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方法論記事

C-グリコシド切断腸内細菌のスクリーニングと単離

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DOI:

10.3791/67346

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2025年2月28日

 ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

この研究は、C-グリコシドを切断できる腸内細菌を効率的にスクリーニングおよび分離するための一連の標準操作手順(SOP)を確立します。

要約

C-グリコシドは薬用植物によく見られ、抗菌、抗炎症、抗ウイルス、抗酸化、抗腫瘍活性など、さまざまな生物活性とともに広範な構造的多様性を示します。C-グリコシドでは、糖部分のアノマー炭素は、炭素-炭素結合を介してアグリコンに直接結合しています。O-グリコシドと比較して、C-グリコシドは構造的に安定しており、酸や酵素に耐性があります。その結果、通常は壊れにくく、吸収性が低く、バイオアベイラビリティが低下します。興味深いことに、一部の腸内細菌はC-Cグリコシド結合を切断することができ、C-グリコシドを分解するための特異的で環境に優しい生物学的アプローチを提供します。本研究では、天然化合物の生体内変化モデルに基づき、C-Cグリコシド結合を切断する能力を持つ腸内細菌をスクリーニングするための一連の標準作業手順書(SOP)を開発した。SOPには、腸内細菌の調製と濃縮、活性指向のスクリーニング、低炭素源培地での活性検証が含まれます。この方法論は、これらの特殊な機能性細菌の分離と研究を目指す研究者にとって、基本的な参考資料となります。

概要

C-グリコシドは、C-C結合1を介してグリコシル基がアグリコンに直接結合することを特徴とする化合物のグループです。自然界では、オリエンチン、ビテキシン、プエラリン、およびそれらの誘導体は、一般にC-グリコシドとして識別されます2。これらの化合物は、Trollius chinensis3などの薬用植物やStyela plicata4などの動物によく見られます。研究によると、これらの化合物は健康上の利点を提供し、抗菌剤5,6,7、抗炎症剤8,9,10,11,12、抗ウイルス剤3,12,13、抗酸化剤14,15,16、および抗腫瘍活性17.

これらの化合物は、C-C結合を介してグリコシル基が骨格に結合しているため、酸性および酵素加水分解に対して高い安定性と耐性を示し18、吸収性が低く、バイオアベイラビリティが低い19。この制限は、C-グリコシドの開発と利用に影響を与えます。しかし、C-グリコシドを含む薬物は、しばしば経口投与され、特定の酵素によって脱グリコシル化され、より強力な生理活性アグリコンを産生する20,21,22,23。宿主自身の酵素はC-グリコシドを脱グリコシル化することはできませんが、腸内細菌は特定の種類を代謝することが報告されています。例えば、一部の腸内細菌はマンギフェリンをノラチリオールに変換し、これは抗糖尿病薬または抗腫瘍薬としてより大きな効力を示す24。これらの知見にもかかわらず、C-グリコシドを切断できる細菌は限られており、その根底にあるメカニズムはよくわかっていません。これらの細菌を効率的かつ標準化されたスクリーニングすることで、その機能に対する理解が深まり、C-グリコシドの開発が加速します。

スクリーニング方法は、時間をかけて開発され、成熟したシステムへと洗練されてきました。主なアプローチには、濃縮、活性指向のスクリーニング、低炭素源培地での活性検証が含まれます。この方法により、純粋な標的株の単離、標的微生物の種、ゲノムデータ、および形質の同定が容易になります。このシステムを使用すると、C-グリコシドを切断できる腸内細菌を効果的にスクリーニングし、分離することができます。

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プロトコル

実施された実験は、各株に関連する特定のバイオセーフティハザードに適した地域、国内、および国際的なバイオセーフティ封じ込め規制に準拠していました。糞便サンプルは、少なくとも1週間薬を服用していない健康なボランティアから採取されました。使用した試薬および機器の詳細は 、材料表に記載されています。

1. in vitroでのヒト腸内細菌形質転換モデルの構築

  1. 一般嫌気性培地(GAM)の調製25
    1. 溶液Aの調製
      1. トリプトン10.0g、プロテオースペプトン10.0g、大豆ペプトン3.0g、消化血清粉末13.5g、肝臓抽出物粉末1.2g、牛肉抽出物2.2g、酵母抽出物5.0gを500mLの三角フラスコに混ぜ合わせます。
      2. 蒸留水500mLを加え、物質が完全に溶解するまで加熱下で攪拌します。
    2. 溶液Bの調製
      1. 溶液Bは、250 mLの三角フラスコに3.0 gのグルコース、5.0 gの可溶性デンプン、2.5 gのリン酸二カリウム、および3.0 gの塩化ナトリウムを組み合わせることを除いて、溶液Aと同じ手順に従って溶液Bを調製します。.
    3. 溶液Cの調製
      1. 溶液Cは、溶液AおよびBと同じ手順に従って調製しますが、0.3 gのL-システイン塩酸塩と0.3 gのチオグリコール酸ナトリウムを100 mLの三角フラスコに混ぜ合わせます。.
      2. 3つの溶液すべてを1000 mLの三角フラスコで混合し、10%水酸化ナトリウム溶液を使用してpHを7.2に調整し、蒸留水を加えて最終容量1000 mLにします。
      3. 培地を250 mLの三角フラスコに分配し、121°Cで30分間オートクレーブします。室温まで冷まし、4°Cで保存します。
    4. 固体全面嫌気性培地の調製
      1. GAM液体培地に1%〜2%の寒天を加え、完全に溶解するまで加熱します。250 mLの三角フラスコに分配し、121°Cで30分間オートクレーブします。
    5. 低炭素源培地の調製
      1. GAMと同じ手順で低炭素源培地を調製しますが、酵母抽出物、ブドウ糖、可溶性デンプンを省略します。
  2. 混合ヒト腸内細菌叢の調製
    1. 窒素ガスで満たされた使い捨ての滅菌便収集チューブに1〜2gの新鮮な人間の糞便を収集します。チューブは速やかに密封してください。5 mLのGAM培地、シールを加え、滅菌嫌気性インキュベーターで37°Cで24時間培養します。
      注意: 酸素計を使用して嫌気性インキュベーターの酸素レベルを監視し、必要に応じて窒素ガスを交換して嫌気性条件を維持します。
  3. 混合ヒト腸内細菌叢の活性化
    1. 24時間後、0.5 mLのヒト腸内細菌懸濁液を、4.5 mLの新鮮なGAM培地が入った新しい微量遠心チューブに移します。
    2. 密封し、嫌気性条件下で37°Cで24時間インキュベートし、活発な混合ヒト腸内細菌叢を得ます。
  4. 標準溶液の調製
    1. オリエンチンとルテオリンを各5 mgの重量を量り、DMSO1 mLに別々に溶解して、5 mg/mLの濃度でオリエンチンとルテオリンの参照溶液を調製します。
  5. C-グリコシドを切断する能動的腸内細菌叢のスクリーニング
    1. 260 μLの活性腸内フローラを、40 μLのオリエンチン参照溶液を含む6 mLの新鮮な低炭素源培地と混合し、37°Cでインキュベートします。
    2. 対照群(低炭素源培地6 mL、オリエンチン基準液40 μL、生理食塩水260 μL)とブランク群(低炭素源培地6 mL、生理食塩水40 μL、活性腸内細菌叢260 μL)を含めます。
      注:嫌気性インキュベーターですべてのテストを三重に実行します。
  6. 形質転換溶液の前処理
    1. 24時間後および48時間後、反応溶液1mLを1.5mLの微量遠心チューブにピペットで移し、13,400 x g で室温で15分間遠心分離して細菌を除去します。
    2. 上清200μLをメタノール600μLに加え、混合し、13,400 x g で室温15分間遠心分離してタンパク質を除去します。
  7. 形質転換産物の検出
    1. 0.22 μmの微多孔質メンブレンを使用して上清をろ過し、高速液体クロマトグラフィー(HPLC) で ろ液を分析します。C18 カラム(4.6 mm×250 mm、5 μm)を搭載した装置でHPLC分析を行います。
    2. カラムオーブンの温度を 40 °C に維持し、流速は 1 mL/分です。移動相 A にはアセトニトリルを、移動相 B には精製水中の 0.1% ギ酸を使用します。
      注:0〜20分で5%〜55%A、20〜25分で55%〜95%A、25〜30分で95%〜5%A、30〜32分で5%Aの線形勾配システムを採用します。

2. ヒト腸内細菌叢からの単一株の単離

  1. 混合ヒト腸内細菌叢の活性化
    1. ステップ1.3で説明したように、オリエンチンを切断できる混合ヒト腸内細菌叢を活性化して、活性化されたヒト腸内細菌叢溶液を得る。
  2. 固体GAMプレートの調製
    1. 調製した固体GAM培地を加熱して溶解し、嫌気性インキュベーター内の使い捨て滅菌ペトリ皿に注ぎます。媒体を固化させて、固体GAMプレートを調製します。
  3. ヒト腸内細菌叢からの単一株の予備スクリーニング
    1. 活性化細菌溶液100μLを、1 mLの生理食塩水が入った1.5 mLの微量遠心チューブにピペットで移します。
    2. 使い捨ての接種リングを使用して、ペトリ皿に適量の細菌溶液を接種します。皿を密封し、嫌気性インキュベーターでインキュベートします。
  4. コロニー形態の観察
    1. 37°Cで48時間のインキュベーション後、プレート上のコロニーのサイズ、形態、および色を観察します。
  5. 単一株を得るための個々のコロニーの選択
    1. 異なる単一細菌コロニーを選択し、4.5 mLの新鮮なGAM培地を含む10 mLの微量遠心チューブで培養します。嫌気性条件下で37°Cで24時間インキュベートし、単一株を得ます。
  6. 単一ひずみ活動の検証
    1. ステップ1.5、1.6、および1.7で説明されているように、単一株の活性を確認します。高速液体クロマトグラフィー(HPLC)およびプレートマーキング25を用いて活性検証を行う。
  7. ヒト腸内細菌叢からの単一菌株の精製
    1. ステップ2.1の説明に従って、活性な単一菌株を精製します。Orientinを用いた形質転換実験により、手順1.5、1.6、1.7の手順でその活性を確認します。

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結果

10人の健康なボランティアからの糞便サンプルを形質転換実験を使用してスクリーニングした結果、1つのサンプルが脱グリコシル化オリエンチンの活性を示しました。この知見により、活性サンプルのスクリーニングの実現可能性が確認されました。活性サンプルは、プレートマーキング法を使用して単離しました。コロニーの形態と特性に基づいて、黄色または白色、さまざまな形状、および不均一なエッジを持つ約18の単一細菌コロニーを、さらなる分析のために選択しました。これらのうち、オリエンチンをそのアグリコンであるルテオリンに切断する能力を示したコロニーは1つだけでした。コロニーは、前述の方法論に従って、プレートマーキングプロセスを5回繰り返すことによりさらに精製し、純粋な活性株を得ました。高速液体クロマトグラフィー(HPLC)分析を使用して、脱グリコシル化生成物を検出しました。オリエンチンとルテオリンの保持時間は、それぞれ11.5分と16.5分でした(図1)。脱グリコシル化活性を有する純粋な菌株を成功裏に単離し、その形態学的特性が文書化されました(図2

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ディスカッション

C-グリコシドを切断する能力を持つヒト腸内細菌をスクリーニングするための標準操作手順書(SOP)が確立されました。これらの手順を用いて、純粋な活性株を得ることに成功し、形質転換試験によりその脱グリコシル化特性を確認しました。SOPは、腸内細菌の調製と濃縮、活性指向のスクリーニング、および低炭素源培地での活性検証で構成されています。

スクリーニングプロセスの最も重要な側面は、細菌の活動を誘発し、スクリーニングの成功率を高めるために、低炭素源培地を使用することです。形質転換実験中、GAM培地を用いて低活性細菌を同定することは困難であるが、低炭素源培地25ではより容易に検出される。調製および濃縮技術は、非標的株を最小限に抑えながら、標的株を最大化します。スクリーニングプロセスは、活動テストの指導の下で段階的に実施され、成功率を高め、偽陽性率を最小限に抑えます。このSOPは、機能的な細菌を取得しようとする研究者が使用または参照することができます。

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開示事項

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

この研究は、82374134の中国国家自然科学基金会の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アセトニトリルサーモフィッシャーサイエンティフィックF2408R205HPLC
嫌気性インキュベーター上海CIMO医療機器製造有限公司YQX-II
牛肉エキス北京Abxingバイオテクノロジー株式会社01-009BR
消化血清粉末北京Abxingバイオテクノロジー株式会社01-087BR
ジカリウムリン酸水素北京化学工場M26298AR
使い捨て滅菌便収集チューブLang Fu Co., Ltd5 mL
蒸留水北京中医薬
DMSOSigma-Aldrich CorporationWXBD2861VAR
EP チューブBeijing Biodee Biotechnology Co.,10 mL/1.5 mL
Eppendorf 遠心分離機Eppendorf AG5418
GlucoseBeijing Chemical WorksGC205003AR
High Performance Liquid Chromatograph島津製作所LC-20
高圧蒸気滅菌器山陽電機上海有限公司MLS-3780
Innoval C18 クロマトグラフィーカラムAgela Technologies Co., Ltd4.6 mm × 250 mm, 5 µm
L-システイン 塩酸塩Beijing Abxing Biotechnology Co., LtdBGASY01BR
Liver Extract PowderBeijing Abxing Biotechnology Co., Ltd01-085BR
LuteolinNational Institutes for Food and Drug Control>98%
マグネティックスターラーIka Werke Co., LtdRCT basic
MethanolThermo Fisher科学20240901312AR
ミリポアフィルターメンブレンSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.0.22 以上L&タイムズ;50 mm
OrientinYishiming (Beijing) Biotechnology Co., Ltd19120601>98%
PeptoneBeijing Abxing Biotechnology Co., Ltd1685787BR
ペトリ皿Beijing Biodee Biotechnology Co., Ltd150 mm
塩化ナトリウムBeijing Abxing Biotechnology Co., LtdBN20008AR
チオグリコール酸ナトリウム上海江来バイオテクノロジー株式会社J031S219019AR
可溶性デンプン北京Abxingバイオテクノロジー株式会社S9765BR
大豆ペプトン北京Abxingバイオテクノロジー株式会社2147955BR
トリプトンアゲラテクノロジーズ株式会社1685787BR
超音波洗浄機昆山超音波機器有限公司KQ-500DE
酵母エキスBeijing Abxing Biotechnology Co., Ltd01-014BR
大学バイオ医薬品部門 Ltd

参考文献

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