ヒト血小板における組織因子発現のフローサイトメトリー解析

サマリー

本記事では、全血型サイトメトリーを用いて組織因子(TF)陽性血小板の割合を定量化するプロトコルを概説し、タンパク質の評価を行います。(1) 安静状態における細胞内、(2) 安静時および活性化状態の両方で細胞表面上。また、血小板豊富な血漿中のTF陽性血小板の評価に関する指導も提供されています。

要約

循環中のヒト血小板の一部は、血液凝固カスケードと血栓形成の主要な活性化因子である組織因子(TF)を細胞内に蓄えています。血小板活性化後、TFは細胞膜に曝露され、FVIIに結合して最終的にトロンビン生成につながります。(1) TF陽性血小板のレベルは様々な臨床環境で増加し、患者の前血栓表現型に寄与していること、(2) 異なる薬剤が血小板関連TF発現を調節できることを考慮すると、過去に評価が議論の的となったTF陽性血小板の標準化された評価法は価値があります。ここでは、全血および血小板富血漿(PRP)/洗浄血小板におけるフローサイトメトリーを用いてTF陽性血小板の割合を測定するプロトコルを概説します。本プロトコルは、(1)安静状態における細胞内および(2)安静時および活性化時の両方で細胞表面上のタンパク質を評価することで、TF陽性血小板の割合を定量化するための詳細な指示を提供することを目的としています。第1節では、事前分析手順が結果に影響を与えないように、正しく採血を行うための重要な情報を提供します。次に、フローサイトメトリー解析のためのサンプル準備および標識手順に焦点を当てています。細胞刺激、標識、固定、必要に応じて透過化の詳細な手順が示されています。最後に、血小板集団を正しく同定し、TF陽性イベントを解析するためのフローサイトメトリー設定の手順が記載されます。最後に、この方法は、単離血小板でTF陽性血小板を測定する場合にPRPを調製する手順を含みます。TFを含む血小板の一部に過ぎないため、PRPを得るための遠心分離過程でこれらの血小板が失われないようにすることが重要です。

概要

組織因子(TF)は、血液凝固カスケードの重要な活性化因子であり膜貫通糖タンパク質であり、循環中のヒト血小板1、^{特にサイズが}大きいもの2によって発現します。アデノシンジリン酸(ADP)やトロンビンなどの古典的な血小板作動薬によって活性化されると、血小板は表面に機能活性TFを濃度依存的に露出させ、それが第VII/VIIa因子に結合し、最終的に1,3,4,5,6の生成につながります。特に、冠動脈疾患(CAD)⁷、重症急性呼吸器症候群-コロナウイルス-2(SARS-CoV-2)^感染8、卵胞孔に伴う前兆付き片頭痛(MHA-PFO)⁹、がん¹⁰、敗血症¹¹などの病理的状態では、TF陽性血小板の数が有意に増加し、これらの臨床現場で観察される血栓リスクの増加に寄与しています。

この説得力のある証拠にもかかわらず、TF陽性血小板の検出は^科学界で依然として議論の的^{となっています。}事前分析変数、サンプル調製、抗体特異性などの方法論的課題が、文献で報告された矛盾した結果の原因として示唆^{されています。}したがって、ヒト血小板におけるTF測定のための明確に定義されたプロトコルに基づく標準化されたアッセイを確立することが極めて重要です。

この文脈では、全血フローサイトメトリーが、最小限のサンプル処理でTF陽性血小板の解析が可能であり、この血小板サブセットの損失を防ぐために極めて重要です。

本稿では、全血型細胞法を用いて血小板関連TFを測定するプロトコルを提案します。これは、(1)安静状態における細胞内および(2)安静時および活性化状態の両方で細胞表面上のタンパク質を評価します。また、血小板富血漿(PRP)中のTF陽性血小板の評価が必要な場合も説明書が提供されています。

プロトコル

プロトコルは機関の倫理委員会(第70/24号、CE 18.06.24)によって承認され、すべての献血者から書面によるインフォームド・コンセントが取得されました。プロトコルはユーザーを7つの主要なステップ(図1)に導きます。最初のステップは血液採取の手順についてです。ステップ2および3では、抗体滴定プロトコルおよびフィコエリスリン(PE)標識されたαCD142/HTF1モノクローナル抗体(mAb)を用いた細胞内TF発現解析のためのサンプル準備について概説しています。ステップ4では、αCD142/HTF1 mAbを用いた間接染色法を用いて血小板表面に曝露されたタンパク質を評価するプロトコルを説明しています。フルオロクロームの立体阻碍のため、細胞内染色に用いられるPE標識mAbは表面曝露タンパク質の触媒ドメインに結合しません。したがって、Alexa Fluor 633標識セカンダリmAbを用いた間接染色のプロトコルが提案されています。ステップ5および6ではフローサイトメトリー解析の各段階を詳細に説明します。最終段階では、大血小板サブポピュレーションの喪失を防ぐために、血小板リッチ血漿(PRP)の準備手順が概説されています。使用された試薬および装置の詳細は 材料表に記載されています。

1. 血液離脱

注意:ヒト血液採取は倫理委員会の承認を得た後にのみ実施してください。

1. 末梢静脈注入の影響を受けていない腕、できれば肘前静脈から末梢静脈または針カニューレ採取による血液サンプルを採取してください。
   1. 末梢静脈採取では、止血帯を装着し、G19バタフライ針を静脈に挿入した後、血小板の活性化を防ぐために止血帯を除去します(図2)。
      注意:血小板活性化を避けるために、G21より小さいバタフライ針は使用しないでください。
   2. 針カニューレによる静脈採血では、採血中に止血帯を一切装着しないでください。必要に応じて、採取前に0.9%の生理食塩水でサンプルを洗浄してください。チューブに血液を入れ始める前に、最初の5mLの血液は必ず捨ててください。
2. 血液2mLをEDTAバキューテイン(血球数測定用)に抽出します。血液と抗凝固剤が完全に混ざるようにチューブを3回優しく混ぜます。
3. 血小板関連脂肪酸発現の解析のために、0.129 Mシトウム酸ナトリウム真空中に血液を採取します。適切な血液・抗凝固剤比率を維持するために、指定された濃度まで慎重に真空を充填してください。血液と抗凝固剤がしっかり混ざるようにチューブを5回優しく反転させ、血栓形成や溶血を防ぎます。
   注:0.129 Mシトレート抗凝固剤の使用は、αCD142 mAbのHTF1クローンを用いた血小板関連TF検出を最適化するために推奨されます。全血から血小板を分離する必要がある場合は、2つ目の0.129 Mシトウムシトレートバキュテーナーを採取し、血小板豊富血漿(PRP)を製造します。
4. 真空装置はチューブホルダーで直立して保ちましょう。回転板や傾斜板の上で揺らさず、空気圧輸送システムも避けてください。血小板の活性化を防ぐために血液サンプルは冷蔵しないでください。
   注意:TFとともに他の顆粒関連血小板活性化マーカーを測定する場合は、血液サンプルは離骨後15分以内に処理するのが望ましいです。それ以外の場合は、採取から3時間以内にサンプルを処理する必要があります(図3)。

2. 抗TF抗体の滴定(細胞内TF評価用)

注:細胞内に蓄積されたTFの決定はPE-αCD142/HTF1 mAbを用いて行われます。

1. ビーズを用いた抗体滴定
   注:ビーズを使用することで、適切な抗体量(すなわち、陽性と陰性のサンプル間で最も大きな蛍光ピークの分離を生み出す抗体濃度)を定義できます。この分析は、1つは真の陽性と1つの完全に陰性の2つのサンプルを用いて行われます。抗体濃度は製造元から報告されず( 材料表参照)、抗体滴定は5つの希釈点を用いて行われます。
   1. 抗体を17,000 x g で4°Cで5分間遠心分離します。5つの抗体希釈点を準備するために、40μLの抗体をチューブ1に、PBSを20μLのチューブ2から5にピペットします。チューブ1からチューブ2へ20μLを移し、その後さらに4回連続で1:2の希釈を行います。
   2. 抗体の量ごとに試験管を1本用意して検査します。各試験管に陰性ビーズ1滴と陽性ビーズ1滴を加えます。各抗体希釈液を20μL試管に加え、すぐに渦巻きます。暗闇で室温の20分間孵化させます。
   3. 各チューブにCa⁺⁺ およびMg⁺⁺を含まない1xPBS(pH7.4)を1mL加え、渦巻きます。
   4. 製造元の指示に従ってフローサイトメーターでサンプルを取得し、「ビーズ」ゲートに1万件のデータファイルを記録します。最適な抗体濃度とは、陽性と陰性のピークを最も大きく分けられる濃度です。
2. 血小板に対する抗体滴定
   注意:原則として、ビーズを用いて特定される最適な抗体濃度は、染色対象の細胞、つまり全血中の血小板で確認されるべきです。
   1. 固定
      1. ナトリウムクエン酸塩バキュテーナーを優しく5回逆さにして、血液と抗凝固剤を十分に混ぜます。50μLの血液を1.5mLのチューブに移し、1%パラホルマルデヒド(PFA)を950μL加え、優しく混ぜて室温で90分間培養します。
      2. 試料を1,500 x g で5分間、ブレーキ付きで室温で遠心分離します。
      3. 上澄液を取り除き、Ca⁺⁺ およびMg⁺⁺ なしの1x PBSを1mL、pH7.4で優しくピペットしてペレットを再懸浮させます。
   2. 透過化
      1. 検査対象の抗体体積ごとに1本のチューブを用意し(ビーズ滴定で特定された体積と、希釈量の高低(例:5 μLなら10 μL、5 μL、2.5 μL)、蛍光マイナス1(FMO)コントロール用に1本のチューブを用意します。
      2. 各チューブに100μLの固定血を注ぎ、室温でブレーキをかけて5分間遠心分離します。
      3. 上澄液を除去し、ペレットを0.1%トリトンPBS100μLに再懸濁してサンプルを透過させ、室温で10分間培養します。
   3. 染色
      1. 抗体を17,000 x g で4°Cで5分間遠心分離します。2.2.2.1で定められた必要な抗体体積を各試験管に加え、混合します。
      2. サンプルを暗闇で室温で15分間キュベートします。
      3. 各チューブにCa⁺⁺ およびMg⁺⁺なしの1xPBSを300μL加え、pH7.4を加えて混合します。フローサイトメーターでサンプルを取得します(ステップ5参照)。
      4. 以下の式¹⁵に従って染料指数を計算します:
                                
         ここで、MFI_pos は正の事象の平均蛍光強度、MFI_の負 のもの、SDは負の母集団の標準偏差です。
      5. 最も低い抗体濃度で、最も染色指数が高いものを選びましょう。
         注:現在の実験条件下では、PE-αCD142/HTF1 mAbの最高染色指数は5μL抗体を用いて達成されます。

3. 細胞内TF発現のフローサイトメトリー解析のためのサンプル準備

1. 全血固定と透過化
   1. 細胞内TF分析では、ステップ2で示された手順に従って全血を固定し、透過します。
2. 染色手順
   注:以下のプロトコルでは、血小板集団をαCD61-PerCP染色を用いて同定します。他の人口マーカーは運用者の裁量で使用可能です。
   1. 蛍光マイナス1(FMO)制御用に1本のチューブと、TF染色用の1本のチューブを準備します。各チューブに100μLの固定および透過性のある全血を、 表1に記載した抗体と共に追加します。
   2. サンプルを暗闇で室温で15分間キュベートします。
   3. 各チューブにCa⁺⁺ およびMg⁺⁺なしの1xPBSを300μL加え、pH7.4を加えて混合します。染色サンプルはフローサイトメトリー解析(ステップ5参照)まで暗闇で保管してください。
      注:補償行列を計算するには、表2に記載されているサンプルを準備してください。

4. 安静時および活性化血小板における細胞表面関連TF発現のフローサイトメトリー解析のためのサンプル準備

注:細胞表面関連のTF検出には、シグナル検出のための二次抗体として標識されていないαCD142/HTF1 mAb(1 mg/mL)およびAlexa Fluor 633ヤギ抗マウス用IgG(2 mg/ml)を使用します。アデノシン5'-二リン酸(ADP)は細胞表面でのTF曝露を誘導するために血小板作動薬として用いられます。PE標識抗体は血小板集団マーカーとして用いられ、シグナル補償によって検査されます。

1. TF染色
   1. Ca⁺⁺ およびMg⁺⁺を含まず、pH7.4の1xPBSにαCD142/HTF1 mAb 1:100を希釈し、作動濃度10 μg/mLを得る。Alexa Fluor 633ヤギ抗マウス用IgG 1:10をCa⁺⁺ およびMg⁺⁺なしの1x PBSに希釈し、pH 7.4で200 μg/mLの作業濃度を得ます。
   2. 3本のサンプルチューブを準備し、表3に示されたようにCa⁺⁺およびMg⁺⁺を含まないPBSを1個、pH7.4で配布します。
   3. 希釈したαCD142/HTF1 mAbを7.5 μL、ADPを5 μL(200 μM)加えて、最終濃度10 μM ADPを得ます。クエン酸塩バキュテーナーを優しく5回逆さにして血液と抗凝固剤を十分に混ぜ、各チューブに5μLの全血を注ぎます。サンプルを優しく混ぜます。
   4. サンプルを室温で20分間培養します。
2. サンプル固定
   1. 各サンプルに1%パラホルムアルデヒド(PFA)を300μL加え、室温で1時間培養します。
      注:1%のPFAで固定され、4°Cで保存された標識サンプルは最大4日間安定します。
   2. 各チューブにCa⁺⁺ およびMg⁺⁺なしの1xPBSを300μL、pH7.4を加え、遠心分離機で1500 x gで室温でブレーキをかけて5分間投与します。
   3. 上澄液を取り出し、Ca⁺⁺ およびMg⁺⁺を含まずpH7.4の1x PBSを95μLで優しくピペットで再懸浮させます。
3. 二次抗体による染色
   1. 希釈したAlexa Fluor 633 IgGを5μL投与し、常温の暗闇で15分間培養します。
   2. 各チューブにCa⁺⁺ およびMg⁺⁺なしの1xPBSを300μL、pH7.4を加え、遠心分離機で1500 x gで室温でブレーキをかけて5分間投与します。上清液を除去し、Ca⁺⁺ およびMg⁺⁺を含まない1xPBSを95μLで再懸濁し、pH7.4に浸します。
   3. 各チューブに5μLのαCD41-PEを投与します(表 4参照)。サンプルを暗闇で室温で15分間キュベートします。
   4. 各チューブにCa⁺⁺ およびMg⁺⁺なしの1xPBSを300μL加え、pH7.4を加えて混合します。
   5. 染色されたサンプルは、フローサイトメトリー解析(ステップ6参照)まで暗闇で保管してください。
      注:補償行列を計算するには、ステップ4.1-4.3および 表5 および 表6に従って試料を準備してください。

5. 細胞内TF発現のフローサイトメトリー解析

注:以下の手順は参照フローサイトメーターでの取得に関するものです。したがって、報告された設定やプロットは代表的と考えられるべきです。このプロトコルは、高感度の新世代フローサイトメーターに適用可能です。レーザーの安定性を確保するために、サンプル採取のかなり前にフローサイトメーターを起動してください。血小板が小さいため、流体およびフローセルを徹底的に洗浄してください。細胞の破片は前方散乱領域/側散乱領域(FSC-A/SSC-A)ドットプロットの血小板集団の可視化を妨げる可能性があります。メーカーの指示に従ってQCビーズで品質管理を行い、残留ビーズを除去するために再度洗浄してください。

1. 取得セットアップ
   1. すべてのイベント(図4A)をログスケールでFSC-A/SSC-Aドットプロットを作成します。すべてのイベント(図4B)を表示する対数スケールでCD61-A/SSC-Aドットプロットを作成します。
   2. PE(Y-585)とPerCP(B690)のゲインは日々の品質管理に応じて調整してください。血小板の分布を可視化するために、SSC-Hで約2000、PerCP(B690-H)で閾値を1000に設定します。流量を LOWに設定してください。
   3. 血小板集団を特定するために、10³から10⁵ の範囲に「CD61⁺」と呼ばれる領域を描きます。
   4. 単一染色制御を取得して補償行列を計算し、その後サンプルを取得します。「CD61⁺」ゲート内に10,000件のイベントを記録する(図4D,E)。サンプル採取開始から5〜10秒後に録音を始めてください。

6. 表面TF発現のフローサイトメトリー解析

1. すべてのイベントを表示する対数スケールにFSC-A/SSC-Aドットプロットを作成し、すべてのイベントを表示するCD41-A/SSC-Aドットプロットを作成します(図5B)。
2. Alexa Fluor 633のゲインとPE(Y-585)ゲインを日々の品質管理に従って調整し、SSC-Hで約1000、PE(Y585-H)で2500に閾値を設定して、 図5Bに示すように血小板の人口を可視化します。流量を LOWに設定してください。
3. 血小板集団を特定するために、10⁴ から10⁵ の間に「CD41⁺」と呼ばれる領域を描きます。
4. 単一染色制御を取得して補償行列を計算し、その後サンプルを取得します。「CD41⁺」ゲート内に10,000件のイベントを記録する(図5D,E)。サンプル採取開始から5〜10秒後に録音を始めてください。

7. 血小板豊富な血漿中のTF陽性血小板の解析

1. 血小板リッチ血漿(PRP)製剤
   注意:細胞活性化を防ぐために血小板単離は室温で行う必要があります。試薬および器具の温度を18°Cから22°Cの間に保ちましょう。手順中はピペッティングや激しい振る舞いを避けてください。
   1. 0.129Mのクエン酸ナトリウムバキュテーナーを優しく5回混ぜ、血小板数を血液細胞計数器で2回測定して回収した血小板の割合を計算します。
      注意:2つの測定の平均値を血小板濃度として用いてください。
   2. 0.129 Mのクエン酸ナトリウム真空装置を100 x g で、室温でブレーキなしで10分間遠心分離します(図6)。得られたPRPを採取し、10mLのポリプロピレンチューブに移し、採取した体積を記録します。
      注意:血小板の活性化を防ぐために、ポリスチレンチューブの使用は避けてください。
   3. 血小板を血球計数器で2回数え、血小板回復率を以下の通り計算します。
      
      注意:回復率が65%未満の場合、血小板の総数は全血中のそれを完全には代表していません。準備をやめることを検討してください。
2. PRPにおける細胞内および表面関連TF発現のフローサイトメトリー解析のためのサンプル準備
   1. PRPにおける細胞内および表面関連TF発現を解析するには、全血分析に記載されたのと同じプロトコル(ステップ3-6参照)を用います。

結果

血小板関連TF発現解析の概要は 図1のフローダイアグラムに示されています。手順には以下が含まれます:(1) 採血:G19バタフライニードルまたは止血帯なしの針カニューレを用いて、できれば肘前静脈から血液を採取します。(2) サンプル処理:実施されるTF評価の種類に従ってサンプルを処理します。(3) サンプルラベリング:特定の抗体で標識を付けます。(4) フローサイトメトリー解析:サンプルを解析して表面および細胞内TFを検出します。

血液を抽出する際は、血小板の活性化を避けるために特に注意が必要です。このため、2つの予防策が守られます。針を静脈に刺した直後に止血帯を外すことと、最初に抽出した真空器で血液を捨てることです。止血帯を使わない場合、FSC-A/SSC-Aドットプロットに示された血小板集団は図2Aに示される典型的な形状を呈します。逆に、止血帯を使用すると、血小板集団の物理的特性により、ADPなどの古典的な血小板作動薬による刺激後に観察される形態に似た細長い形状が現れます(図2B,C)。

血小板関連TF発現の時間経過による安定性を評価する実験では、採血後3時間は安定していることが示されました(図3)。TF発現の測定とP-セレクチンなどの血小板活性化マーカーの測定を組み合わせる場合、血小板脱顆粒を避けるためにできるだけ早く血液サンプルを処理することが推奨されます。

細胞内に保存されたTFの解析では、全血を1%PFAで固定し、PBS-Tritonで透過させた後、PE標識抗体で染色します。血小板集団は対数のFSC-A/SSC-Aプロット(図4 A,D)およびαCD61 mAb染色(図4 B,E)で同定されます。健康な被験者における細胞内TFの解析結果(n = 377)では、循環血小板の26.8%±4.8%の範囲内でTFが存在していることが示されました(図4F)。

表面関連TF発現のフローサイトメトリー解析は、安静状態およびADP 10 μMによる細胞刺激後に実施されています。αCD41 mAbで標識された全血小板集団は、対数のFSC-A/SSC-Aプロット(図5A,B)で同定されています。結果は、健康な被験者(n = 377)において、TFは安静血小板の2.8%±1.4%で発現し(図5D-F)、活性化時に最大24.5%±5.8%まで増加していることを示しました(図5G-I)。TFは最大サイズの血小板部分集合(図5D、G、緑の点)で表されます。さらに、画像フローサイトメトリーによる解析により、TFシグナルはαCD61陽性のみと関連し、αCD45陽性イベントとは関連しないことが示されています(図7)。

前述の通り、TFは集団全体で最も大きなサイズを持つ血小板のサブセットに蓄積されています。したがって、PRP製剤中にこの血小板分率を失わないことが重要です。方法セクション(ステップ7)で示された適応に従い、PRP内で全血中の血小板集団を単離することが可能です。図6に示すように、100 x g全血遠心分離によって得られた血小板集団のフローサイトメトリードットプロットは、FSC分布の観点から全血と非常に類似しています(図6 A,B)。対照的に、文献12,14,16でよく報告されているように、より高い力と長い遠心分離時間を用いると、回収された血小板集団は全血に比べてFSCが低く(図6C)、つまりTF陽性の大血小板の損失を示唆しています。

図1:血小板関連TF発現解析および血小板単離の概略図。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:全血流量サイトメトリーで解析された血小板集団の代表的な密度プロット。 (A) 止血帯なしで採取した血液サンプルで分析された血小板集団、または (B) 止血帯を用いた状態で分析した場合。(C) 比較のためにADPで刺激された血小板集団が報告されています。白血球数:白血球;赤血球:赤血球。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:細胞表面に関連するTF発現の時間経過による安定性。 静止血小板の血小板関連TF発現は、x軸で報告された血液離脱後の4つの異なる時点で分析されました。T0 = 採血直後;T1 = 採血後1時間;T2 = 採血後2時間;T3 = 採血後3時間。データは平均標準差(SD)として報告され、n = 3±。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図4:細胞内貯蔵TFの代表的なフローサイトメトリー解析。 全血中の血小板集団(赤色)はFSC/SSC-A点プロット(A,D)およびαCD61 mAb染色(B,E)で同定されます。TFの発現はPE-αCD142/HTF1 mAb(緑色点)を用いて解析されます。ヒストグラムプロットは、ネガティブ(C)イベントとポジティブ(F)イベントを特定するために用いられます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図5:表面関連TF陽性血小板の代表的なフローサイトメトリー解析。新鮮な全血はαCD142/HTF1 mAbで標識され、その後1%のPFAで固定され、二次mAbおよびαCD41 mAbで標識されます。全血中の血小板集団(赤色)はFSC/SSC-A点プロット(A,D,G)およびαCD41 mAb染色(B,E,H)で同定されます。安静状態(D-F)およびADP刺激後のTF発現(G-I)は、αCD142/HTF1 mAb(緑色の点)で標識することで定量化されます。陰性(C)および正(F,I)サンプルの代表的なヒストグラムプロットが報告されます。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図6:異なる遠心分離力がPRP調製に与える影響。(A-C) 全血中血小板集団のフローサイトメトリー解析を行い、PRPは100 x gおよび350 x gで調製。FSC-H/SSC-Hにおける血小板の参照範囲は点線で示されています。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図7:イメージングフローサイトメトリーによる血小板および白血球におけるTF発現の評価。 明るい視野(BF、グレー)、組織因子(TF、緑)、αCD61(赤)、αCD45(グレー)、ホエスト(マゼンタ)による核染色、60倍倍率で取得した合成画像(マージ)の代表的なチャネル画像が示されています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

サンプルチューブ識別	全血固定/パーム(μL)	αCD142-PE(μL)	αCD61-PerCP(μL)
FMO	100	-	15
TF	100	5	15

表1:細胞内TF発現のフローサイトメトリー解析のための染色プロトコル。

サンプルチューブ識別	全血固定/パーム(μL)	αCD142-PE(μL)	αCD61-PerCP(μL)
染色なし	100	-	-
αCD142-PE	95	5	-
αCD61-PerCP	85	-	15

表2:細胞内TF発現の補償マトリックスを単一染色で管理。

サンプルチューブ識別	PBS 1倍(μL)	αCD142(μL)	ADP(μL)	新鮮な全血(μL)	PFA 1%(μL)
FMO	95	-	-	5	300
休息	87.5	7.5	-	5	300
ADPアクティベート	82.5	7.5	5	5	300

表3:表面TF発現のフローサイトメトリー解析のための染色プロトコル。

サンプルチューブ識別	PBS 1倍(μL)	Alexa フルオナ633 IgG(μL)	αCD41-PE(μL)
FMO	90	5	5
休息	90	5	5
ADPアクティベート	90	5	5

表4:表面関連TF解析のための二次抗体染色プロトコル。

サンプルチューブ識別	PBS 1倍(μL)	αCD142(μL)	ADP(μL)	新鮮な全血(μL)	PFA 1%(μL)
染色なし	90	-	5	5	300
TF + Alexa フルオナ 633 IgG	82.5	7.5	5	5	300
αCD41-PE	90	-	5	5	300

表5:細胞内TF解析のための補償マトリックス調製。

サンプルチューブ識別	PBS 1倍(μL)	Alexa フルオナ633 IgG(μL)	αCD41-PE(μL)
染色なし	100	-	-
TF + Alexa フルオナ 633 IgG	95	5	-
αCD41-PE	95	-	5

表6:表面関連TF解析のための補償マトリックス準備。

ディスカッション

本論文は、全血中型血小板を全血流量サイトメトリーによる詳細な評価手順を報告しており、血小板表面および表面上の両方で発現するタンパク質の解析を考慮しています。

過去20年間で、ヒト血小板におけるTFの存在は1^{、2、3、4、5、17、18}と確立されています。循環血小板全体の20%〜30%を占める一部の血小板がこのタンパク質を発現し、この分野でますます重要になってきている血小板の異質性の概念を強化しています^19,20。なお、TF陽性の血小板は高い平均血小板容積を持ち、これは高感度の画像フローサイトメ^トリー2で示されています。この特徴を考慮することは極めて重要であり、特に他の血液細胞成分から単離された血小板でTF発現を分析する必要がある場合に重要です。実際、血小板分離に用いられる遠心分離工程が、大サイズ血小板の喪失を引き起こす^{可能性があります。}この事前分析の問題は、数年前まで続いた、血小板^7、12、13におけるTFの存在に関する論争の主な原因の一つであると考えられます。全血流量サイトメトリーはこの点で非常に有用なアプローチであり、すべての血小板サブセットを単離せずに解析することを可能にします。

血小板中のTF存在について議論が促進されたもう一つの理由は、分析に用いられた抗ヒトTF抗体の選択でした。市販されている多くの抗体は血小板関連TFの評価に用いられており、タンパク質の異なるエピトープを認識しています。TF9-10H10 ^3,21,22やVIC7 ^1,3クローンのような抗体は、TFの機能性のない領域に結合し、FVII/FVIIa結合に影響を与えません。VD8 ^1,2,3クローンやHTF1¹⁸クローン(後者は本プロトコルで使用されている)など、他の抗体はタンパク質の触媒部位を認識し、FVII/FVIIaとTFへの結合を競い合い、その凝固促進機能を阻害します。細胞外ドメインの糖鎖化状態や、特定の条件下(細胞活性化や疾患など)で修飾される可能性のある^TF23の触媒部位の立体構造によって、これらの抗体の一部はフローサイトメトリーによって血小板関連TFの表面発現を区別して認識できる可能性があることに注意が必要です。さらに、染色条件、すなわち分析対象のサンプルが新鮮、固定、または透過性であるかどうかもエピトープの立体構造に影響を与え、ひいては抗原-抗体結合に影響を及ぼ^{す可能性があります。}

もう一つ注目すべき点は、抗体に結合したフルオロクロムの選択です。TFは血小板集団の20%〜30%しか発現していないため、低放出蛍光色素と低感度フローサイトメーターの使用では、低正信号の識別には適さない可能性があります。このため、PEやAPCのような明るい蛍光色素で標識された抗体が推奨されます。ただし、PEのようなフルオロクロムの大サイズは、標識抗体がタンパク質²⁴に結合するのを妨げる可能性があることに注意が必要です。この問題を克服するため、本プロトコルでは表面TF染色を未結合αCD142/HTF1 mAbによる間接標識として実施し、その後二次抗体を用いて明らかにしました。PE-steric 阻害は、触媒部位が抗体結合によりアクセスしやすい細胞内に保存されたTFへのαCD142/HTF1 mAbの結合に影響を与えません。直接標識による血小板関連TFの表面発現を評価することは、間接標識よりも可能であれば、サンプル処理時間を短縮するために望ましいことは明らかです。しかしながら、このアプローチは、上記の重大な課題、さらには、市販されている複数の市販抗体の血小板TFへの結合能力、タンパク質自体の立体構造、染色条件、さらに使用される異なるフルオロクロームの立体障害に関わる問題を考慮しなければなりません。したがって、偽陰性結果を避けるために、表面発現した血小板関連TFの直接標識には、慎重な最適化プロセスが必須です。これらの点は、市販のさまざまな抗体クローンを全て使用中のフルオロクロームで標識した直接染色の効率を評価する進行中の研究の対象となっています。

いくつかの研究で、TFの発現は血栓リスクが高いさまざまな病理学的状態(8,9,10,11,17)で上昇していることが示されています。最近、フローサイトメトリー解析で正確に定量化されたTF陽性血小板のレベルが、アスピリンおよび_P2Y12アンタゴニストによる薬物治療に最適反応を示しても高い血栓リスクを維持する心血管患者を特定できることを示す証拠が示されています²⁵。実際、血小板関連TFは機能的に活性であり、^{1,3,4の生成を}支える可能性があります。この文脈で、数マイクロリットルの血液でフローサイトメトリー解析を行う能力は、血小板関連TF解析を臨床現場に拡張する大きな利点となっています。この目的のために、血小板関連TF測定のフローサイトメトリーによる検証は、国際止血・血栓学会の支援を受けて最近調整した国際プロジェクトの目的であり、その評価のための方法論的指針を提供することを目的としています。

P-セレクチンや血小板-白血球集合体など、血液採取直後に解析してアーティファクトを避けなければならない他の古典的な血小板活性化マーカーとは異なり、TF発現ははるかに安定しています。実際、血液サンプルは血液抽出後数時間以内に処理され、血小板TFの発現に有意な変化はありません。さらに、サンプルを固定し、その後にラベル付け・処理できる可能性があるため、多くの病院や検査機関に適した分析が可能です。この論文で説明されているプロトコルは比較的簡単に実行できるものの、フローサイトメトリー技術には依然として専門的な技術訓練が必要です。このため、技術はポイントオブケアアッセイ向けのよりシンプルなサイトメーターの開発に向かっています。

結論として、提案されたプロトコルは血小板関連TFの正しい解析方法を提供し、その決定におけるフローサイトメトリー解析技術の利点を強調しています。さらに、このタンパク質の分析に影響を与える事前分析変数を強調し、それらを回避するための対策を強調しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アデノシン5'-二リン酸(ADP)	シグマ・オルドリッチ	A-2754	血小板作動薬
Alexa fluor 633 ヤギとアルファマウス IgG	インビトロジェン	A21052	二次抗体
バイオチューブ 10 mL	バイオシグマ	BSP048	PRPコレクションのために
バタフライニードル G19	PICソリューション	02044019030010	血液抜きのために
CytExpertソフトウェア	ベックマン・カウルター		フローサイトメトリーデータ解析
サイトフレックスS	ベックマン・カウルター		フローサイトメーター
エッペンドルフ管 1.5 mL	エッペンドルフ	1,20,086	血液固定
イメージストリームX Mk II	サイテック・バイオサイエンス		イメージングフローサイトメーター
カルザ・ソフトウェア	ベックマン・カウルター		フローサイトメトリーデータ解析
パラホルムアルデヒド	抗生物質とndash;Divisione Carlo Erba Reagenti	387507	血液と血小板を固定するために
PerCP-αCD45	BD	345809	白血球人口マーカー
PerCP-αCD61	BD	347408	血小板の抽出マーカー
PE-&アルファ;CD142	BD	550312	抗ヒト組織因子抗体
PE-&アルファ;CD41	ベックマン・カウルター	A07781	血小板の抽出マーカー
リン酸バッファー生理食塩水(PBS)カルシウムとマグネシウムなし1回	ギブコ	10010-015	抗体およびサンプル希釈のために
ピペットチップ10 & micro;L	ギルソン	F161630	サンプルの準備
ピペット先端1000 &マイクロ;L	ギルソン	F161670	サンプルの準備
ピペットチップ 200 & micro;L	ギルソン	F161930	サンプルの準備
丸底チューブ 5 mL	コーニング	352052	フローサイトメーター取得のために
塩化ナトリウム 0.9%	BD	306575	摘血後の針カニューレを洗うこと
シスメックス XN-450	ダシット		血液細胞分析装置
トライトン X-100	カルロ・エルバ・レジェンティ	9002-93-1	血球膜を透過させること
真空シトレート 0.129Mチューブ	BD	363079	採血のために
バキュテイナーK2 EDTAチューブ	BD	368857	採血のために
Vacutainer マルチサンプルルアーアダプター	BD	367300	血液抜きのために
バキューテイナー1回使い用ホルダー	BD	364815	血液抜きのために
Versacomp抗体キャプチャビーズキット	ベックマン・カウルター	B22804	抗体滴定
αCD142(クローンHTF-1)	インビトロジェン	16-1429-82	抗ヒト組織因子抗体