで使用
エラスターゼ ブタから 膵臓	Sigma-Aldrich	E7885	CAS 39445-21-1; 25,9 kDa
イソプロパノール 99.5%	フィッシャーサイエンティフィック	AC184130010	CAS 67-63-0;C3H8O;60.10 g / mol
N-サクシニル-(Ala)3-ニトロアニリド	シグマ-アルドリッチ	S4760	CAS 52299-14-6;C19H25N5O8 ;451.43 g/mol
pHメーター	Hach Lange	sensION+ PH31	マグネチックスターラーとセンサーホルダー付き
フェニルメタンスルホニルフッ化物	Sigma-Aldrich	P7626	CAS 329-98-6;C7H7FO2S;174,19 g/mol
分子生物学用トリス	PanReac AppliChem	A2264	CAS 77-86-1;C4H11NO3;121,14グラム/モル