キノリン系イオン液体のグリーン合成

サマリー

本研究では、キノリンを過剰に含んだ1-ブロモヘキサデカンを混合したキノリン系イオン液体(IL)、すなわち1-ヘキサデシルキノリン-1-臭化物{[C₁₆quin]Br}のグリーン合成を解明するとともに、核磁気共鳴および赤外分光法による詳細な評価を行う。

要約

薬剤耐性(AMR)の脅威はますます高まっており、細菌、ウイルス、寄生虫、真菌によって引き起こされる容赦なく発生する感染症に対して、一般的な抗生物質の効力を危険にさらし、人間の健康と幸福に大きな脅威をもたらします。この点で、いくつかの新しい分子がその気概を証明しており、イオン液体(IL)は、既存の抗菌剤に代わる最も環境に優しく、不揮発性で、熱的に安定した代替品の1つであり、高い溶媒和能力と低い蒸気圧を備えています。さらに、これらのエンティティをタンパク質構造の安定化と不安定化の両方、および酵素活性の強化に利用することで、生物医学業界での可能性がさらに高まりました。この点を念頭に置き、キノリンベースのILのグリーン合成と特性評価について、その膨大な抗菌力、低い細胞毒性、優れた人工シャペロン活性により、ILのグリーン合成と特性評価を提示します。ここでは、溶媒を含まず、より環境に優しい反応条件でワンポット合成アプローチを巧みに行うことで、反応効率が改善されただけでなく、化学収率も向上しました。合成されたILの純度は、1H核磁気共鳴(NMR)、13C NMR、および赤外(IR)分光法を用いて確認されました。合成された化合物の生物学的可能性は、その吸収、分布、代謝、排泄、および毒性(ADMET)特性を分析することによりさらに検証され、ディスク拡散アッセイを使用して認証されます。

概要

世界人口の驚異的な増加は、過去数年間で、食品、医薬品、その他の人間の生命維持のための重要な製品を含む、膨大な数の商品の消費の大幅な増加を説明しています。これにより、非常に専門的で、生態学的に健全で、有益な特性を持つ新しい化合物の探求が世界中で活性化されています。イオン液体(IL)は、この点で優れていることが証明されています。これらの化合物が科学領域に展開されることで、現代の化学技術の研究における新たなベンチャーが後押しされています¹。従来のアプローチとは対照的に、ILの利用は進行性反応条件を容易にするだけでなく、実験的研究開発に関連するさまざまな生化学的課題に取り組むためのカスタマイズされた戦略を促進します²。

通常、ILは、カチオン(有機)とアニオン(無機)を構成する安定塩であり、融点は100°^C3未満です。グリーンケミストリーの12の原則に従うと、経験的には、これらは慣習的な有機溶媒⁴の説得力のある代替品です。これらの化合物の利用に関連する驚くべき特性は、優れた固有伝導性、極性、溶媒和傾向、熱安定性、非揮発性、酸性度/塩基性、親水性/疎水性、および調整性を含み、ILを実験研究に最も適したものにしています⁵。

現代の有機合成⁶、触媒⁷、および^{センサー8}、アクチュエータ^ー9、電池¹⁰、燃料電池¹¹を含む様々な電気化学プロセスにおける様々なクラスのILの広範な応用は別として、このクラスの化合物は、AMRの観点から生物医学の分野で重要な認識を与えられてきた。現在の試用期間中、イミダゾリウム、ピリジン、コリン、およびピロールに基づくILは、その高い電荷と疎水性により、治療薬として非常に効果的であることが明らかになっています¹²。しかし、キノリンベースの対応物は、依然として病原性微生物に対して最も強力であると考えられています¹²。このクラスのILに伴うその他の生物医学的応用には、人工シャペロン活性¹³、癌細胞に対する細胞毒性¹⁴ 、および優れた薬物運搬能力¹⁵が含まれる。

従来、ILの作製には、ジクロロメタン、ベンゼン、四塩化炭素、ジクロロエチレンなどの毒性の高い溶媒媒体が利用されており¹⁶、生体適合性が阻害され、化合物の毒性が高まるため、生物学的利用には望ましくありません。さらに、反応媒体に有害な溶媒を使用すると、反応時間が遅くなるだけでなく、環境に放出される廃棄物副産物の意図しない生成も増加する¹⁷。さらに、反応媒体に使用される溶解剤も最終生成物のpHに影響を与えます。したがって、反応の最後にその除去を行うことは、特に目的の化合物がタンパク質関連の生物学的システムに使用することを意図している場合に重要です。したがって、このような溶媒の使用を避けることは、グリーンケミストリーの領域では有利です。

この研究では、生体適合性で毒性のない¹³ IL、すなわち1-ヘキサデシルキノリン-1-臭化物のワンポット合成について、より環境に優しいルートを使用して報告します。本戦略では、分子溶媒の利用を省略し、反応混合物内で形成されるILの自己溶解能力を活用し、高い反応効率と化学収率を促進します。メンシュトキン反応¹⁸は、現在の合成方法論の基礎を形成しています。合成された化合物の純度は、NMRおよびIR分光法を用いて調べられます。化合物の薬物動態プロファイルと毒性は、ADMET研究を通じて調査されました。.さらに、病原性 カンジダ・アルビカンス 株に対する合成ILの抗菌性もこの研究で実証されています。

プロトコル

注:1-ヘキサデシルキノリン-1-臭化物{[C₁₆quin]Br}は、Sharmaらによって以前に報告されたように合成されました.¹³。

1. ガラス器具の調製・滅菌

注:これは、目的の化合物の合成のための反応を設定する少なくとも1日前に行う必要があります。

1. 24/29、250 mL、2ネック丸底フラスコ(RB)を、測定シリンダーなどの他のガラス器具と一緒によく洗浄し、蒸留水とアセトンですすいでください。
2. 洗浄した装置を60°Cの熱風オーブンで、装置が完全に乾くまで乾燥させます。
   注:通常、洗浄した装置は、水膜を完全に除去し、反応システムに不純物がないことを確認するために、乾燥オーブンに一晩置く必要があります。

2. 装置のセットアップ

注:反応物が均一に加熱されるように、装置は適切にクランプする必要があります。反応セットアップの概略図を 図1に示します。

1. マグネチックスターラー付きのホットプレートにオイルバスを置きます。反応を開始する前に、オイルバスを80°Cに予熱します。
2. RBをチューブレトルトスタンドを使用してオイルバスに立たせ、マグネチックスターラー付きのホットプレートに置かれたオイルバスに半分浸します。
3. RBの上部口をパージ針を構成するコルクで密封し、さらにN₂ バルーンが取り付けられた注射器に接続します。
4. 反応媒体からのN₂ の漏れを避けるために、別のゴムコルクを使用してRBのもう一方のネックをしっかりと密封します。
5. 反応物をRBに添加する前に、N₂ パージを通じて維持された不活性雰囲気で、培地全体を80°Cに予熱します。
6. N₂ バルーンを繰り返し補充して、反応システムの不活性を確保し、全体の温度を維持します(したがって、オイルバス加熱が好ましい)。

3. 反応系への反応物の添加

1. 0.1 Mのキノリンと0.105 Mの1-ブロモヘキサデカンを、あらかじめ設定された反応環境を乱さずに反応システムに注ぎます。
2. 内容物を2500〜3000rpmで3日間、不活性環境および一定温度で連続的に攪拌します。

4. 化合物の精製/再結晶化

注意: 製品全体を再結晶化しないでください。代わりに、製品の損失を避けるために、バッチ再結晶を選択する必要があります。

1. 得られた固体を1:2トルエン/エタン酸エチル混合物に溶解します。この混合物をディープフリーザー(温度を-15°Cに設定)で-15°Cに冷却し、真空ポンプとフィルターフラスコにチューブを介して取り付けられたブフナー漏斗を使用して真空下でろ過します。0.45 μmの細孔サイズを構成するポリプロピレンフィルターメンブレンをBuchner漏斗に配置し、フィルターの底全体を覆います。フィルターに少量の溶剤混合物を注ぎ、適切なシールを作成し、セットアップからの空気漏れを防ぎます。
2. ろ過した製品を冷たいトルエンで洗浄するには、溶媒を漏斗に徐々に注ぎ、続いて真空オーブンで70°Cで乾燥させます。この手順を2回繰り返して、目的の化合物の高純度を確保します。

5. NMR分光法による化合物の検証

1. 化合物を ^1HNMRおよび ^13CNMRに供する前に、1〜10 mgの化合物を測定し、約1 mLのCDCl 3に溶解して重水素化クロロホルム(CDCl₃)に溶解します_。
2. この混合物を1mLシリンジを使用してNMRチューブに注入し、NMR分光計でサンプルを分析します。サンプル調製は ^、1H NMRと ¹³C NMRの両方で同じです。

6. 合成ILのIR評価

1. 化合物のIRスペクトルを取得するためにサンプル調製は必要ありません。
2. 数mgの固体サンプルをIR分光計にかけ、合成された化合物に存在するさまざまな官能基についての洞察を得ます。読み取り値は、以前に示した¹⁹と同様に取得されました。

7. ADMET特性の予測

1. 目的のILの正規のSMILESを無料のオンラインソフトウェアADMETLAB 2.0に入力し、プログラムを実行してさまざまなパラメータを取得し、その生物学的可能性を立証します。

8. 合成ILの生物医学的応用を実証する椎間板拡散アッセイ

1. カンジダ・アルビカンス(ATCC 90028)の真菌株を酵母ペプトンデキストロース(YPD)ブロスで37°CのBODシェーカーインキュベーターで約16時間予備培養します。
2. 1 Lの二重蒸留水に1%酵母抽出物、2%ペプトン、2%デキストロース、および1.5%寒天を混合して、YPD寒天培地を調製します。新たに形成したYPD寒天培地25 mLを90 mmペトリプレートに注ぎ、121°Cで15分間オートクレーブします。 メディアが適切に固化するように、プレートを邪魔しないでください。
3. プレートが完全に固まったら、ガラススプレッダーを使用して、調製したばかりの真菌接種物約100μLを、培地が入ったプレート上に均一に広げます。プレートを層流フードに5〜7分間放置します。
4. 鉗子を使用して、直径5〜6 mmの滅菌円形の紙ディスクを同じプレートの中央に置きます。
5. 20〜200μLのピペットを使用して、合成したILの0.1mM水溶液50μLをディスク上に徐々に加えます。
6. プレートを約30分間冷蔵して、ILが寒天に適切に拡散することを確認します。プレートを37°Cにあらかじめ設定したBODインキュベーターに24時間置きます。
7. 測定スケールを使用して阻害ゾーン(ディスク直径を含む)を測定し、式1に従ってこのゾーンの下の面積を計算します。
   面積 = πr² (1)

結果

図2は、合成プロセスに関わるメンシュトキン反応の反応スキームを表しています。このようにして合成された1-ヘキサデシルキノリン-1-臭化物は、NMRおよびIR分光法を用いて特徴付けられた。図3に示すように、得られた油性生成物は、図3に示すように、δ 9.34 (d, 1H)、8.21 (d, 1H)、7.80 (t, 1H)、7.30-7.35 (m, 3H)、7.20 (d, 1H)、5.00 (t, 2H)、2.00 (p,2H)、1.30-1.35 (m, 26H)、1 (t, 3H)で¹H NMR(400 MHz、_{CDCl 3})を示すことが期待されます。化合物は、δ 143、141、131、130.27、130、127.5、126.3、126、60、31、29、29、28.5、27、23、14で¹³C NMR(図4;100 MHz、CDCl₃)を示す必要があります。各ピークには、化合物の構造に記載されている対応するプロトン番号がタグ付けされており、そのシグナルをもたらす役割を果たします。

CDCl₃ は、この領域に顕著なシグナルを発するH原子がないため、電磁スペクトルのNMR領域(すなわち、無線周波数領域)に対して透明であり、したがって、重水素化した形でのサンプル調製のための溶媒として使用されます。印加された磁場を妨げず、本質的に完全に不活性です。しかし、NMR溶媒の重陽化は正確に100%に達することができないため、この溶媒に対応するピーク(1H NMRスペクトルでは約7.26ppmに現れる)を排除することはできません。ただし、現れるピークは通常重要ではなく、CDCl₃ のブランクスペクトルを実行し、それに応じて必要なピークを統合することで完全に除去できます。これらの設定は、装置内で直接行うことも、特定のソフトウェア(NMRiumなど)を使用して行うこともできます。サンプルが完全に乾燥していない場合、水のピーク特性がスペクトルに顕著に現れることがあります。さらに、CDCl₃ および他の重水素化溶媒もまた、いくらかの量の水を含んでおり、それにより水の存在に起因するピークを付与することがある。ここでの問題は、サンプルを適切に乾燥させ、NMR溶媒を室温に保ち、透明なフィルムで覆うことで解決しました。場合によっては、炭酸カリウムや硫酸ナトリウムなどの特定の不活性乾燥剤も、CDCl₃のボトルに存在する水分含有量を取り除くために使用されます。

ILのFTIRスペクトル(図5)は、3051 ^cm-1、2917 ^cm-1、2853 ^cm-1で最大強度の振動帯を示すことが期待されており、これは芳香環に存在するC-H伸縮振動やアルキル炭素に対応しています。3440cm-1の広い肩幅は、NHストレッチ振動に対応します。1357 ^cm-1で観察された別のショルダーバンドは、C-N結合によって生じる伸張振動の特徴です。820 ^{cm-1,770 cm-1} と 710 ^cm-1 の注目すべきバンドは、面外 C-H 曲げ振動に関連しています。1155 ^cm-1のピークは、面内C-H曲げ振動に特有のものです。芳香環に広がるC-C伸縮振動は、1468 ^cm-1、1520 ^cm-1、1585 ^cm-1 に見えるピークによって検証されます。このようにして得られた結果は、Sharmaらによって以前に報告されたデータ¹³と同等であり、したがって、目的の化合物の形成を確認します。

ADMET分析によって得られた結果を 表1に示します。[C₁₆quin]Brの生物医学的ポテンシャルは、 C. albicans 株に対するウェル拡散アッセイを用いて調査しました(図6)。この手法は、化合物の適用部位周辺の増殖阻害領域を測定することにより、ILの抗菌効力を評価します。[C₁₆quin]Brは 、C. albicansに対して統計的に顕著な抗菌効果(p < 0.05)を示したことが観察され、このクラスのILは生物医学の分野で非常に強力で効果的です。

反応のパーセンテージ収率
反応の理論収率は、採用された反応スキームに従って、次のように計算できます(図2)。

このスキームから、1 Mキノリンは1 Mの1-ヘキサデシルキノリン-1-臭化イウム、すなわち129.16 g/molキノリン= 434 g/mol [C₁₆quin]Brの形成につながります。

12.916 g(0.1モル)のキノリン ×12.916 = 43.4 g

したがって、反応の理論収率は43.4gである。

しかし

% 利回り = ×100

本研究では、得られた生成物を完全に乾燥させた後の反応の実際の収率は37.84gであることがわかりました。

従って

% 利回り = ×100=87.188% (87%)

さらに、現在のシナリオで見られるように、反応時間が長いことは、反応システムが完全な熱力学的平衡を達成できるようにするために適切であり、ギブスの自由エネルギーを最小限に抑えながらシステムのエントロピーが最大化されます。これにより、最終的に反応の収率が最大化されます。ただし、反応条件は非常に穏やかであるため、反応物全体が生成物に正常に変換されたことを確認するために、反応時間を延長する必要があります。ここでの反応時間は、実用主義を繰り返した後に最適化されます。

図1:反応のセットアップ。 この図は、反応セットアップの一般的な回路図を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:合成メカニズム。 合成プロセスに関与する反応スキームの概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:予想される¹時間のNMR。 [C₁₆quin]Brの¹H NMRスペクトルの表現この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 4: 予想 ¹³CNMR。 [C₁₆quin]Brの¹³C NMRスペクトルの表現この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:予想されるIRスペクトル。 [C₁₆quin]BrのIRスペクトルの表現この 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:抗真菌研究。 ディスク拡散アッセイは、ILの0.1 mMの50 μLの添加によって行われ、[C₁₆quin]Brの抗真菌電位を表しました。 この 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

財産	価値	コメント
リピンスキー・ルール	受け入れ られる	MW≤500;ログP≤5;H-アクセプター≤ 10;Hドナー≤ 5.2つの特性が範囲外の場合、吸収率または透過性が低い可能性があり、1つは許容範囲です。
胃腸吸収	高い	経口投与の有効性の向上
水溶性	適度	compundの薬物運搬能力を強化します
バイオアベイラビリティスコア	0.55 (55%)	化合物の治療可能性に影響を与える

表1:ADMET分析。 合成されたILの生物学的可能性を検証するために考慮すべき重要な特性を表す表。

ディスカッション

近年、ILは、タンパク質のリフォールディング/シャペロン活性、薬物送達媒体、および/またはいくつかの有機反応における触媒など、生化学科学の分野におけるさまざまな有望な実装を明らかにしています。それらの調整可能な、生体適合性、溶解性、持続可能性、安定性などの興味深い物理化学的特性は、それらを新規治療薬の開発の潜在的な候補にしています²⁰。本研究では、AMRを今日の世界の健康、食料安全保障、開発に対する重大な懸念事項の一つとして捉え、バイオメディカルサイエンスの領域における新規医薬品化合物の研究開発を優先的に進めています。生物医学業界での応用にキノリンベースのILを選択するにあたり、病原性微生物の破壊におけるその高い効力を認識しています。このクラスの化合物の抗菌効果とは別に、その人工的なシャペロン活性は、科学界の生物物理学的側面でそのメリットを高めます。

本研究では、より環境に優しい反応経路を用いて、目的のILを合成することに成功しました。有毒な溶媒の利用に依存する従来の方法論、進化する有害なガス状副産物²¹とは対照的に、ここでは、より経済的で、環境に優しく、溶媒を含まないアプローチを合成するためのアプローチを報告する。このプロトコルには、簡単な反応セットアップと簡単な装置の利用が含まれ、目的の化合物の堅牢な実験室合成が容易になります。ここで調達した製品は、簡単なろ過技術により簡単に分離できます。反応の過程で実質的な副生成物が形成されないため、合成のより環境に優しい側面がさらに促進されます。この研究で使用された技術は、目的の化合物の化学的収率と純度の両面で効率的であることが証明されました。そうでなければ多段階の反応は、時間とリソースを削減することを意図して、単一のポットでもたらされました。この技術は、一般的な有機合成に伴う長期にわたる分離および精製段階を取り除くために採用されました。

ただし、上記のプロトコルに伴う制限には、反応条件(特に温度)の適合性の徹底的な管理と、不活性な作業環境を手動で永続させるためにN2ガスの適切なパージを確保することが含まれます。個々のステップを適切に実行するためには、反応環境をタイムリーに制御および監視することが重要です。スケーラビリティは、工業目的でのワンポット合成のスケールアップは、均質な混合に関連する懸念や各反応パラメータの制御に関連する懸念のために非常に厳しいものになる可能性があるため、提案されたプロトコルに対する別の潜在的な障害となる可能性があります。

結論として、報告されている方法論は、グリーンケミストリーにおける強力な戦略であり、いくつかの利点を提供する一方で、反応経路の設計、実行、最適化を行う際に細心の注意を払い、熟考する必要がある独自の課題があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1-ブロモヘキサデカン	メルク	CAS no.112-82-3	純度 95% (HPLC 分析により決定)
酢酸エチル	メルク	CAS no. 205-500-4	純度 95% (HPLC 分析により決定)
核磁気共鳴 (NMR) 分光器	Jeol、モデル: JNM-ECZ 400S	Nil
Quinoline	メルク	CAS no.91-22-5	純度 95% (HPLC により決定)分析)
トルエン	メルク	CAS No. 108-88-3	純度95%(HPLC分析により決定)