ダウンストリームアプリケーションのための鳥類の排卵前卵胞顆粒膜およびテカ細胞層の分離

サマリー

ここでは、鳥類の排卵前卵胞で卵黄、顆粒膜細胞、およびテカ細胞を分離するためのプロトコルについて説明します。この精密な取り扱いにより、生殖機能におけるこれらの層の役割に関する重要な調査が可能になり、卵胞の発生、ホルモン調節、および農業収量と生物医学的洞察を向上させるための疾患研究の理解に役立ちます。

要約

採卵鶏(産卵鶏)とブロイラーブリーダー(食肉生産鶏の繁殖用ストック)は、信頼できるタンパク質源として世界の食料供給にとって重要です。また、ヒトの生殖疾患の研究のための新たな動物モデルでもあります。家禽研究の分野が発展するにつれて、層鶏とブロイラーブリーダーの卵巣の健康と機能は、農業研究者と生物医学研究者の両方にとって重要な研究ポイントになります。この新たな関心によってもたらされる課題の1つは、すべての研究者が卵巣標本の収集に採用できる複製可能な技術の必要性です。特に、研究者間の合意と一貫性を達成するために、鶏卵胞からの特殊な顆粒膜細胞層とテカ細胞層の適切な分離を定義するための詳細な視覚的プロセスを確立する必要があります。

この研究では、生殖年齢が最盛期の白いレグホーン雌鶏における排卵前卵胞と卵巣組織の抽出について説明しています。これらの卵胞の分離は、卵黄を凝固させて操作を容易にし、分離プロセス中に卵胞の自重が細胞層を引き裂くのを防ぐために、冷たい液体条件下で行われます。分離が完了したら、目的の細胞層をさらに消化して組織培養アプローチにしたり、凍結保存してゲノム解析やプロテオミクス解析に役立てたりすることができます。

概要

卵を生産するニワトリは、世界の食料供給チェーンの重要な構成要素であり、生殖能力と卵巣がんの研究のための進化する動物モデルです。ニワトリは、インフルエンザワクチンの卵術研究¹から癌性腫瘍増殖の研究²まで、実験室での使用の長い歴史があり、性腺の発達^3,4,5を解明するための重要な動物です。雌鶏の生殖器系の役割、特に卵巣卵胞発生の周期的な性質と関与する細胞の種類を理解することは、非常に興味深い分野であり、応用が期待されています。雌鶏の卵巣を調査するマルチオミクスアプローチは、生産性解析を通じて農業収量を増やし、雌鶏を例にヒトの健康に関わる要因を生殖疾患のモデルとして解明する応用があります。

鳥の卵巣は、(1)小さな原始卵胞と一次卵胞(>1 mm)、(2)さまざまなサイズの加入前卵胞(白から淡黄色、2〜8 mm)、および(3)大きな卵黄で満たされた排卵前卵胞(黄色)(図1)^5,6,7。性的に成熟した鳥類の卵巣は、卵巣卵胞を収容する外側の皮質と、平滑筋、神経、および血管系で構成される内側の髄質で構成されています⁸。卵胞の発達の全サイクルは皮質で起こります。しかし、生後約5か月になるまで、左の卵巣だけが排卵前(つまり黄色)卵胞の完全な発達階層を示し、鶏は最初の排卵と産卵(産卵)を経験します。排卵前の卵胞は、最大で次に排卵する卵胞(F1卵胞)から、発達していない最小の卵胞(F5またはF6)までの範囲で、約5〜6個の卵胞の大目に見える階層を確立します。排卵前卵胞は、サイズが大きく、神経支配が広く、卵黄が濃いため、小さな加入前卵胞と簡単に区別できます。

すべての卵胞には、卵胞が排卵前のさまざまな段階を経るにつれて、卵胞のシグナル伝達、成長、および発達におけるさまざまな役割をサポートする特殊な細胞タイプが含まれています-これらは、顆粒膜細胞、テカ細胞、および卵子(女性配偶子)です(図2A)。特に、顆粒膜細胞層は卵胞の内壁を形成し、テカ細胞は卵子を囲む他の壁を形成します。卵胞が排卵前階層を進行するにつれて、テカ細胞層と顆粒膜細胞層は、特に排卵前卵胞の茎の真向かいの点に沿って薄くなり始めます。茎は、卵胞が卵巣に付着する点です(図2B)。茎の反対側にある顆粒膜層とテカ層のこの線は、柱頭と呼ばれます(図2C)。それは血管系を完全に欠いており、F1卵胞の排卵中の卵胞破裂のポイントになります。また、胚盤、または卵子を囲む支持細胞のふわふわした白い層も見えます(図2B)。

顆粒膜細胞とテカ細胞はどちらも、複雑なホルモンシグナル伝達を通じて卵子を取り囲み、支えるため、卵胞の発達の重要な構成要素です。顆粒膜細胞層は、サイクリックAMP(cAMP)シグナル伝達を介してステロイド産生経路をサポートし、プロゲステロン産生をもたらします^9,10,11。一方、テカ細胞は一時的にエストラジオールを産生しますが、これはテカ細胞がアンドロゲンとプロゲステロンを産生する哺乳動物とは大きく異なります12,13,14。外部シグナル伝達と併せて考えると、顆粒膜細胞とテカ細胞は卵胞の成熟と産卵における重要なドライバーです。顆粒膜層とテカ層を分離する技術は、1977年にGilbertらによって最初に報告されました¹⁵。顆粒膜層とテカ層を包括的に分離し、顆粒膜材料が残らないようにすることは、ギルバート法では困難をもたらす可能性があります。さらに、分離を完了するための明確な視覚的ガイドがないと、タスクの実行が困難になる可能性があります。この研究は、排卵前卵胞からの顆粒膜、テカ、および卵母細胞層の抽出と分離について説明し、画像とビデオの両方を使用して適応を提供し、明確な視覚的表現を提供することを目的としています(図3)。この手法を可視化することで、鳥類の卵巣卵胞を研究している科学者は、農業用および生物医学的マルチオミクスアプローチの両方で、顆粒膜とテカ層を再現性よく捕捉できるようになります。

プロトコル

この研究で使用されたすべての動物は、デラウェア大学の施設動物管理および使用委員会(IACUCプロトコル110R)によって承認されたプロトコルに従って維持および安楽死されました。

1. 事前準備

1. 殺菌
   1. 重力置換オートクレーブ(121°Cで20分間)を使用してオートクレーブ5オンスのガラスボウルをアルミホイルで覆い、上部にオートクレーブテープを貼り付けて無菌性を維持および表示します。
      注:分離が行われる卵胞ごとに1つのボウルが必要になります。
   2. 重力置換式オートクレーブ(121°Cで20分間)を使用したオートクレーブ解剖ツールで、ハサミ、湾曲鉗子、滅菌ポーチに入ったストレート鉗子など。
2. 分離エリアの設定
   1. 図4に示すように、卵胞分離領域を設定します。卵胞分離の直前に保持容器に氷を入れ、卵胞分離プロセス全体で必要に応じて補充します。
3. ソリューション
   1. PBS濃度を10倍に希釈してワーキングストックの1倍にし、解剖の前日に+4°Cの冷蔵庫に入れます。
   2. イソプロパノールをスプレーボトル内の作業ストック濃度70%に希釈します。

2. 解剖

1. 性的に成熟した雌の鳥を安楽死させます。
   1. 性的に成熟した雌の鳥(現在産卵している必要があります)を選択し、子宮頸部脱臼などの施設のケアと使用プロトコルに従って、承認された方法(AVMAガイドライン)で¹⁶ 羽を安楽死させます。
   2. 最大のF1卵胞を捕獲するには、その日の光が始まってから最初の4時間以内に動物を安楽死させます。安楽死の前に下腹部を触診して、子宮内の硬い殻の卵を確認します。これにより、産卵、したがって次の排卵がまだ起こっていないことが保証されます。
2. 卵巣にアクセスします。
   1. 外部の死体と羽毛に70%イソプロパノールをスプレーします。これにより、羽毛が湿り、切開点がきれいになります。
   2. 解剖ハサミと手袋をはめた手を使用して、約7.5 cm(3インチ)の長さの水平(横)正中線切開を1つつまんで切ります。臓器の穿刺を避けるために、切開する前に皮膚、筋肉、脂肪の層をつまんでください。
   3. 鳥の右側で切開部を横方向に広げ、手袋をはめた指で内臓をハサミの邪魔にならないように探ります。動物の肋骨の2〜3本が右側に切られるまで続けます。
   4. 右側で行ったように、鳥の左側に向かって切開を広げます。卵巣の排卵前卵胞はここに位置し、卵巣表面から突き出ており、簡単に破裂する可能性があるため、さらに注意して進めてください。鳥の左側で2〜3本の肋骨が切られるので、排卵前の卵胞をハサミから遠ざけるために、指で穏やかな圧力をかけます。
   5. 片方の手を鳥の下腹部に置き、もう一方の手を胸骨の下側にしっかりと置き、手動で鳥の胸を上方に引っ込めて、鳥の体腔にさらにアクセスできるようにします。
   6. 鳥の太ももをそれぞれホックジョイントに近づけ、手動で後方に押して、両方の股関節を同時に脱臼させます。現在、視覚的にも空間的にも卵巣への完全なアクセスがあります。
3. 排卵前の卵胞を取り除きます。
   1. すべてのステップを日常的な視覚で実行します。個人がどの段階でも視覚化に問題がある場合は、解剖顕微鏡を使用してください。
   2. 手袋をはめた指だけを使って、目に見える黄色の排卵前卵胞をそれぞれ優しくカップに入れ、卵巣から抽出します。抽出中に茎をつまむだけで、茎を切断するのを助けます。毛包自体をつまむと、破裂する可能性があります。
   3. 各卵胞を氷冷PBSの滅菌容器に入れます。
   4. 卵黄の凝固を可能にするために、排卵前の卵胞を氷の上に少なくとも5分間放置します。温かい卵黄は周囲の卵胞細胞層に付着するため、その後の分離技術の実行が困難になります。

3. ラボ内での分離

1. 滅菌容器から分離された卵胞を取り出し、残りの卵胞を入れた容器を氷の上に戻します。操作する前に卵胞を研究し、茎、柱頭、胚椎間板の3つの特徴の位置に注意してください(図2)。
2. 卵胞表面から漿膜を取り除くことから始めます。毛包を乾いたペーパータオルの上で優しく転がして漿膜層を取り除き、必要に応じてそっと引き抜きます。
3. PBSで満たされたボウルの上の茎で卵胞を保持します。重力を使用して、茎が卵胞の表面で終わる場所を視覚化し、はさみを使用して、卵胞の表面に穴を開けずに茎だけを切り取ります。漿膜が見えなくなるまで、漿膜の除去を続けます。
4. ライトボックスを照らし、胚椎間板を基準にして、柱頭を反対側に再配置し、柱頭側が見えるように卵胞をそっと保持します。氷のように冷たいPBSのボウルの上に卵胞を直接保持します。
5. メスを手に取り、柱頭の長さに沿ってそっとスライスし、卵黄が落ち始めたらすぐに卵胞をPBSに落とします。卵胞をしっかりと保持 すると、卵黄が重力によって単純に落ちるのではなく、卵黄が押し出されます。
6. 一対のまっすぐな歯のない組織鉗子を使用して、スライスの片側の卵黄から卵胞壁のピンク色の層をそっと剥がします。卵胞壁を卵黄から離す小さなピンチアンドプル動作を使用して、この抽出を完了します。
7. 層分離は、一度に約5mmの卵胞壁組織が卵黄から引き離されている場合に最も効果的です。卵胞壁の5 mmの部分が卵黄から正常に引っ込められたら、まっすぐな鉗子と並行して角度のある鉗子を使用して、卵胞の殻に沿ってプローブします。
8. 場合によっては、顆粒膜層はテカ層よりも卵黄と密接に関連している可能性があります。この状況では、どちらかの鉗子を使用して卵黄の表面を非常に穏やかに探り、ティッシュペーパーのような層を卵黄から引き離そうとします。顆粒膜層が見つかったら、それをテカ層にしっかりとつまみ、前述のように両方の層を卵黄から引き離します。
9. 湾曲した鉗子を使用して、つままれた層から卵黄を軽く払います。ボウルから余分な卵黄を掃き出すか取り除きます。顆粒膜層をこすらないでください。これにより、裂け目が発生します。激しい動きはPBSソリューションを曇らせ、視覚化を減らします。慎重かつ慎重な動きで進めてください。
10. 卵胞壁の各5〜10 mmセクションが引っ込められた後、鉗子の各セットのテカ層と顆粒膜層を取り、卵黄から剥がされるのと同じように、2つの層が互いに徐々に剥がれていることを確認します。このプロセスを卵胞の外側の周りで続けます。顆粒膜-テカ層のフラップにより操作が困難になった場合は、卵胞を回転させてスライスの反対側からプロセスを開始します。
11. 分離の過程で、胚盤(雌の配偶子と胚小胞)に遭遇します。これは、顆粒膜層と卵黄の両方に非常に付着している領域です。湾曲した鉗子が軽いブラッシング動作で胚椎間板を卵黄表面に押し出すために軽いブラッシング動作で使用されるため、まっすぐな鉗子を使用して胚椎間板に慎重に接近します。
    1. 胚盤を研究用標本として希望する場合は、この時点で角のある鉗子で卵黄を払い落とし、必要に応じて保管します。
12. 卵胞の球全体が卵黄が除去されるまで、湾曲した鉗子で卵黄を卵胞壁から分離し続けます。
13. 卵黄の残りの部分が層からブラシをかけられたら、顆粒膜層の最後の部分をテカ層から分離します。完全に分離された顆粒膜層には、卵黄物質がまったく含まれていない場合がありますが、卵黄でコーティングされていないことを確認してください。顆粒膜層と髄膜層を4°Cの温度PBSで別々の容器に入れます。
    1. 顆粒膜層がテカ層とは別の容器に入ったら、鉗子を使用してPBS内でテカ層を前後に穏やかに攪拌し、顆粒膜層の残りの残りが剥がれるようにします。
       注:分離後の特定の処理方法では、目的の研究に応じて、消化または遠心分離による脂質破片の除去が説明される場合があります。
    2. この手法を初めて実践するときは、代表的な分離標本を組織学的に調製して分析し、正確な層分離と収集を確認します。
       1. これを行うには、メッシュ組織カセットまたはスポンジを使用して分離した組織の一部を中性緩衝ホルマリンで固定し、標本の損失を防ぎ、次にパラフィンを包埋し、切片をヘマトキシリンとエオシン(H&E)で染色します。
       2. その繊細な性質のため、顆粒膜層を慎重に取り扱い、組織学的カセット内の生検スポンジに配置して、細胞層が無傷のままであることを確認します。
       3. theca層を組織学的カセット内に直接入れます。これにより、他の濾胞組織(すなわち、卵黄タンパク質または髄膜細胞が付着した顆粒膜細胞層標本)による標本汚染のレベルを視覚化することもできます。
          注:卵胞組織の密接な関連により、目的の単一の層のみを常に取得できるとは限りません。しかし、汚染の可能性のレベルを知ることは、その後のマルチオミクスアプローチの解釈に情報を提供することができます。

結果

このプロトコルは、卵巣卵胞からの顆粒膜および髄腔細胞層の分離をもたらす(図5 および 図6)。その後、これらの層を組織学的検査用に準備して、分離が成功したことを確認できます。これらの組織学的画像は、委員会認定の獣医病理学者(EMB)によってレビューおよび撮影され、F1およびF5排卵前卵胞の両方について、顆粒膜層とテカ層の効果的な分離を明確に示しています(図7)。特に、顆粒膜層は、隣接する髄部組織からの抽出および分離後のその壊れやすい性質の結果である複雑な襞を示します。顆粒膜細胞は、円柱状から擬似層状に形成された円柱状で識別でき、互いに密接に付着し、細胞膜の境界が明確である(図7A、B)。

テカ細胞層は、小さくて密な核を有する紡錘形の細胞によって特徴付けられ、大きな黄体細胞(活性ステロイドホルモン産生を示す豊富な透...

ディスカッション

この研究では、家禽の排卵前卵胞から顆粒膜と髄膜の両方の細胞層を明確に分離する手順を概説しています。1977年にGilbertらによって確立された既存の方法とは異なり、この方法でなされた適応は、すべての排卵前卵胞¹⁵から顆粒膜細胞層をテカ層から手動で分離する際に、より制御された環境を可能にする。さらに、研究者は手順全体を通じて顆粒膜細胞層を視覚化できるため、精度と分析能力が向上します。この技術は、他の家禽種のための顆粒膜またはテカ層を単離するために容易に適応することができ、他の卵生(産卵)動物^17,18に潜在的に使用することができる。この手順により、研究者は異なる濾胞細胞層を分離して調査する機会を得ることができ、その調査により、農業用家禽の生産、鳥類の繁殖、ヒトの生殖能力と生殖疾患の潜在的なモデリングなど、多様な研究分野への貴重な洞察が可能になります¹⁹。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
3.5インチ小さなガラスのボウル、5オン	アマゾン	B0BXP5PJTN	直径3.5インチ以上のオートクレーブ可能なガラスボウル
アルミホイル	コストコ	720	カバー オートクレーブボウル
アマゾンペットトレーニングパッド、レギュラー、100カウント	アマゾン	B0B58WTPFS	壊死パッドとして使用するには、任意の吸収剤パッドが機能します
オートクレーブテープ	フィッシャーブランド	15-901-111
コールパーマーLED光ファイバーイルミネーター	コールパー	マーEW-41723-02
湾曲した非常に細かい精密先端鉗子	フィッシャーブランド	16-100-123	非鋸歯状
解剖顕微鏡	ライカ	S6E
精密はさみ	フィッシャーブランド	12-000-155	非鋸歯状
食品容器ボックス17個セットクリア/グリーン電子レンジ冷凍庫食器洗い機安全な	アマゾン	B09QGZCRDB	と3.5インチの小さなガラスボウルを保持できる任意の容器を使用してください
45度湾曲テーパー非常に細かいポイントピンセット/鉗子	ッシャーブランド	12-000-125	鋸歯状なし
高精度ストレート超微細ポイントピンセット/鉗子	ッシャーブランド	16-100-120	非鋸歯状
イソプロパノール	フィッシャーブランド	A426P-4
マッケッソン 検体容器、滅菌済み、スクリューキャップ、漏れ防止、120 mL	マッケソン	16-9526	4 オンス / 120 cc、目盛り付き
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS、10x)、pH 7.6	サーモフィッシャー	J62692。K7	は
			70%イソプロパノール
滅菌外科用ブレード#22	シンシナティサージカル	122
滅菌ポーチ10 "x 16"	Amazon
Tapered Ultrafine Tip Fisherbrand	フィッシャーブランド	16-100-121	非鋸歯状
フォーム生検パッド、長方形	フィッシャーブランド	22-038-221
ホルマリン溶液、10% (組織学的)	フィッシャーケミカル	SF98-4
蓋付き組織処理/埋め込みカセット	Simport M490-2	Z672122

ス 蓋付き氷高精度フィフィ、 B07MFB455C