方法論記事

浸透圧制御による Bursaphelenchus xylophilus の第3段階分散幼体のクリプトビオシスへの侵入誘導

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DOI：

10.3791/67350

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2024年12月27日

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11State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Institute of Ecological Conservation and Restoration, Chinese Academy of Forestry, 2Comprehensive Experimental Center in Yellow River Delta of Chinese Academy of Forestry, 3Tianjin Institute of Forestry Science, Chinese Academy of Forestry, 4Ningbo Yongsen Biotechnology Co. Ltd, 5Xiangshan Natural Resources and Planning Bureau of Zhejiang

この記事について

サマリー

本プロトコルは、塩化カリウム(KCl)イオンの浸透圧調節を通じて、Bursaphelenchus xylophilusの第3段階の幼体(プレダウアー幼体、JIII.)の分散をクリプトビオシスに誘導する方法を説明しています。この手法は、キシロフィルス菌の耐応力機構の研究を技術支援することができます。

要約

クリプトビオーシスは、生物が極度の環境ストレス下で体内の水分をほぼすべて失い、無水症に陥る状態です。Bursaphelenchus xylophilusの分散第3段階の幼体(プレダウアー幼体、figure-abstract-1)は、脱水によってクリプトバイオシスに侵入し、環境条件が改善すると水分補給によって復活します。浸透圧の調節は、このプロセスで彼らが生き残るために重要です。本研究では、中国浙江省寧波市の松枯れ病により死んだPinus massonianaからfigure-abstract-2 B. xylophilusの標本を採取した。8% 塩化カリウム (KCl) 溶液に浸漬した後、figure-abstract-3 B. xylophilus は、天然の水の蒸発による外部浸透圧の上昇により徐々に脱水した後、クリプトバイオティクス状態になりました。figure-abstract-4 B. xylophilus は -20 °C の低温ストレスに耐え、figure-abstract-5 B. xylophilus は水分補給後に復活し、生存率は 92.1% でした。このプロセスにより、figure-abstract-6 B. xylophilus のクリプトビオシスへの侵入を調節し、極限環境に耐えることができます。私たちの研究で説明されているこの方法はシンプルで信頼性が高く、B.キシロフィルスのストレス耐性メカニズムを研究するための技術サポートを提供します。

概要

マツ萎凋病は、中国で最も深刻な森林病の1つです1。マツノザイセンチュウ Bursaphelenchus xylophilus (B.xylophilus)は、宿主内で繁殖することにより、 Pinus massoniana (P.massoniana)などのマツ種に重大な脅威をもたらし、急速な萎凋病と死に至ります。宿主の死後、不利な環境条件下では、 B. xylophilus の生殖幼体はダウアー前の幼体(figure-introduction-1)に侵入する可能性があります。これらの幼体は、昆虫媒介生物が移動と拡散を続けるために探し、広範囲にわたる松林の死滅を引き起こします2。

クリプトビオーシスは、生物が極度の環境ストレス下でほぼ全ての体内水分を失い、無水症に陥る状態である3。この過程で、生物は徐々に脱水状態になり、その結果、運動が停止し、代謝が低下し、ライフサイクルが停止します4。適切な条件下では、水分補給で回復することができます。クリプトビオーシスは、生物が低温などの極端な環境に抵抗し、寿命を延ばすことを可能にします5。30,000年間クリプトビオシスで生き残った線虫は、南極の永久凍土6で発見されました。

これまでの研究では、線虫は脱水中に表面透過性を調整することで、低温、干ばつ、高浸透圧などのさまざまな非生物的ストレッサーに適応できることが示されている7。さらに、線虫は体を丸めて表面積を減らし、水分損失率を最小限に抑えることができます。例えば、 線虫(Caenorhabditis elegans) は浸透圧バランスを調節し、イオンや小分子がキューティクルを自由に通過できるようにしているが、大きな分子は通過できない8。 figure-introduction-2 B. xylophilus もクリプトビオシスを示します。クリプトビオシスの脱水および再水和の段階では、クチクラ全体の物質交換を制御するために浸透圧調節が不可欠であり、クリプトビオシス9への侵入または回復にとって極めて重要です。

本研究では、figure-introduction-3 B. xylophilusのクリプトビオシスを浸透圧制御により誘導する方法を紹介する。この方法は、簡便で効率的、かつ信頼性が高く、キシロフィルス菌のストレス耐性メカニズムの研究figure-introduction-4技術サポートを提供しています。

プロトコル

1. figure-protocol-1 B. xylophilus の収集

  1. P. massonianaの感染した椎間板のコレクション
    注:すべての手続きは、松萎凋病流行地域および感染した木材の行政措置およびその他の適用される規制に準拠していました。浙江省寧波市象山県でB. xylophilusに感染したP. massonianaの森林をサンプルサイトとして選択しました。マツ萎凋病で死亡したP.massonianaは、サンプルサイト内で伐採されました。
    1. 伐採した樹木の主幹の上部、中央部、下部から丸太(厚さ5cm)を採取します。
    2. 集めた 丸太 P. massoniana を0.5〜1 cmの厚さに切り、次に長さ2〜3 cmの小さなストリップに切ります。
    3. 小さな木片を密封された袋に入れ、実験室に保管してさらに使用します。
  2. figure-protocol-2 B. xylophilus の抽出
    1. 直径約15cmのロングネックガラス漏斗の狭い方の端にゴムチューブを取り付けます。ゴムチューブをピンチコックで固定します。組み立てた漏斗を漏斗スタンドに置きます。
    2. 小さな木片をティッシュペーパーの単層で完全に包み、漏斗に入れます。すべての木片が水没するまで、漏斗に蒸留水を追加します。
      注:12〜24時間放置した後、線虫は木片から移動し、漏斗10の底部に定着した。ティッシュペーパーは、線虫が通過するのを防ぎながら、木の破片が沈殿するのを防ぎました。
    3. 漏斗の底にあるピンチコックをゆっくりと離し、2000〜5000μLの混合物をペトリ皿(直径5 cm)に漏らして、顕微鏡検査と形態学的同定を行います。
    4. スタイレット、食道球状中央部、脂肪滴、および「指のような」尾の形状11などの特徴を観察することにより、B.キシロフィルスfigure-protocol-3を特定します。
    5. 顕微鏡下で、10μLのピペットを使用して10μLの液体と1つの線虫を吸引することにより、個々のfigure-protocol-4B.xylophilusをスライドに移します。このプロセスを30回繰り返して、線虫を含む混合物を約300μL収集します。
    6. figure-protocol-5 B. xylophilusを抽出した後、残りの木片と感染した木材を滅菌して、さらなる汚染を防ぎます。

2. 浸透圧制御プロセス制御

  1. 浸透圧調節混合物の調製
    1. 8%KCl水溶液を調製します。
    2. ピペットを使用して、figure-protocol-6 B. xylophilusの混合物を含むスライドに8%KCl水溶液10μLを加え、線虫とKCl溶液の混合物を約310μL得る。
  2. figure-protocol-7 B. xylophilusの浸透圧上昇と脱水の調節
    1. スライドを顕微鏡ステージに置き、水が自然に蒸発するのを待ちます。それは周囲の環境の浸透圧を徐々に増加させ、線虫を約30〜60分かけて脱水させます。
      注:オペレーターは、KCL結晶が沈殿し、顕微鏡で線虫の状態を観察するまで、水が自然に蒸発するのを待つだけで済みます。KCL結晶が沈殿するまで、混合物の310μLが自然に蒸発するのに約30〜60分かかります。
    2. 顕微鏡下でfigure-protocol-8 B. xylophilusの脱水プロセス(例:体のカール、凝集など)を観察します。水が完全に蒸発し、KCl結晶が沈殿すると、figure-protocol-9 B. xylophilusは動きを止めてクリプトビオシスに入ります。
  3. クリプトバイオティクスfigure-protocol-10B. xylophilusの低温ストレス治療
    1. クリプトビオティックfigure-protocol-11B.キシロフィルスを-20°Cの一定温度環境に24時間置きます。
  4. figure-protocol-12 B. xylophilusの浸透圧低下と水分補給の調節
    1. ピペットによる低温処理を受けた稚魚の周囲に約300μLの蒸留水を加えます。約30〜60分間続く水分補給プロセスは、周囲の環境の浸透圧を徐々に低下させます。
    2. キシロフィルス菌figure-protocol-13の水分補給過程(例:体のストレッチ、運動の再開など)を顕微鏡で観察します。24時間後の生存率を計算します。

結果

8%KCl溶液では、水が蒸発するにつれて、figure-results-1 B. xylophilusは最初に運動性を維持しながら顕著な「カール」を示しました(図1A)。水が完全に蒸発すると、線虫は動きを止めて丸まり、表面がくぼんで脂肪滴が蓄積し(図1B)、クリプトバイオティック状態に入ったことを示しています。周囲の環境に蒸留水を加えると、線虫は再水和して復活しました(図1C)。水が蒸発すると、KCL結晶が現れます(図1D)。図1Eは、figure-results-2 B. xylophilusの形態学的特徴を示しています。

脱水実験により、最初の8%KCl溶液では、水の蒸発によりfigure-results-3B.キシロフィルスが水分を失うことが実証されました。脱水後、figure-results-4 B. xylophilus を -20°C の低温ストレスに 24 時間さらし、平均生存率は 92.1% であった 11。クリプトバイオティクス状態に入らなかった対照群の生存率が0%であったのに対し、上記のデータは、脱水が低温条件下でのfigure-results-5 B. xylophilusの生存率を有意に向上させる可能性があることを示唆しています。

figure-results-6 B. xylophilusのクリプトビオシス後の再水和段階では、線虫の100%が40%KCl溶液から蒸留水に移すときにin vivoで「気泡」を示すことが観察されました(図2)。

figure-results-7
図1:figure-results-8 B. xylophilusの脱水-クリプトビオシス-再水和プロセス。この画像は、(A)脱水段階、(B)クリプトバイオシス段階、(C)再水和段階、(D)KCL結晶化段階、(E)figure-results-9B.キシロフィルスを含む、figure-results-10 B.キシロフィルスのクリプトバイオシスプロセスを示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-11
図2:蘇生していないfigure-results-12B.xylophilusにおける脂肪顆粒の蓄積。この画像は、figure-results-13 B. xylophilus の再水和後の状態を示しており、in vivo の泡状の脂肪顆粒の存在が特徴です。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

本研究では、浙江省寧波市で死んだP. massonianaからfigure-discussion-1 B. xylophilusを採取した。B. xylophilusfigure-discussion-2、異なるインスターを持つ混合集団から選択されたことに注意する必要があります。具体的には、B. xylophilusの密度が高い丸丸太を選択し、続いてfigure-discussion-3 B. xylophilusのスクリーニングを行いました。遼寧省の日最低気温が-20°C前後の冬季には、死んだPinus tabuliformisから多数のシングルインスターfigure-discussion-4 B. xylophilusが得られるため、この実験では選択プロセスが簡素化されました12。

クリプトビオティックの過程で、線虫のゆっくりとした脱水速度は、彼らの生存に利益をもたらし、タンパク質への構造的損傷を防ぐ13。脱水時間は、figure-discussion-5 B. xylophilus の生存率を決定する上で重要です。本研究では、初期濃度8%のKCl溶液を使用し、その濃度を水の自然蒸発とともに徐々に増加させ、figure-discussion-6 B. xylophilusがゆっくりと脱水してクリプトバイオシスに入ることを可能にしました。水の蒸発が速すぎたり、線虫が高濃度のKCl溶液に直接入れられたりすると、その生存率は大幅に低下します。

この研究で説明した方法には、いくつかの利点があります。実験材料は簡単に入手でき、KCl溶液と蒸留水のみで、figure-discussion-7 B. xylophilusの脱水と再水和を調節できます。脱水は自然蒸発によって起こり、再水和は蒸留水を加えることによって達成されました。すべてのプロセスは2時間以内に完了することができます。この方法は高い成功率と生存率を誇り、B. xylophilusfigure-discussion-8ほとんどが脱水後にクリプトビオシスに入り、大多数は再水和後に復活します11。

提案された方法は、B. xylophilusfigure-discussion-9および第4段階の分散幼体(figure-discussion-10)の両方のクリプトバイオティック状態を制御するために適用できます14。ただし、繁殖するキシロフィルス菌には効果がない場合があります。

近年、B. xylophilusによるマツ萎凋病は、中国南部から北部地域に拡大しています。これらの寒冷な北部地域の松の木に生息するfigure-discussion-11 B. xylophilus は、より大きな耐寒性を示す傾向があります15。提案された方法は、figure-discussion-12B.キシロフィルスにクリプトビオシスを誘導し、寒さや干ばつに対する抵抗性を高めることができます。全体として、この方法は、B. xylophilusのストレス耐性メカニズムとマツ萎凋病の伝染メカニズムを研究するための技術サポートを提供できます。

開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

本研究は、中央公益科学機関国家樹木遺伝育種研究研究所基礎研究基金(CAFYBB2020ZY001-2)、企業研究プロジェクト(202404016-4320)、中国国家自然科学基金会(NSFC 32271896)の助成を受けて行われました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
スライドガラスバイオランドGS7101-752575 mm & 回;25 mm & 回;1ミリメートル
首の長いガラス漏斗南京康羅達実験技術該当なし150ミリメートル
顕微鏡フェニックスXSP-35-1600XPH100-2B41L-IPL型
ペトリ皿南京康羅達実験技術 TB-62493579274550 mm & 回;50ミリメートル
ピンチコック南京康羅達実験技術 TB-62497331174336 mm & 回;11ミリメートル &時間;55ミリメートル
ピペットエッペンドルフ312300001210–100 & マイクロ;L
塩化カリウム(KCL)ソーラーバイオライフサイエンスP9921500グラム
ゴムチューブ南京康羅達実験技術TB-6249234570947 mm & 回;5ミリメートル
滅菌 器ビンジャン https://detail.1688.com/offer/644766597053.html?_t=1730892390541&spm=
a2615.7691456.co_0_0_wangpu
_score_0_0_0_0_1_0_0000_0.0		75L
ティッシュペーパー ハート・トゥ・ハート・インプリントM322.5cm&回;21.5センチ

参考文献

  1. Li, Y., Zhang, X. Analysis on the trend of invasion and expansion of Bursaphelenchus xylophilus. Forest Pest and Disease. 37 (5), 1-4 (2018).
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