Attine Ants' Gardensの微生物叢:走査型電子顕微鏡による微生物の風景の可視化

サマリー

私たちは、植物や真菌のバイオマスを含む非常に不均一で繊細なサンプルを、微生物叢やバイオフィルムとともに視覚化するための最適化された走査型電子顕微鏡プロトコルを提案します。このプロトコルにより、微生物叢組織の空間的次元を記述できます。

要約

熱帯雨林やサンゴ礁などのマクロスケールの生態系では、生物の空間的局在化がコミュニティ生態学の理解の基礎となっています。同様に、微生物の世界では、ミクロスケールの生態系は、生物と生息地のランダムで均質な混合物とはほど遠いものです。微生物の空間分布にアクセスすることは、微生物叢の機能と生態を理解するための基本であり、同棲する種は相互作用し、互いの生理機能に影響を与える可能性が高いためです。

王国間の微生物生態系は、菌類を育てるアリのコロニーの中核であり、栄養資源として担子菌類を培養しています。アッティネアリは、多様な基質(主に植物性)を探し、培養された真菌によって代謝され、海綿状の構造、つまり外部の腸として機能する「微生物の庭」を形成します。庭は、基質を代謝することによって成長する真菌菌糸の絡み合ったメッシュであり、特徴的で適応した微生物叢を確立するためのニッチを開きます。この微生物叢は、基質の分解と真菌の増殖に寄与していると考えられていますが、その空間構成はまだ決定されていません。

ここでは、走査型電子顕微鏡(SEM)を使用して、真菌を増殖させるアリのさまざまな菌類培養システムにわたる微生物叢とバイオフィルムの空間構成をこれまでにない詳細さで調査する方法について説明します。SEMイメージングは、微生物叢の空間構造と組織の説明を提供しました。SEMは、微生物叢が一般的にバイオフィルムに集合し、菌類培養における微生物ランドスケープの広範な構造であることを明らかにしました。このような複雑なコミュニティの固定、脱水、乾燥、スパッタコーティング、およびイメージ化に使用されるプロトコルを紹介します。これらのプロトコルは、植物や真菌のバイオマス、微生物叢、バイオフィルムなど、繊細で不均一なサンプルを扱うように最適化されています。

概要

生態系は、特定の地理的位置(つまり、環境)のプロセスによって相互接続された生物で構成されています。生物は時間の経過とともに環境と相互作用し、そこから複雑で不均一な空間パターンが出現します。空間パターニングは、生態学的な多様性と安定性を決定し、最終的には生態系の機能を決定します1,2,3,4。湿地、サバンナ、サンゴ礁、乾燥生態系などのマクロスケールの生態系では、空間パターンは資源の流れと集中と相関しています。資源の最適化、空間的な不均一性、パターニングを可能にすると、均質な生態系よりも回復力のある生態系が実現します²。生物の空間的局在化が群集生態学の基礎にあることは、微生物の世界にも翻訳されます。

微生物生態系は、微小生息地全体にランダムかつ均一に混合された生物から遠く離れており、その機能の多くを定義する空間パターンを示しています^5,6,7。ウィノグラードスキーのカラムから環境および宿主に関連する微生物叢まで、これらの生態系は空間的に不均一に組織化されており、空間的な配置によって異なる表現型の応答が引き起こされます。同棲している種は、相互作用し、互いの生理機能に影響を与える可能性が高くなります。したがって、コミュニティの空間構成は、その構成自体以上に、生態系の特性と生態学的ニッチを区切っています^5,7,8。これらの概念を説明すると、空間パターンの変化は、歯垢、虫歯、歯周病^9,10、炎症性腸疾患¹¹、嚢胞性肺感染症、慢性創傷感染症^12,13、結腸直腸癌、および腺腫¹⁴の病理学的進行と相関しているように思われる。

微生物生物地理学(ミクロスケールでの空間と時間にわたる生物多様性の分布とパターン化の研究)の範囲の下で、微生物生態系の知識は、その空間パターンを理解することによって大いに恩恵を受ける6,13,15,16,17。私たちは、カリスマ的な菌類を育てるアッティネアリ(膜翅目:Formicidae:Myrmicinae:Attini:Attina)のコロニーの中心に見られる、昆虫が構築した微生物生態系の空間パターンを調べました。Leucocoprinae(Basidiomycota:Agaricaceae)またはPterulaceae科(Basidiomycota:Agaricales)18,19,20,21,22の担子菌を中心とした「微生物の庭」があります。庭は、アリが取り込む主に植物ベースの基質を代謝することによって成長する菌糸の絡み合ったメッシュから出現する海綿状の構造です(図1)。これらには、アティーネ属によれば、乾燥した植物の部分、昆虫の破片と死体、切りたての葉、種子、花の部分^{が含まれます23,24}。外部の草食性の腸に類似して、庭は酵素的および化学的に難治性のポリマーを不安定な栄養資源に変換し、アリに必須アミノ酸、脂質、および可溶性糖^{を提供します}21,25,26,27,28。

葉を刈るAtta属とAcromyrmex属の庭で実施された超微細構造、酵素、およびトランスクリプトーム分析は、これらの環境が基質分解と栄養パッチ26,29,30,31,32の連続体を構造化していることを示唆しています。庭の若い部分は、断片化された後に新しく組み込まれた基質のために暗くなる傾向があります。これらの最近追加された基質は、多くの場合、アリの働きアリの働き者によって切断され、菌糸体の塊が接種された端からコロニーを形成します。切断された端から放射状に広がる真菌菌糸は、基質29,32,33上に広がった。菌糸の存在量は、基質の分解が進行するにつれて増加し、白っぽく代謝活性な領域30,31,32をもたらす。より劣化した基質と豊富な微生物叢^29,32を持つ古い地域は、茶色がかった色調とより高い湿度を示す傾向があります。労働者はこの領域の断片を取り除き、それらを廃棄物の山に分離し、そこで真菌共生生物34,35,36に害を及ぼす基質も取ります。廃棄物の山は、庭から物理的に切り離されていますが、豊富な微生物叢29,32,37,38,39による継続的な基質分解と栄養素循環のスポットです。

エンテロバクター、クレブシエラ、パントエア、シュードモナス、セラティアを主成分とする微生物叢も園内に生息しており、多様な菌類養殖システムと共有されているようです。真菌代謝を補完する可能性のある代謝経路をコードする微生物叢は、庭の生理学的応答40,41,42,43,44に関与している可能性があります。メタゲノムデータは、微生物叢^{がそこに存在}したことを示した^{だけでなく、葉}切りアリの菌類養殖の走査型電子顕微鏡(SEM)分析でも、主に植物基質上の棒状の細菌が示された³²。バクテリア(セルロース分解株を含む)は庭全体から分離されましたが、それらは庭の古い部分と廃棄物の山、およびファウンドレスクイーン^29,32によって運ばれた最初のペレットでのみ視覚化されました。また、微生物叢がin vivo(すなわち、庭や廃棄物)でバイオフィルムを形成できるかどうかも不明であり、その代謝能力⁴²およびin vitroで観察された⁴⁴から示唆されている。

ここでは、SEMを使用して、園庭地域全体の微生物叢の空間構成をさらに理解し、微生物叢と基質、および微生物叢と菌糸の物理的相互作用を詳細に説明しました。SEMは、より大きな焦点深度の画像を提供することにより、3次元の微視的構造を高解像度で観察することを可能にし、庭の微生物叢の空間パターンを徹底的に分析することを可能にします。このような不均一で繊細な真菌ベースのサンプルを固定、脱水、乾燥、スパッタコート、およびイメージングする手順について詳しく説明します。四酸化オスミウム(OsO₄)を使用した固定後ステップを省略し、脱水時間を短縮することにより、SEM分析用の庭および廃棄物サンプルを準備するためのプロトコル32,33,45を簡素化しました。この適応プロトコルは、菌糸の構造パターン、微生物叢およびバイオフィルムの空間構成を保持し、他の繊細な微生物生態系およびバイオフィルムに適用できる可能性があります。

図1:アティーネ微生物園。 庭は、アリが取り込んだ主に植物ベースの基質を代謝することによって成長する菌糸の絡み合ったメッシュから生じるスポンジのような構造です。また、庭には微生物叢があり、真菌の代謝を補完する可能性のある代謝経路をコードしています。メタゲノムデータと以前の走査型電子顕微鏡分析では、その存在が示されていましたが、その空間構成や基質および真菌菌糸との物理的相互作用についてはほとんど知識がありませんでした。私たちはSEMを用いて、微生物叢とバイオフィルムの空間構成とパターニングを明らかにしました。マリアナ・バルコトによるイラスト(バルコトとロドリゲス ⁹⁴から適応された庭園と微生物叢)、およびマリアナ・バルコトとエンツォ・ソレンティーノによる写真。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

プロトコル

1. フィールドコロニーのサンプリング

注:アリのコロニーを収集する場合は、収集する前に、現地の法律で義務付けられているすべての許可を取得していることを証明してください。私たちの場合、収集許可証#74585は、Instituto Chico Mendes de Conservação e Biodiversidade(ICMBio)によって発行されました。サンプルがラボコロニーから来た場合は、セクション2に進みます。

1. コロニーを見つけてマークします。庭の部屋が露出するまで、巣穴を囲む溝を掘ります(図2A)。
   注:一部のアッティーン種は、落葉の下や腐った丸太の中にコロニーを作る場合があります。このような場合は、リターを慎重に回転させるか、慎重に丸太を壊してサンプルを採取してください。多様なアティーネアリ種の生きたコロニーの発見、収集、維持に関する詳細な情報については、Sosa-Calvo et ^al.46を参照されたい。
2. 土が庭の表面に落ちるのを防ぐために、庭の部屋を横に開きます。庭のサイズに応じて、昆虫学の鉗子、スプーン、またはキッチンスキマーのいずれかを使用して、庭のサンプルを慎重に収集します。
   注意: 収集する前に、必ずツールを滅菌してください。葉切りアリの庭を採集するときは、働きバチの咬傷を防ぐ(または少なくとも軽減する)ために、厚手の布製手袋を着用してください。他のアティーネ種の場合、布製手袋はオプションです。
3. 庭のサンプルを、庭の湿度のバランスをとるための石膏の層を含むきれいなプラスチックの受取人に移します。庭とアリの労働者を移した後、サンプルの乾燥を避けるために、受取人を密閉して閉じてください。庭のサンプルは、処理まで23〜25°Cで保管してください。
4. 以前に取り除いた土でトレンチを閉じます。

図2:サンプル調製プロトコル。 (A)フィールドコロニーのサンプリング。(B)サンプル処理。(C)サンプル調製のための簡単な基本とワークフロー: 1.固定:サンプル構造を強化し、保存するためのもの。2.脱水:サンプルの水分含有量はエタノールと交換されます。3.臨界点乾燥:液体CO₂がエタノールに置き換わり、蒸発します。4.取り付け:分析のためにサンプルが表示されます。5.金によるスパッタコーティング:サンプルの充電を防ぎます。6. イメージング。イラストと写真:マリアナ・バルコト この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

2. 試薬

注:次の解決策を事前に準備する必要があることに注意してください。

1. 0.2 Mカコジル酸ナトリウムバッファーを調製します。このためには、42.8gのカコジル酸ナトリウムを800mLの蒸留水に溶解し、溶解してpHが7.2に安定するまで攪拌します(必要に応じて、塩酸を使用してpHを調整します)。蒸留水を加えて溶液の量を1 Lにします。溶液を4°Cで保存します(~1ヶ月間)。
   注意:グルタルアルデヒドとパラホルムアルデヒドは有毒であり、ドラフト内で取り扱う必要があります。このような試薬を取り扱うときは、常にニトリル手袋と保護メガネを着用してください。
2. カルノフスキーの固定液(カルノフスキーから改変)を調製する⁴⁷。このためには、10 mLの25%グルタルアルデヒド水溶液と10 mLの20%パラホルムアルデヒド水溶液を25 mLの0.2 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液に加えて混合します。0.1M塩化カルシウム(CaCl₂)1mLを加え、蒸留水を加えて容量を100mLにします。溶液は4°Cで保存します(最大1ヶ月間)。
   注意:カルノフスキーの固定剤は吸入すると有害であり、皮膚や目の炎症を引き起こす可能性があります。.したがって、蒸気を吸い込むことは避け、屋外または換気の良い場所でのみ使用してください。溶液を取り扱うときは、常にニトリル手袋と保護メガネを着用してください。
3. 無水エタノール(分析グレード)を使用して、蒸留水に30%、50%、70%、および90%のエタノール溶液を調製します。100%エタノールも必要です。

3. サンプルの固定

注:固定剤は、形態学的特徴を維持しながら、サンプルを硬化させて保存します。アルデヒド(パラホルムアルデヒドやグルタルアルデヒドなど)は、架橋型の非凝固剤固定剤であり、タンパク質と核酸の内部および間に架橋を誘導する⁴⁸。

1. 昆虫学的鉗子を使用して、庭のサンプルから働きバチ、卵、蛹、幼虫を取り除きます(図2B)。庭の破片を5 mm³以下で離して設定します。フラグメントを2mLチューブ(図2C)に加えます。
2. サンプルが入ったチューブに、パスツールガラスピペットを使用して、~1 mLのカルノフスキー固定液を加えます(サンプルが完全に覆われていることを確認してください)。穏やかに攪拌して混合し、サンプルを4°Cに浸してインキュベートしてから、サンプル処理を続行します(図2C.1)。
   注:以下の脱水ステップが固定直後に行われない場合、このステップでプロトコールを一時停止し、サンプルを4°Cで~1年間保存することができます。
   パスツールガラスピペットは、不活性材料で構成されており、後で再利用するための洗浄が容易なため、使用することをお勧めします。園芸材料は疎水性が高く、固定液の表面に浮く傾向があります。通常、固定剤に完全に浸すには最大5分かかります。固定剤がサンプルの細孔に入るとその体積が減少する傾向があるため、固定剤が庭の破片を覆っていることを確認してください。サンプルを浸して濡らした後、その成分(特に繊細な真菌菌糸体)は、さらに混合すると粉々になりやすくなることを経験的に確認しました。したがって、サンプルを振ることはできるだけ避けることをお勧めします。

4.サンプルの脱水

注:エタノール洗浄シリーズは、サンプル中の水を徐々にエタノールと交換します。このようなデリケートなサンプル⁴⁹を過度に損傷したり崩壊させたりしないように、低濃度のエタノール溶液(下記参照)から始めることが重要である。

1. カルノフスキーの固定液をガラスピペットで完全に取り除き、サンプルを乱さないように注意します(図2C.1)。
   注:カルノフスキーの固定液は、有毒な化学物質残留物管理のために適切にラベル付けされたレシピエントに廃棄してください。
2. 固定液を取り出した直後に、サンプルを乱さないように注意しながら30%エタノール1mLを加え、室温で10分間インキュベートします(図2C.2)。
   注:サンプルは常に溶液に浸す必要があります。エタノールの段階的な洗浄シリーズ中に溶液を迅速に交換するようにしてください。庭が多孔質の側面を失い、チューブの底に凝集すると、1 mLのエタノールがサンプルを覆うのに十分になる傾向があります(サンプルが5 mm³以下の場合)。ただし、サンプルが完全に覆われていない場合は、サンプルが完全に覆われるまでエタノールを追加します。
3. 30%エタノールをガラスピペットで完全に取り除き、サンプルを乱さないように注意してください。30%エタノールを適切に廃棄します。
   注:エタノール段階的な洗浄シリーズ全体では、有毒な化学物質残留物管理のために適切にラベル付けされたレシピエントにエタノールを廃棄します。
4. 50%エタノール1mLを加え、室温で10分間インキュベートします。50%エタノールをガラスピペットで完全に除去し、サンプルを乱さないように注意してください。50%エタノールを適切に廃棄します。
5. 70%エタノール1mLを加え、室温で10分間インキュベートします。70%エタノールをガラスピペットで完全に除去し、サンプルを乱さないように注意してください。70%エタノールを適切に廃棄します。
   注:70%エタノール洗浄ステップでは、サンプルチューブが4°Cで一晩保存される可能性があるため、ユーザーは必要に応じてプロトコルを一時停止することができます。
6. 90%エタノール1mLを加え、室温で10分間インキュベートします。90%エタノールをガラスピペットで完全に取り除き、サンプルを乱さないように注意してください。90%エタノールを適切に廃棄します。
7. 100%エタノール1mLを加え、室温で10分間インキュベートします。100%エタノールをガラスピペットで完全に取り除き、サンプルを乱さないように注意してください。100%エタノールを適切に廃棄します。
8. 鉗子やスパチュラを使用して、サンプル識別ラベル(以前は紙と鉛筆で作成)が入った臨界点乾燥機(CPD)用の試料容器にサンプルを慎重に移します。サンプルの乾燥を避けるために、この移送は、100%エタノールで覆われた容器をペトリ皿に入れた状態で行われます。
9. 容器に蓋をして、容器を沈めるのに十分な100%エタノールを含む目盛り付きガラスビーカーに浸します。ガラスビーカーを覆い、室温で10分間インキュベートします。その後、100%エタノールを適切に廃棄します。
10. 試料容器を、容器を水没させるのに十分な100%エタノールを含む別の目盛り付きガラスビーカーに移します。ガラスビーカーを覆い、室温で10分間インキュベートします。その後、検体容器を臨界点乾燥機に移します。
    注意: 一連の洗浄後、ガラスピペットとビーカーは蒸留水で十分にすすぎ、この残留水は、有毒な化学物質残留物管理のために適切にラベル付けされたレシピエントに廃棄する必要があります。すすぎ後、ガラス製品は中性洗剤で洗い、水道水ですすぎ、風乾することができます。

5.臨界点乾燥

注:クリティカルポイントドライヤーは、サンプル中のエタノールを液体二酸化炭素(CO₂)と交換し、より高い温度と圧力でサンプルから蒸発します。このような手順については、製造元の指示に従ってください。

1. 機器のスイッチを入れます。
2. チャンバーを開き、サンプル容器を中に入れ、容器が覆うまで100%エタノールを加えます。チャンバーを閉じます。
3. Coolオプションを有効にし、温度が10°Cに達するまで待ちます。
4. CO₂シリンダーバルブを開き、 スターラー オプションをアクティブにします。
5. オプションでCO₂をアクティブにし、常にチャンバーをチェックして、CO₂がすでに満たされている量を確認します。チャンバーがほぼ満たされたら、CO₂ inオプションを非アクティブ化し、Exchangeオプションをアクティブにして、コンテナを覆うのに十分なCO₂があるまでアクティブに保ちます。コンテナが常にCO₂で覆われていることを確認してください(つまり、すべてのCO₂がチャンバーを出る前に交換オプションを無効にします)。手順5.5 6xを繰り返します。
6. 最後にもう一度_CO2を活性化し、容器が覆われるまでチャンバーを満たします。
7. 「Heat」オプションを有効にし、「Stirrer」オプションを無効にします。CO₂シリンダーバルブを閉じます。
8. 温度が35°Cに上昇するまで待ちます。次に、 ガスアウト オプションをアクティブにします。
   注:約30°Cで、チャンバーは70〜80バールの圧力に達し、液体が 消える臨界点に達します。
9. チャンバーの圧力が1バールに達すると、すべてのガス含有量が除去されます。チャンバーを開けて容器を取り出します。
10. 機器の電源を切ります。

6. 取り付け

1. SEMサンプルホルダー(すなわち、アルミニウムスタブ; 図2C.4)。
   1. スタブをアルミホイルで包み、上部のみを覆って、分析後のスタブのクリーニングを容易にします。
   2. ホルダーの底にサンプルコード/番号を記入してスタブを識別し、上部に配置されているものの識別を保証します。
   3. 上部を両面カーボンテープで覆います。スタブを標本ホルダーに入れます。
2. 検体容器の蓋を開け、鉗子とへらを使用して乾燥させたサンプルをガラス製のシャーレに慎重に移します。
   注:重要なポイント乾燥した庭は、サイズが1 mm³以下の断片として慎重に離れて設定する必要がある高度に詰められたサンプルを形成する傾向があります。
3. テープで覆われたスタブの粘着面に破片を慎重に置きます。庭の破片がテープに触れると、テープを(再)移動することは非常に困難ですので、不要な場所や位置に置かないように注意してください。スタブごとに最大 9 つのフラグメントを追加します。
4. 各サンプルについて、手順6.2と6.3を繰り返します。

7.金によるスパッタコーティング

注:サンプルの充電を防ぐために、サンプルをコーティングする必要があります。メーカーの指示に従って、動作ガス圧(このプロトコルでは0.5 × 10-1 mm Hgのガス圧)、スパッタリング時間(220秒)、金層の厚さ(~120 Å)、電流(50 mA)、電圧供給などの設定を調整します。スパッタリングは一般的なワークフローに従う傾向がありますが、メーカーが異なれば装置の動作も若干異なる場合があります。

1. ヒンジ付きターゲットアームを開き、スタブを試験片テーブルに置きます。
2. ヒンジ付きターゲットアームを閉じ、ガラス真空チャンバーの破片シールドが適切に埋め込まれているかどうかを確認します。
3. アルゴンシリンダーバルブを開き、主電源スイッチをオンにします。
4. ディスプレイの0.5 × ^10-1 mmHgマークに達するまで、機器のディスプレイで真空が上昇するのを追います。次に、 リンスを有効にします。操作を5回繰り返します。
5. 水循環システムのスイッチを入れ、オプション HVオンをアクティブにして、金フィルムの蓋を開けます。プラズマの色がピンクがかっていることを確認します。このプロトコルに従うには、50 mA の電圧で 220 秒のスパッタリングを設定し、~120 Å (12 nm) の金層を堆積させます。
6. HVオン は自動的にオフになります。水循環システムをオフにし、金フィルムの蓋を閉じます。
7. 主電源スイッチをオフにして、空気が真空チャンバーに入るようにします。庭や廃棄物のサンプルについては、手順7.1-7.7を3回繰り返します。
   注:サンプル調製直後にイメージングが行われない場合は、サンプルの再水和を避けるために、シリカ層で満たされた密閉容器にスタブを保管してください。

8. イメージング

注意: 対物レンズの開口径、動作電圧、電子ビームシステムのアライメント、軸方向のアライメント、スティグメーターなどのSEM設定を調整するには、製造元の指示に従ってください。

1. スタブをサンプルホルダーに置き、各サンプルの位置にメモを取ります。
   注:サンプルホルダーを挿入または取り外すときは手袋を着用し、ホルダーをできるだけ清潔に保ちます。
2. デスクトップから操作ソフトウェアを起動します。
3. 機器の設定を選択します。対物開口径30μm(第2段)で、高真空中での運転、二次電子(SED)からの信号検出、加速電圧 20kV、作動距離15〜20mm、プローブ電流40.0(高電流モード)、試料に応じて倍率を変化させながら、ガーデンサンプルを可視化します。
4. ナビゲーションの指示に従って、 ベント アイコンを押し、試料チャンバーがベントされるのを待ちます。プログレスバーはバキュームステータスを示します。
5. 大気圧に達したら、試料チャンバーを開け、試料ホルダーを慎重に挿入します。
6. チャンバーのドアを静かに閉じ、 Evac アイコンを押して機器を排気し、プログレスバーを通じて真空状態を追跡します。ナビゲーションシステムは、移動が完了したときに移動ステージの位置を表示し、ホルダーグラフを提供します。 カメラ アイコンを押してホルダーの写真を記録し、上面を取得します view イメージング中にサンプル間を移動するのに役立ちます。
7. 観測アイコンを押して電子銃をオンにし、画像が形成されるのを待ちます。手動ユーザーインターフェース(手動制御)を使用して、Z軸を適切な高さに手動で移動します(サンプルの高さと決定された作動距離に基づく)。
   注意: タングステンフィラメントの寿命を延ばすために、アクティブにイメージングしていないときはいつでも 観察 機能を一時停止してください。
8. 画面に表示されるオプションまたは手動コントロールを使用して、 ラスターレート と 画像の位置を変更します。ステージを動かしてサンプルを全体像を把握し、 RDC 機能を使用して特定の領域に焦点を当てます。ターゲット(または興味深い)構造を観察するときは 、それに応じて倍率、焦点、明るさ、コントラスト、 およびスティグメーション を調整します。 手動ユーザーインターフェース を使用してステージをX方向とY方向に動かすことで、スティグマを修正します。
   1. 倍率を 100 倍から 700 倍の間で調整して、一般的な庭の側面 (菌糸密度、基質、コロニー形成パターンなど) を視覚化します。
   2. 倍率を700倍から1,500倍の間で調整して、微生物叢の空間パターンを視覚化します。
   3. 倍率を1,500倍から3,000倍の間で調整して、微生物叢とバイオフィルムの物理的相互作用を観察します。
   4. 倍率を3,000倍から4,000倍の間で調整して、特定の微生物クラスターに焦点を合わせます。
9. 画像を保存するには、 フリーズ 機能を使用し、 写真 アイコンをクリックして、ファイルパスを設定します。標準として、少なくとも3つの庭の断片を分析し、ステップ8.8で説明したすべての倍率範囲で各断片をイメージングします。これにより、サンプルごとに少なくとも 12 枚の画像が生成されますが、画像が多いほど詳細な説明がサポートされる場合があります。サンプルあたり15〜25枚の画像、ステップ8.8のすべての倍率の範囲では、サンプルの説明に細かい詳細を提供する傾向があることを示唆しています。
   注:画像のラスタライズと保存には数秒かかりますが、その間、SEMフローティングテーブル上の振動を避ける必要があります。
10. イメージングが終了したら、 ベント オプションを押してチャンバーをベントし、プログレスバーを通じて真空状態を追跡します。ホルダーを慎重に取り外し、チャンバードアを静かに閉じ、 Evac を押してチャンバーを排気します。
11. 退避が完了したらすぐに操作ソフトウェアを終了します。
12. 明るさとコントラストを調整して、画像エディタを使用して視覚化を改善します。

結果

ここでは、真菌菌糸、基質、微生物叢、バイオフィルムなど、アティーネガーデンおよび廃棄物サンプルの成分を視覚化するための簡略化されたプロトコルを提示しました。SEMは、庭と廃棄物が微生物叢の構造パターンをどのように足場にするかについての理解を深めました(図3)。アティーネガーデンでは、真菌菌糸は基質表面の一部を覆う枝のような構造です。真菌菌糸は脱水や破裂に非常に敏感である傾向があるため、ユーザーは菌糸の側面に導かれてサンプル調製の結果を評価することができます。以前の作品32,33,45でも観察されたように、菌糸は管状の側面を示しています。無傷のチューブ状の菌糸は、効果的なサンプル調製を示しています(図3Aおよび図4C)。菌糸がリボン状の場合、このような平坦化はおそらく技術のアーティファクトです(図4C)。

植物の基質表面は、クチクラ層と表皮層、および気孔と毛状突起によって認識される場合があります。このような構造は、基質がまだ真菌菌糸と微生物叢によってコロニーを形成していない場合に、より認識しやすくなります(図3A および 図4C)。基質がコロニー形成されると、微生物叢および/または真菌の菌糸がその表面を覆い、特定の植物構造が容易に識別できなくなります(図3A)。微生物叢は、真菌の菌糸または基質のいずれかにコロニーを形成する可能性があり、これらはそれぞれ一見異なる空間構成で形成されます。 図3では、このような空間パターンを概略的に示し、それらが識別されたそれぞれのSEM画像にボックス化しました。これにより、SEMの結果とその解釈との関連性が促進される可能性があります。

菌糸コロニー形成微生物叢はあまり一般的に観察されず、見つかった場合、菌糸表面に単離または小さなグループで発生する桿体細胞または球菌細胞で構成されています。バイオフィルムのエキソ多糖マトリックス(EPS)は、「レース生地」構造のように見えますが、小さな塊で菌糸を取り囲むことが観察されます(図3A)。かなり一般的なのは、基質にコロニーを形成する微生物叢で、さまざまなアティーネアリ種の庭で見られます。コロニー形成パターンは、基質の劣化段階によってある程度定義されるようです。したがって、微生物叢は、まだ分解されていない基質にコロニーを形成しながら、個々の細胞として発生するか、または小さなグループに集まる可能性があります。微生物叢は、微細な劣化の兆候を示す場合(つまり、植物のクチクラ/表皮層や他の植物構造が識別できず、溝やくぼみが多い場合)に基質を層状にすることがあります。

これらの「微生物マット」では、EPSマトリックスが存在しないときに細胞の形態がより認識しやすくなります。EPSマトリックスに微生物細胞が埋め込まれている場合、その形態は容易に区別できません。その空間構成に従って、バイオフィルムを「スプレッド」または「3次元」として特徴付けました。バイオフィルムが広がると、微生物細胞とEPSマトリックスが断続的に基板表面を覆い、細胞の厚さが1〜3個分の平らな層を形成します(図3B)。バイオフィルムが3次元の場合、微生物細胞とEPSマトリックスが積み重なり、数個の細胞の厚さのクラスターが形成されます。劣化した基質(古い庭や廃棄物など)によって構成された庭の領域は、微生物叢をその溝やくぼみに保護し、そこで微生物叢は厚いコミュニティを形成します(図3C)。特に、廃棄物サンプル中の広範囲に分解された基質には、すべての地域の中で最も形態学的に多様な微生物叢が大量に存在しています。酵母は、バイオフィルムを介して原核生物と物理的に相互作用し、このコミュニティにさらに複雑さを加えます。 Atta sexdens および Acromyrmex sp.廃棄物サンプルでは、EPSマトリックスが、棒状および球状の原核生物、ならびに紡錘状酵母および球状酵母を取り囲む顕著な繊維状メッシュワークを形成していることが観察されました(図3C)。

菌糸の絡み合ったメッシュから生じる、庭の海綿状の構造は、サンプルをより均一にコーティングするために追加のスパッタリングを必要とします。このようなステップにより、画像を歪め、解像度を阻害する電子散乱を回避できます(図4A)。サンプル調製ステップは、庭の構造の大部分を保持し、微生物叢の空間分布と組織を明らかにしました。ただし、真菌菌糸やEPSマトリックスなどの構造は脱水に非常に敏感であり、特にSEMの場合、保存が非常に難しいことを繰り返す価値があります。菌糸の構造は比較的よく保存されていましたが、一部の庭のサンプルで視覚化されたバイオフィルムには、EPSマトリックスの構造成分が欠けている可能性があると考えるのが妥当です。微生物叢を囲む滑らかな多糖類の最外層は一部のサンプルで保存されていましたが(図3A、B)、一部のサンプルには微生物叢の形態学的特徴は保存されていましたが、EPSマトリックスはありませんでした。しかし、EPSマトリックスが本当に存在しなかったのか、それともサンプル調製中に除去されたのかは明らかではありません。

一方では、バイオフィルムの滑らかな層を取り除くと、正確なバイオフィルム構造の理解が損なわれます。一方で、その層の下に住む細胞の形態や空間構成、物理的相互作用を明らかにすることが私たちの主な研究テーマです。以前の研究では、四酸化オスミウム(OsO₄)蒸気を主要な固定剤として採用することにより、真菌菌糸とバイオフィルムマトリックスの両方の保存が報告されています44,50,51,52,53,54。次に、新鮮な庭のサンプルをOsO₄蒸気で固定する比較実験を行いましたが、これは明らかにバイオフィルムの滑らかな側面を保持しています(図4B)。しかし、この方法では、菌糸と微生物叢が広範囲に平坦化されました。この平坦化は、前に説明した庭の一般的な空間的側面の喪失をもたらしました^29,33,32,45したがって、庭の構造パターンに関するさらなる研究を制限しました。OsO₄による固定は、微生物の形態と分布を区別すること、および細胞構造を技術的な人工物と区別することの両方を困難にし、データの解釈を複雑にしました。

図3:微生物叢のアーキテクチャパターン。 微生物叢は、真菌の菌糸と基質のいずれかに明確な空間組織でコロニーを形成します。このような空間パターンは概略的に示され、それらが同定されたそれぞれのSEM画像で囲まれました（(図では白い四角で区切られています):(A)ハイフコロニー形成微生物叢は、単離された細胞群または小群の細胞から構成され、一部のサンプルではバイオフィルムのエキソ多糖マトリックスが検出されます。(B)基質にコロニーを形成する微生物叢が基質全体に広がり、EPSマトリックスが細胞を覆っているため、その形態は容易に区別できません。(C)基質コロニー形成微生物叢が3次元グループを形成し、モノまたはマルチモルフォロジーバイオフィルムを構成し、場合によってはEPSマトリックスを証明します。イラスト:マリアナ・バルコト略語:EPS = exopolysaccharidic matrix。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:無駄なイメージング。 低品質の画像で効果のない結果が得られたり、建築パターンの解釈が妨げられたりします。(A)電子散乱は画像を歪め、その解像度を妨げ、その結果、形態の識別を妨げます。これは、スパッタコーティングされたサンプルで頻繁に観察され、追加のコーティングによって減少しました。(B)四酸化オスミウム(OsO₄)蒸気を一次固定剤44,50,51,52,53,54として新鮮な庭のサンプルを固定すると、バイオフィルムの滑らかな側面が明らかに保存された。しかし、それは広範囲にわたる菌糸と微生物叢の平坦化を引き起こし、庭の建築パターンに損害を与えました。(C)Karnovskyの固定液を使用したサンプル調製は、OsO₄を使用した調製と比較して、菌糸構造、微生物叢分布、および庭園の空間パターンのほとんどを保持し、高品質の画像をもたらしました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

SEMは、電子ビームを使用してサンプルをスキャンし、サンプルの拡大画像を生成することで、3次元の微細構造を高解像度で視覚化できます。SEMは高真空下で動作するため、サンプルから最大99%以上の水を除去する必要があります。SEM真空チャンバー内では、部分的に水和したサンプルが脱水して崩壊し、電子が散乱する可能性があります。SEMでの高解像度イメージングの場合、サンプル調製には、体積と形態の変化を最小限に抑えながら水を除去する手順と、イメージング中の帯電を防ぐためのコーティングを含める必要があります55,56,57。

まず、サンプルは、さまざまな手法によって、そのタンパク質と核酸を架橋することにより化学的に固定されます。広く使用されている方法には、ピペラジン-1,4-ビス[2-エタンスルホン酸](PIPES)などの緩衝液にグルタルアルデヒドとホルムアルデヒド(またはパラホルムアルデヒド)を組み合わせることが含まれます。N-[2-ヒドロキシエチル]-ピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸(HEPES);リン酸緩衝生理食塩水(PBS)。またはカコジル酸ナトリウム。化学的固定により、サンプルが強化され、乾燥のためにその構造が維持されます。その性質によっては、サンプルは二次固定(四酸化オスミウム中)や三次固定(酢酸ウラニル中)が必要な場合があります。次に、サンプルを脱水する必要があります。空気乾燥は微細構造の広範な崩壊を引き起こすため、一般的な代替技術は臨界点乾燥(CPD)です。CPDでは、サンプルは表面張力にさらされないため、アーティファクトの形成を防ぎます。一方では、水は228,5バールと374°Cで臨界点に達し、サンプルを簡単に破壊します。一方、CO₂の臨界点は73,8バールと31°Cであり、遷移流体としての使用を正当化します。温度を上げると、CO₂は気体形式に変換され、サンプル58,59,60,61,62,63から除去されます。第三に、非導電性サンプルは、それらの帯電を防ぎ、二次電子収率を増加させるためにコーティングされるべきであり、その結果、シャープな画像信号⁶⁴を得ることに貢献する。

ここで紹介するプロトコルは、真菌ベースのサンプル^{32、33、45、65、66、67、68}、およびバイオフィルム^69、70を保存するための手順を組み合わせたものですが、後固化ステップを排除し、脱水時間を短縮することでプロセスを簡素化します。それでも、繊細な庭の構造を保持し、微生物叢の物理的相互作用をさらに詳細に説明し、バイオフィルムの空間構造を明らかにしました。微生物叢の空間的集合は、相互作用を確立し、その調節パターンを設定するために不可欠です。空間分布は微生物の社会動態を形作り、そこから固有の特性が現れる可能性があります。これらは、微生物生態系71,72,73が直面する変動性と複雑さに対処するために必要です。私たちの発見は、庭の構造パターンを統合する微生物叢を強化し、生理学的反応^32,42,43,44への彼らの推定関与を支持しています。我々は、バイオフィルムがアティーネ菌類の微生物相互作用に関連しているというin situの証拠を提供した^42,44。バイオフィルムは複雑で不均一な多細胞システムであり、自己分泌型のEPSマトリックスに埋め込まれた微生物がソーシャルネットワークを形成します。協力的に、および/または拮抗的に、バイオフィルム内の相互作用は、ニッチの開口部、占有、および修飾を決定する71,72,73,74。SEMは、園芸地域全体の微生物叢の空間構成をさらに理解することを可能にし、微生物叢と基質および微生物叢と菌糸の物理的相互作用を詳述すると同時に、この領域に関する今後の研究の方法を簡素化しました。

庭の微生物叢に関する研究は、特に、これらのユニークなコミュニティ^75,76、ならびにそれらの機能と相互作用42,43,44の形成を形作る可能性のあるプロセスに焦点を当てて、ますます注目を集めています。細菌と真菌の作物の相互作用は、真菌がリン酸塩を可溶化し、シデロフォアを産生し、セルロースとキチンを分解するのを助ける可能性があります。このような相互作用は、共生と拮抗の連続体として起こりうるが、庭の機能を調節することができる⁴⁴。ここで紹介する方法論的アプローチにより、相互作用が起こり得る構造的次元をその場で一目見ることができる。それは、すでに研究されている微生物生態系のほとんどがそうであるように、アティーネガーデンはパターン化されており、空間^5,7,8で不均一に組織化されていることを強調しています。SEMは、シアノスポンジ⁷⁷、ザトウクジラの皮⁷⁸、キノコ⁶⁶、刺胞動物⁷⁹、ヒト腸⁸⁰、地衣類⁸¹などの多様な宿主関連コミュニティにおける微生物叢の動態について、すでにその場の空間的視点を提供しており、プラスチスフェア(新しい人為起源の生態系)⁸²の記述にも貢献している。しかし、これらの各研究では、サンプル調製にわずかに異なる段階的方法が採用されていました。

庭のサンプルは非常に繊細で不均一であり、真菌の菌糸は、組み込まれた基質²⁴、微生物叢およびそのバイオフィルムの多様なセットに加えて、水分を失わないために適していると考えられています²⁶。しかし、私たちが採用したサンプル調製プロトコルは、そのような構造のほとんどを保持し、微生物叢の空間構造の特性評価を拡大することを可能にしました。カルノフスキーの溶液による固定は、このようなデリケートなサンプルの3次元側面がこの時点で崩壊および/または平らになる可能性があるため、プロトコルの重要なステップであると考えています。複雑な真菌ベースのサンプルは、通常、グルタルアルデヒドで固定し、OsO₄ ^65,66,67,68で後固定することにより、SEM用に調製されます。しかし、アルデヒド(パラホルムアルデヒドとグルタルアルデヒド)を組み合わせると、^SEM69,70のバイオフィルム保存が改善されることが報告されています。バイオフィルムの保存方法には、初期カルノフスキー固定剤に対して0.15%アルシアンブルーまたは0.15%ルテニウムレッド、ならびに後固定のために1%タンニン酸から1%オスミウムも含まれ得る。カルノフスキーのものでアティーネの庭と廃棄物を固定し、OsO₄でポストフィックスすると、バイオフィルム³²を証明していませんが、古い庭と廃棄物のサンプルにバクテリアが保存されました。私たちのサンプルは、以前のプロトコル^{32、33、69、70}で採用されたオスミウム後固定ステップなしで保存されたガーデン構造、微生物叢、およびバイオフィルムを持っていたため、このステップを削除することでプロトコルを簡素化することを好みました。_OsO4は、(特に)脂質細胞成分⁸³を固定するために使用される酸化剤である。腐食性が高いため、OsO₄は、吸入または摂取すると呼吸器または胃腸管を損傷するだけでなく、皮膚や粘膜と接触すると重度の火傷を引き起こす可能性があります^84,85。OsO₄固定後を除去することにより、プロトコルは結果的に操作される有毒なリージェントの数を減らします。

また、デリケートなサンプルには厳しすぎる可能性のあるアセトンを使用する代わりに、エタノール洗浄シリーズをお勧めします⁸⁶。また、10分単位のエタノール洗浄シリーズは、画像の解像度を損なうことなく、従来のSEMプロトコル⁴⁵を簡素化します。さらに、追加のスパッタリングステップにより高品質の画像が得られることを経験的に検証しました。これは、テストしたすべての種の庭のサンプルで一貫していました。このような追加のステップは、電子散乱が一度だけコーティングされたサンプルではるかに頻繁に行われたため、サンプルをより均一にコーティングした可能性があります(図4A)。したがって、私たちは、庭のサンプルでバイオフィルムを視覚化するための改善されたプロトコルを提供できる可能性のある添加剤と条件をテストする将来の作業を奨励します。

SEMは、表面の微生物叢細胞の形態とEPS空間配置を詳細に説明するための強力なツールであり、高解像度と倍率^70,87で庭のサンプルの地形とテクスチャを明らかにします。しかし、それはコミュニティのメンバーに分類学的な差別を提供していないため、誰がどこにいるかの区別はありません。さらに、SEMの焦点深度が大きいにもかかわらず、サンプルの3次元特性を通知しません。分類学的生物地理学や3次元空間分解能など、微生物園の完全な説明のために、SEM分析は庭のサンプルの段階的なイメージング技術の最初の手順と見なすことができます。分類学的分解能のために、SEMは、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)^88,89およびその変種、例えば、高系統発生分解能のFISH(HiPR-FISH)⁹⁰、組み合わせ標識およびスペクトルイメージングFISH(CLASI-FISH)^9,91、および3-D投影⁹²と組み合わせることができる。三次元微細構造解析は、X線マイクロトモグラフィー(X線μCT)⁹³によってさらに詳細に説明できる。これまでのところ、SEMにより、菌糸の周囲の微生物叢や基質表面、溝、くぼみの空間構成を詳細に観察することができました。このような微生物のパターン化は、アティーネガーデンにおける推定される微生物の相互作用に関する知識を構築しています。私たちが提示した準備手順は、他の繊細な微生物生態系における微生物の空間組織に関する研究を洗練するために広く適用できると信じています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2 mLチューブ	Axygen	MCT-200-C-BRA	サンプルを固定および脱水するには
塩化カルシウム無水	メルク	C4901	CaCl2 無水物 カルノフスキーを調製するためにs 固定剤
臨界点乾燥機	ライカ	EM CPD 300	臨界点乾燥用
両面カーボン導電性テープ、12 mm (W) X 5 M (L)	電子顕微鏡科学	77819-12	サンプルの取り付け用
昆虫学的鉗子	特定のサプライヤー		庭のサンプルを操作するには
エチルアルコール (=エタノール)、純粋 (≥99.5%)	Sigma-Aldrich	459836	脱水
鉗子	特定の供給者		庭のサンプルを操作するため
ガラスビーカー	特定の供給者		脱水用
ガラスペトリ皿	供給者		庭のサンプルを操作するため
ガラスピペット	供給者		サンプルを固定および脱水するために
グルタルアルデヒド(水性グルタルアルデヒドEMグレード25%)	電子顕微鏡科学	16220	Karnovsky'を準備するには固定剤
の金ターゲット	テッド・ペラ社	8071	金塩酸でスパッタリングコートするには
	Sigma-Aldrich	320331	溶液のpHを調整するため
画像エディタ	フォトショップ	任意のバージョン	を調整するには
パラホルムアルデヒド(パラホルムアルデヒド 20%水溶液 EMグレード)	電子顕微鏡科学	15713	Karnovsky' を準備するには固定剤
プロピレンレシピエン	特定の供給者		生きているアリのコロニーを維持するため
走査型電子顕微鏡	JEOL	IT300 SEM	サンプルイメージング用
カコジル酸ナトリウム三水和物	Sigma-Aldrich	C0250	カコジル酸ナトリウム緩衝液の調製用
スパチュラ	特定の供給者		庭のサンプルを操作するため
直径15mm×高さ10mmの試料容器	テッド・ペラ社	4591	臨界点乾燥用
スパッタコーター	バルテック	SCD 050	金
タブ(アルミマウント、フラットエンドピン)12.7 mm x 8 mmでコーティングするには	Electron Microscopy Sciences	75520	サンプルの取り付け用