方法論記事

蛍光色素バンディングと45Sおよび5S rDNA-FISHを用いた Lycoris aurea Herb集団の比較核型解析

DOI：

10.3791/67363

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2024年11月29日

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1Key Laboratory of Research and Utilization of Ethnomedicinal Plant Resources of Hunan Province, Huaihua University, 2College of Biological and Food Engineering, Hunan University

この記事について

サマリー

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このプロトコルは、PIとDAPIの染色体染色、18S-5.8-26S rRNA遺伝子領域(45S rDNA領域)と蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)、および5SリボソームDNAプローブを組み合わせて、 Lycoris aurea (L'Her)ハーブの8つの集団におけるヘテロクロマチン分布を調査します。

要約

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8つの集団における核型の多様性を理解するために、染色体測定、蛍光バンド、およびrDNA FISHシグナルを用いて、詳細な核型を細心の注意を払って確立しました。45S rDNA部位の数は、集団ごとに1対から5対までさまざまで、核型ごとに最も一般的な数は4対です。45S rDNA遺伝子座は主に染色体の短腕および末端領域に位置し、5S rDNA遺伝子座は主に短腕および末端または近位領域に見られます。HBWF、HNXN、HBBD、およびHNZXの集団は、GXTL、HBFC、およびSCLSと同様に、45S rDNA部位の分布が類似していることを示しており、45S rDNA部位の分布が類似している集団間の密接な関係が示された。研究されたすべての集団の核型は対称的であり、安定および準安定セントロメア、またはもっぱら安定セントロメアを含む。MCAとCVCLの散布図は、それらの核型構造を効果的に区別します。分析には、6つの定量パラメータ(x、2n、TCL、MCA、CVCL、CVCI)が含まれます。さらに、これらの6つのパラメータに基づくPCoAは、8つの集団間の生物学的核型関係を決定するための堅牢な方法であることを示しています。 Lycoris 集団の染色体数はx = 6-8です。現在の研究と文献に基づいて、これらの集団のゲノム分化は、ゲノムサイズ、ヘテロクロマチン、45Sおよび5S rDNA部位、および核型の非対称性の観点から議論されています。

概要

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Lycoris は、いくつかの重要な園芸植物を含む家族です1。 Lycoris aurea (L'Hér.)ハーブ。は、長い歴史を持つ伝統的な中国の薬用植物です。植物化学的分析により、 Lycoris aurea (L'Her。ハーブにはガランタミンなどのアルカロイドが含まれており、アセチルコリン感受性を高め、アルツハイマー病をコリンエステラーゼ阻害剤として治療できる可能性があります2。

高等植物では、核型解析は遺伝学的マップと物理マップを統合するために重要であり、植物生物学にとって大きな実用的な意味を持ちます。この解析により、染色体レベルのゲノム特性評価、集団間の細胞分類学的関係の解明、遺伝的異常の同定、染色体進化の傾向の理解が可能になります3,4,5。典型的には、核型の説明には、染色体数、染色体絶対長および相対染色体長、一次および二次狭窄位置、ヘテロクロマティック断片分布、rDNA部位数および位置、およびその他のDNA配列特性、ならびに核型の非対称性6,7,8が含まれる。核型パラメータの中で、非対称性は染色体長(染色体間非対称性)とセントロメア位置(染色体内非対称性)の変動によって決定されます。核型の非対称性は、染色体の形態を反映する重要な特徴であり、植物細胞の分類学9,10,11,12で広く使用されています。

多くの場合、染色体マーカーがないと、核型解析が制限され、個々の染色体の同定が妨げられます。近年、植物の染色体解析において、ギムザ染色、蛍光バンディング、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)が盛んになってきています。CMA(chromomycin A3)/DAPI(4,6-diamino-2-phenylindole)染色やPI(ヨウ化プロピル)/DAPI染色(CPD染色として知られる)などの二重蛍光染色法により、染色体上のGCリッチおよびATリッチなヘテロクロマティック領域が明らかになります4,13。植物の有糸分裂の中期またはパキテンの間に、反復DNA配列または長いDNAセグメントは、FISHハイブリダイゼーション14,15,16を通じて植物集団に特異的シグナルを生成することができる。

蛍光バンドとFISHシグナルは、染色体同定に有用なマーカーを提供します。染色体長の測定、蛍光バンディング特性の解析、FISHシグナルの違いの比較により、異なる植物の生殖形質または集団の詳細な分子細胞遺伝学的核型を構築することができます。これらの核型は、さまざまな生殖細胞や集団の染色体形態を効果的に示し、ヘテロクロマチンの分布とDNA配列の局在性の比較を可能にし、さらなる研究を奨励する4,8,17。分子細胞遺伝学的核型の比較は、関連する集団の系統関係と染色体進化に関する貴重な洞察を提供することができる8,14,18,19。

アマリリス科の多様で興味深いグループである リコリス 属は、多年生の球根で知られています。約20種で構成され、そのうち15種は中国固有種であり、豊かな生物多様性を示しています。この属は、中国南西部、韓国南部、日本など、東アジアの温暖な温帯および亜熱帯地域でのみ見られ、少数の個体群はインド北部とネパール20に広がっています。初期の細胞遺伝学的研究は、主に属の基本的な染色体数を確立し、特定の集団における染色体の形態を説明するための染色体カウントを含み、主に Lycoris radiata21に焦点を当てていました。この属で観察される総染色体数は12から33または44の範囲であり、それぞれ二倍体、異常な二倍体、三倍体、四倍体、および異数体のレベルを表します。基本的な染色体番号 xは、6、7、8、および11です。

Lycoris aurea (L'Hér.) Lycoris 属の注目すべき種であるハーブは、中国全土に広く分布しています22。それはリラックスした湿った環境で繁栄し、小さな球根を通して繁殖します。これらの球根には、リコリンとガランタミンという2つの主要な薬用化合物が含まれており、何世紀にもわたって伝統的な中国医学で使用されてきました。 Lycoris aureaは また、秋には印象的な赤い花、冬には常緑樹の葉で園芸家を魅了します。しかし、研究されたすべての Lycoris aurea (L'Hér。ハーブ集団は、従来の細胞学的方法を用いた染色体同定に大きな課題を提起しています。

中期染色体または乳母性染色体上の反復DNA配列およびオリゴヌクレオチドプローブを用いたFISH、フォスミド、またはBAC(細菌人工染色体)のクローニングは、核型解析23,24,25、比較細胞遺伝学的解析26,27、細胞遺伝学的マップ構築28,29、および染色体特異的アッセイ30に使用されています.最近、FISH技術はLycoris集団の染色体解析に適用されている31。染色体数と核型はLycoris集団で異なりますが、総染色体数は一定であり、中央セントロメア染色体(M-)、遠位セントロメア染色体(T-)、および近位セントロメア染色体(A-)の3つの基本的なタイプが観察されます。さらに、多様な染色体の形状とサイズが自然集団で観察されます32。

RNA蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)は、セントロメア融合、反転、遺伝子増幅、フラグメント欠失などの染色体変化の検出に有用です。蛍光In Situハイブリダイゼーション(RNA-FISH)技術により、染色体の高分解能視覚解析が可能になり、染色体中央領域の融合、新しい染色体構造の形成、染色体領域の逆転、遺伝子または遺伝子断片の増幅、特定の染色体領域での遺伝子配列の喪失など、複数の複雑な変化を検出および同定できます33。.500クローンのうち5クローンは、中央セントロメア染色体(M-)のセントロメア領域で強いFISHシグナルを示したが、遠位セントロメア染色体(T-)では示さなかった34。各染色体上のユニークなFISHシグナル分布パターンは、従来の染色法を使用して Lycoris 集団で以前に困難であった個々の染色体の同定を可能にした31。現在、 Lycoris aurea (L'Hér.) の分子細胞遺伝学に関する研究はほとんどありません。ハーブ、この分野でのさらなる研究の緊急の必要性を強調しています。

この研究では、 Lycoris aurea (L'Hér.) の 8 つの高分化中期染色体ハーブ集団は、酵素浸漬および火炎乾燥(EMF)法を使用して調製しました。CPD染色と45Sおよび5S rDNAプローブをFISHの同定に使用しました。これらの集団の詳細な分子細胞遺伝学的核型は、染色体測定、蛍光バンド、および45Sおよび5S rDNA FISHシグナルからの結合データを使用して構築されました。6つの異なる核型の非対称性指標を各集団について計算し、それらの間の核型関係を特定しました。分子細胞遺伝学的核型データの評価は、8つの集団のゲノム分化と進化的関係に関する重要な洞察を提供し、 Lycoris 染色体の理解を再形成する可能性があります。

プロトコル

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この研究で使用した試薬と機器は 資料表に詳しく説明されており、使用したプローブは 補足ファイル1に記載されています。

1. 頂端染色体の調製

  1. 水耕栽培で根を下ろします。球根の地上部分を取り外した後、Songら35で説明されている方法に従って、水で満たされた先細りのボトルに入れ、3日ごとに水を交換します。
  2. 活発に成長している根の先端の長さが約1.0〜2.0 cmに達したら切除し、飽和α-ブロモナフタレンで28°Cで1.0時間処理します。
  3. 根の先端を約1cmに切り、メタノールと氷酢酸の新しく調製した混合物に、室温(約20〜25°C)で3:1の体積比で2〜3時間置きます。その後、She et al.36に記載されているように、4°Cの冷蔵庫で保存します。
  4. 固定根の先端(2〜3 mm)を二重蒸留水でよく洗います。
  5. pH 4.5の0.01 mMクエン酸-クエン酸ナトリウム緩衝液にセルラーゼとペクチン加水分解酵素の混合物を調製し、セルラーゼとペクチン加水分解酵素をそれぞれ1%で調製します。前処理した根の先端を混合物に入れ、28°Cで1.0〜1.5時間消化します。
  6. 消化した根の先端を二重蒸留水で洗い、スライドガラスに移し、先の細かい鉗子を使用して固定液で完全につぶします。
  7. ウォーターミストが消えるまで、アルコールランプの炎でスライドを乾かします。位相差顕微鏡下で、5つ以上の分割フェーズがあり、重なり合う染色体がないスライドを選択します。スライドは、将来の使用のために-20°Cで保管してください。

2. CPD染色

  1. PIの濃度が0.6 μg·mL-1 、DAPIの濃度が3 μg·mL-1の30%(v / v)抗蛍光減衰器にPIとDAPIを添加してCPD溶液を調製します。
  2. 染色体スライドを65°Cで30分間乾燥させます。
  3. 100 μLのRNase A希釈液(RNase A保存溶液を2x SSC(生理食塩水クエン酸ナトリウム)で100倍に希釈し、染色体スライドあたり最終濃度を100 μg/mLにしてください。スライドを覆い、37°Cの湿ったチャンバーで30〜60分間温めます。
  4. 染色体スライドを2x SSCで室温で5分ずつ3回間隔で洗浄します。
  5. 染色体スライドを室温で1〜2分間洗浄します。
  6. 染色体スライド1枚につき200μLのペプシン希釈液(ペプシン保存液を0.01 N HClで100倍に希釈して最終濃度5 μg/mL)を添加します。スライドを覆い、37°Cの湿ったチャンバーで5〜20分間インキュベートします。
  7. 染色体切片を超純水で室温で2分間洗浄し、続いて室温で2xSSCで5分間ずつ2回洗浄します。
  8. スライドをメタノール:氷酢酸(3:1)溶液で10分間固定します。
  9. 2x SSCで室温で5分ずつ3回間隔で洗浄します。
  10. 70%、95%、100%のエタノールを-20°Cでそれぞれ5分間処理し、室温で乾燥させます。
  11. 処理および乾燥した染色体スライドを取り、各スライドに30 μLのCPD染色溶液を加え、24 mm x 50 mmのカバーガラスで覆い、暗所で30分以上染色します。広範な染色体材料は一晩染色する必要があります。
  12. PI染色には緑色励起フィルター(WG)、DAPI染色には紫外線フィルター(UV)を使用して、蛍光顕微鏡で染色体スライドを観察します。互換性のあるソフトウェアで画像をキャプチャします。
    1. 2つのフィルターで露光時間を調整して、画像キャプチャ中に同様の赤と青の蛍光強度を達成します。CPD画像は、PIおよびDAPIで染色されたグレースケール画像から取得されます。染色体測定と画像処理は、Adobe Photoshopソフトウェアを使用して行いました。

3. 蛍光in situハイブリダイゼーション

  1. ハイブリッド溶液を調製します:FAD(10 μL)、ssDNA(2 μL)、20× SSC(2 μL)、5S rDNA(1 μL)、45S rDNA(1 μL)、および50%グルカン硫酸塩(4 μL)。調製後、ハイブリッド溶液(2500 x g、室温で5〜10分)を遠心分離し、氷上に置きます。
  2. スキャンしたスライドを65°Cのオーブンに30〜60分間入れます。
  3. 焼きたてのスライドを取り出し、70%FAD変性溶液100μLを加え、カバーガラスで覆い、85°Cの分子ハイブリダイゼーション炉で2.5分間変性させます。
  4. カバーガラスを取り外し、すぐにスライドを70%、90%、100%の冷たいエタノールに浸し、それぞれ5分間連続して脱水します。
  5. スライドを取り外し、室温で30分以上乾燥させます。
  6. スライドに20μLのハイブリッド溶液を加え、液体が完全に拡散するまでカバーガラスを上にそっと置き、室温で10分間放置してスライドのカバー部分を湿らせます。
  7. スライドを2×SSCに浸したハイブリッドディッシュに入れ(ハイブリッドディッシュは、光を避けて操作できるように蓋をスズホイルで包んだ大きなシャーレにする必要があります)、37°Cで一晩(少なくとも6時間)インキュベートします。
  8. 染色体を30%(v/v)Vectashield H-100の溶液に3μg·mL-1 DAPIでマウントすることにより、染色体を対比染色します。互換性のあるソフトウェアを使用して画像をキャプチャし、フィルターの紫色の光によって励起されたDAPIの青色蛍光と、緑色の光によって励起されたPIの赤色蛍光をそれぞれ使用します。
    注:FISHハイブリダイゼーションは、Sheら36によって記載された方法に従って、以前にCPD染色されたスライド上の45Sおよび5S rDNAプローブを使用して行った。

4. 核型解析

  1. She et al.4 によって記述された方法論に従って、染色体が十分に分散し (重なり合っていない)、適度に凝縮している (染色体が最大限に凝集してはならないが、末端が凝集してはならない) 各集団について、5 つの中期有糸分裂細胞を選択します。
  2. 細胞分裂中に最も濃度の高い5つの染色体を選択することにより、各染色体の絶対長を決定します。
  3. 各染色体の長腕(L)と短腕(S)の長さ、および染色体上の各蛍光色素バンドのサイズを細心の注意を払って正確に測定します。
  4. 次のパラメータを計算します:(1)相対的な染色体長(RL、一倍体の割合)。(2)アーム比(AR = L / S、ロングアーム/ショートアーム)。(3)一倍体染色体総長(TCL;核型長);(4)平均染色体長(C);(5)蛍光バンドのサイズ(染色体の長さに対する蛍光バンドの割合)。(6)セントロメアからrDNA部位までの距離;(7)平均セントロメア指数(CI、各染色体の短い腕の長さをその染色体の全長で割った値として計算され、次にこれらの値を平均化します)。(8)セントロメア指数(CVCI)、変動係数(CV)、染色体長変動係数(CVCL)、平均セントロメア非対称係数(MCA)、およびステビンズ非対称性カテゴリを含む、核型非対称性の4つの異なる指標。
    注:非対称指数を計算するには、Paszko10 およびPeruzzi et al.11 の方法を参照してください。レヴァンの5つの分類方法に従って、異なるアーム比の染色体を分類します。 Lycoris aurea (L'Hér.) の染色体を配列します。Hanらのプロトコル37に記載されている長さの降順のハーブ。
  5. 染色体測定データと蛍光バンド情報、およびrDNA-FISHの位置とサイズを組み合わせて、染色体核型パターンを描画することにより、方法論の精度と精度を確保します。
  6. 8つの集団の核型の非対称関係を視覚化することは、明確な洞察を提供する重要なステップです。これは、MCAとCVCLを取得するために使用される2次元散布図によって実現されます。
  7. 重要なコンポーネントであるガワー類似係数を使用して、She et al.38の方法に従って主座標解析(PCoA)を実行します。
  8. 6つの定量的パラメータ(x、2n、TCL、MCA、CVCL、CVCI)を計算して、8つの集団の細胞遺伝学的核型を決定します。
  9. データ分析および視覚化プログラムを使用して統計分析を行い、UPGMAベースの樹形図とPCoA散布図を生成します。

結果

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細心の注意を払った酵素浸漬および火炎乾燥(EMF)法を採用することにより、 Lycoris aurea (L'Hér)の散在および高分化中期染色体。ハーブが得られ、 Lycoris aurea の細胞遺伝学的染色体核型が構築されました(図1)。凝縮度が最も高い中期染色体は、形態学的差が減少するため、核型解析には適していません。しかし、半数体染色体(TCL)の全長は集団間で同等であるため、TCL値の違いを比較することで、異なる Lycoris aurea 集団の核型を区別することが可能です。 Lycoris aurea の8つの集団の核型の特徴と核DNA含量を 表1に示します。蛍光バンドの分布と45Sおよび5S rDNA部位の位置を 表2に示します。 図2 は、染色体の測定値、蛍光バンディング特性、および45Sおよび5S rDNA FISHシグナルの位置とサイズを示しています。

二倍体染色体番号は、GXTLが2n = 16 = 8m + 8t、HBFCが2n = 14 = 8m + 6t、GZDSが2n = 14 = 8m + 6t、HNZXが2n = 16 = 6m + 10t、HBBDが2n = 14 = 8m + 6t、HNXNが2n = 14 = 8m + 6t、HBWFが2n = 16 = 6m + 10t、SCLSが2n + 1 = 15 = 7m + 8tです(表1)。She et al.4のプロトコルに記載されているように、8つの L. aurea 集団の中期染色体は小さく、平均染色体長は1.01μm(HNZX)から2.08μm(GZDS)の範囲であり、TCLは16.14μm(HNZX)から29.13μm(GZDS)の範囲です。8つの集団のTCLは、報告された核DNA含量と相関しています(表1)。最小の相対長範囲 (RRL) は HNXN (1.52-3.81) で観察され、最大のものは GZDS (2.73-5.86) で観察されます。HNXNとGZDSの集団は、それぞれ染色体長の変動が最も小さく、最も大きく変動しました。ゲノムの平均セントロメア指数(CI)は、61.02±5.63(HBFC集団)から70.70±4.63(HBWF)の間で変動した。人口HBFCはセントロメア指数の変化が最も少なかったのに対し、人口HBWFは最も広範な変化を示しました。

核型は、メタセントリック染色体(m)とテロセントリック染色体(t)で構成されています(表1; 図2)は、調査した8つの集団の中で最も一般的な染色体形態を表しています。8つの異なる核型の非対称性指標を 表1に示します。これらの指標のうち、セントロメア指数の変動係数(CVCI)と平均セントロメアの非対称性(MCA)は染色体内の非対称性を特徴づけ、染色体長の変動係数(CVCL)は染色体間の非対称性を測定します。CVCIとMCAの範囲は、CVCI=10.97(HBBD)〜18.25(HBWF)、MCA=28.85(HNZX)〜39.30(HBWF)です。これらの値は一貫して、HBBDが最も低く、HBWFが最も高い染色体内非対称性を示すことを示しています。CVCLの範囲は14.98(GZDS)から23.32(HBWF)であり、GZDSは最も非対称な核型を示し、HBWFは8つの集団の中で最も非対称な核型を示すことを示唆しています。ステビンズ9の分類原理によれば、これらの核型はクラス1Bに属し、研究されたすべての集団が比較的対称的な核型を持っていることを示しています。

8つの Lycoris aurea (L'Hérit.)の核型の非対称性関係ハーブの集団は、CVCIとCVCLおよびMCAとCVCLの二次元散布図を使用して示されています(図3)。これらの集団の核型構造は、CVCI、CVCL、およびMCAの3つのパラメータペアによって明らかにされ、重要な意味を持っています。これらのパラメータは、同様の核型の非対称性を示しています。散布図から得られた知見は、この研究の潜在的な影響を強調しており、集団HNXNが最も対称的な核型を持ち、HBFCとHBWFがそれぞれ最も染色体内および染色体間の非対称性を示すことを示しています(図3)。

この研究では、5つの核型パラメータを持つUPGMAツリー図に基づいて、8つの Lycoris aurea 集団を3つの主要なグループに細心の注意を払って分類しました(図4)。最初のクラスターは、母集団 SCLS で表され、独立したクレードを形成します。2 番目のグループは、HNXN と HBWF で構成されます。3 番目のクラスターは 2 つのサブグループに分かれており、1 つは母集団 HBFC のみを含み、もう 1 つは母集団 HBF、GZDS、GXTL を含み、母集団 HBBD と GZDS は小さなブランチにクラスタリングされています。主座標解析(PCoA)によって明らかになった、調査対象の集団間の核学的関係を 図5に示します。PCoA散布図は、8つの母集団を68.36%の信頼水準で2つのグループに分割できることを示しています。最初のグループには、HBF、HBBD、GXTL が含まれ、前者の 3 つの集団は密接にクラスター化しています。2 番目のグループは、HBFC、HNXN、HNZX、および SCLS で構成され、HBFC は 2 つのグループの中央に位置し、SCLS は最も孤立した位置にあります (図 5)。

CPD(ヨウ化プロピジウムとDAPIの組み合わせ)およびDAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)逆染色は、核構造とクロマチン分布を観察するために使用される標準的な技術です。この研究の結果、 Lycoris aurea (L'Hérit.)の8つの集団間で明らかなヘテロクロマチン現象が明らかになりました。ハーブ(図1 および 図2; 表2)。各集団のFISHハイブリダイゼーションの結果は、すべての染色体領域が45Sおよび5SのrDNA遺伝子座に対応することを示しました。CPD バンドの特性を 図 1A、C、E、G、I、K、M、O に示します。

HBFCおよびHBBDの集団では、セントロメア領域とペリセントロメア領域でCPDバンドが観察されました(図1G、K;図2D,F)。ただし、特定の染色体はCPDバンドを示しませんでした:SCLSの3番目と8番目の染色体、HNXNの1番目の染色体、HNZXの1番目の染色体、HBWFの1番目の染色体、GZDSの2番目の染色体、およびGXTLの2番目の染色体(図1A、C、E、I、J、M、O;図 2A-C、E、G、H)。特に、CPDバンドは、SCLSとHNXNの染色体ペア5、6、および7の短腕の末端、HNZXのペア4、5、6、7、および8、およびHBFCのペア5、6、および7にも見られました。さらに、CPDバンドは、HBWFでは4番、5番、6番、7番、8番染色体の短腕端、HBBDでは5番、6番、7番染色体の短腕端、GXTLでは5番、6番、7番、8番染色体の短腕端に存在していました(図1Aおよび図2A)。

FISHハイブリダイゼーション後、DAPI逆染色は、GZDSの染色体5、6、および7の中心粒子の周囲に明るい蛍光バンドを形成しました。ポストFISH DAPI+バンドと呼ばれるこれらのバンドは、これらのヘテロクロマチン領域に多数のA-T塩基対が含まれていることを示しています(図2G)。8つの集団で観察された(周辺)セントロメアCPDバンドの範囲は25.00%から57.14%(表2)でしたが、末端CPDバンドの総量は40.00%から71.43%の範囲でした(表2)。集団GZDSでは、FISH後のDAPI+バンドは核型の長さと相関しており、全体の42.86%を占めていました。FISH後のrDNA CPDバンド、非rDNA CPDバンド、およびDAPI+バンドのサイズは、 Lycoris aurea (L'Hérit)のさまざまな染色体ペア間で有意に異なっていました。ハーブ(図2; 表2)。

図1に示すように、FISH法を使用して、CPD染色染色体に45Sおよび5S rDNAプローブを挿入しました。Lycoris aurea (L'Hérit.) の 8 つの集団における 45S および 5S rDNA 部位の数と位置の要約ハーブを表2に示し、図2に示します。注目すべきは、8つの集団間でrDNA遺伝子座の数、サイズ、位置が大きく異なることから、これらの知見の重要性が浮き彫りになっていることです。合計で、8つの集団にわたって30の45S rDNA遺伝子座がありました。これらのうち、4遺伝子座(13.33%)は中心セントロメア領域に、9遺伝子座(30.00%)は中心近傍セントロメア領域に、17遺伝子座(56.67%)はそれぞれの染色体アームの末端領域に位置していました(図2;表2)。

GXTL集団では、4番染色体の短腕のセントロメア領域に1つの45S rDNA遺伝子座シグナルが見つかり、さらに5番染色体、6番、7番、8番染色体の長腕のセントロメア領域に4つのシグナルが見つかりました(図1P; 図2G)。HBFC集団では、1つの45S rDNA遺伝子座が4番染色体の短腕のセントロメア領域に位置し、3つの遺伝子座が5番染色体、6番、および8番染色体の短腕のセントロメア周囲ヘテロクロマチン領域に見出されました(図1H; 図 2D)。GZDS集団では、45S遺伝子座はメタセントリック染色体4の短腕のセントロメア領域に位置していました(図1N; 図2G)。HNZXでは、染色体対4、5、6、7、および8の短腕の末端領域に5つの45S rDNA遺伝子座が観察されました(図1H; 図 2D)。HBBDにおける45S部位の分布(図1J; 図2E)およびHNXN(図1L; 図2F)同様で、4番染色体の短腕のセントロメア領域に1つの遺伝子座があり、5番、6番、7番染色体の短腕のセントロメア領域に3つの遺伝子座があった。

HBWFでは、染色体ペア4、5、6、7、および8の短腕セントロメア領域に5つの45S rDNA遺伝子座シグナルが現れました(図1N; 図2G)。SCLSでは、染色体ペア1と2の短アームセントロメア領域、および染色体ペア5と6のショートアームのセントロメア周囲領域に1つの45S rDNA遺伝子座シグナルが見つかりました(図1P; 図 2H)。5S rDNA遺伝子座については、8つの分類群で合計9つが同定され、3つ(33.33%)が近位領域に、3つ(33.33%)がセントロメア周囲領域に、3つ(33.33%)がそれぞれの染色体アームの末端領域に位置していました(図2; 表2)。GXTLでは、染色体対6の長腕の末端付近に1つの5S rDNA遺伝子座シグナルが現れました(図1P; 図2G)。5S部位の分布はHBFCでも同様でした(図1H; 図2D)および GZDS (図 1N; 図2G)は、いずれも7番染色体の短腕の近位領域に1つの5S rDNA遺伝子座を含む。HNZXでは、8番染色体の長腕の末端付近に5S rDNA遺伝子座が見つかりました(図1H; 図2D)、HBBDでは、5S rDNA遺伝子座が7番染色体で同定されました(図1J; 図2E)。HBWFでは、4番染色体と8番染色体の長腕の末端付近に2つの5S rDNA遺伝子座が、7番染色体の長腕にさらに2つ、セントロメア領域に1つ、末端付近に1つの遺伝子座が現れました(図1N; 図2G)。

45Sおよび5S rDNA FISHシグナルの組み合わせは、末端CPDセグメント特性とともに、 Lycoris aurea (L'Hérit)の異なる集団からすべての有糸分裂染色体を効果的に区別しました。ハーブ。SCLS、HBFC、HBBD、GZDS、およびGXTL集団では、1番染色体はセントロメア領域で強いCPDシグナルを示しました。2番染色体は、GZDSとGXTLを除いて、セントロメア領域で強いCPDシグナルを示しました。3番染色体は、SCLSを除いて、セントロメア領域で強いCPDシグナルを示しました。4番染色体は、セントロメア領域で一貫して強いCPDシグナルを示しました。5番染色体、6番染色体、7番染色体では、短腕の末端に強いCPDシグナルが観察されました。また、4番染色体は短腕の末端に強い45S rDNAシグナルを示し、5番染色体と6番染色体はGZDSを除いて末端領域に強い45Sシグナルを示しました。特に、GZDS集団に強いDAPIシグナルが存在しました。さらに、HBFC、HBWF、HBBD、およびGZDS集団の7番染色体の近位領域に弱い5S rDNAシグナルが現れました。

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図1:8つのLycoris aurea(L'Hér.)の有糸分裂染色体ハーブの個体数。 8つの異なるLycoris aurea(L' Herit.)由来の有糸分裂中期染色体の検討母集団SCLS(A,B)、母集団HNXN(C,D)、母集団HNZX(E,F)、母集団HBFC(G,H)、集団HBWF(I,J)、および集団HBBD(K,L)を含むハーブ集団が示されています。CPD染色後、ビオチン標識45Sおよびジゴキシン標識5S rDNAプローブを用いたFISHを用いて、GZDS(M,N)およびGXTL(O,P)のハイブリダイゼーションを行いました。CPD染色後の染色体画像には、45S(緑)と5S(赤)のrDNAシグナルが示されています。全DNAをDAPI色素で逆染色したところ、青色になりました。スケールバー = 10 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:8つのLycoris aurea(L'Hér.)の染色体核型図ハーブの個体数。Lycoris aurea (L' Herit.) の 8 つの集団の染色体パターン図Herbは、45Sおよび5S rDNA FISHシグナルの位置とサイズとともに、蛍光バンド特性を明らかにします。集団 SCLS、HNXN、HNZX、HBFC、HBWF、HBBD、GZDS、GXTL は、それぞれ (A-H) で表されます。縦位スケールは染色体の相対的な長さ(一倍体ゲノム内のその染色体の割合)を示し、上部の数字は染色体のシリアル番号を示します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:8つのLycoris aurea(L'Hér。3つの核型パラメータに基づくハーブの集団。 (A)CVCIインデックスは、CVCLインデックスに対してプロットされています。(B) MCA指数は、CVCL指数に対してプロットされます。集団SCLS、HNXN、HNZX、HBFC、HBWF、HBBD、GZDS、およびGXTLが示されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:8匹のLycoris aurea(L'Hér.)のUPGMA樹状図ハーブの個体数。 UPGMA樹状図は、8つのLycoris aurea(L'Hér.)のパラメータx、2n、TCL、MCA、CVCL、およびCVCIに基づいています。ハーブ集団:SCLS、HNXN、HNZX、HBFC、HBWF、HBBD、GZDS、およびGXTL。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:8つのLycoris aurea(L'Hér.)のPCoA6つの核型パラメータに基づくハーブの品種。 PCoA は、SCLS、HNXN、HNZX、HBFC、HBWF、HBBD、GZDS、GXTL を表すパラメータ x、2n、TCL、MCA、CVCL、および CVCI に基づいています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:8匹のLycoris aurea(L'Hér.)の名前ハーブの個体数。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表2:8つのLycoris aurea(L'Hér.)における蛍光色素バンドとrDNA部位の分布ハーブの個体数。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:この研究で使用したプローブ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

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Lycoris aurea(L'Hér.)の調製ハーブの根の染色体は、(1)水耕栽培による根の栽培、(2)根の先端を飽和α-ブロモナフタレンで処理する、(3)アルコール酢酸溶液で根を固定する、(4)酵素溶液で根の先端を酵素的に加水分解する、(5)消化した根を徹底的に押しつぶし、アルコールランプの炎でスライドを乾燥させる、といういくつかの重要なステップがあります。

正確な染色体測定は、細胞遺伝学的研究における核型解析に不可欠です。染色体は顕著な凝縮と明確に定義された境界を示す必要があります。そうでなければ、染色体パラメータを正確に計算することが困難になります5。これまでの細胞遺伝学的研究は、有糸分裂染色体の形態学的分化が凝縮の程度に依存することを示している4,36。凝縮が不十分な場合、染色体アームの末端はまだ解凝集しており、染色体の境界が不明瞭になる可能性があります。しかし、染色体が最大の凝縮に達すると、染色体間の形態学的差は減少します。したがって、中程度の凝縮を持つ染色体を選択することは、特に染色体が少ない集団では、染色体の同定と測定にとって非常に重要です。

プローブの標識は、FISH in situハイブリダイゼーションを成功させるために、特に5S rDNAプローブ溶液にとって非常に重要です。5S rDNAの配列が短いため、PCRで標識された標的配列の濃度は通常低く、ハイブリダイゼーションシグナルが弱くなります。しかし、フルオレセイン標識プローブを直接合成すると、より強力なハイブリダイゼーションシグナルが生成され、プロセスが簡素化されます。45S rDNAプローブ溶液では、 シロイヌナズ ナの5.8S、18S、および25S rRNAコード領域の部分配列を、5'末端と3'末端で6-カルボキシルテトラメチルローダミン(TAMRA)で標識し、混合しました。フルオレセイン5S rDNAプローブ溶液は、 シロイヌナズ ナ5S rRNA遺伝子コード領域の1-59および60-118ヌクレオチド配列を用いて得られ、各配列の5'末端を6-カルボキシルフルオレセイン(6-FAM)で標識し、その後混合しました。

本研究では、DNA結合におけるDAPI色素とPI色素の違いを活用し、それらを組み合わせることで透明な蛍光バンドを得ました。PI(ヨウ化プロピジウム)色素は、細胞膜を貫通し、細胞内のDNA分子に結合することができます。対照的に、DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)はATリッチDNA領域に優先的に結合し、クリアでコントラストの高い染色を提供します。これらの相補的な特性により、DAPIとPIは、核と細胞質の両方に関する情報を同時に収集するために、CPD染色と呼ばれる、しばしば一緒に使用されます。CPDバンドとDAPI+バンドの存在、位置、サイズの違いにより、 Lycoris aureaの8つの集団間で有意なヘテロクロマチンの分化が明らかになりました。CPD染色では、セントロメア領域とセントロメア周囲領域、およびテロセントリック染色体内にGC含量が豊富なヘテロクロマチン領域が示されました。

核型の非対称性の研究は、定性的および定量的測定、ステビンズ分類パラメータ、およびさまざまな定量的指標(例:Paszko10;Peruzzi et al.11)。このうち、染色体の非対称性を測定するためにR比とCVCLが使用され、CVCIとMCAは染色体の非対称性の主要な指標です。特に、CVCLは染色体間非対称性を推定するための堅牢な統計的パラメータと考えられており10、Metric for Chromosomal Asymmetry(MCA)は染色体内非対称性を評価するための効果的な尺度として認識されています11。集団間の核型の非対称性を最もよく表すには、2 つの非対称推定量をそれぞれ x 軸と y 軸に配置し、各サンプルを点11,12 として表す 2 次元散布図が推奨されます。その結果、CVCLと.CVCI、およびMCA対。CVCLは、Lycoris aurea(L'Herit)の8つの異なる集団間の核型の非対称性関係を効果的に示しています。Herbは、染色体の非対称性を評価する際のこれらの指標の信頼性をサポートします。

核型を比較し、8つの集団間の核学的関係を再構築するために、この研究では、パラメータx、2n、TCL、MCA、CVCL、およびCVCIを使用して、Peruzziらによって提案された方法論を適用しました.11。その結果、HBWF、GZDS、HBBD、およびGXTLの集団は密接に関連しており、HBFCはこれらのグループの間に位置付けられていることが明らかになりました。その結果、これら6つのパラメータに基づくPCoAは、8つの集団間の関係を区別するための非常に効果的な方法であることが証明されました。しかし、構築された分子進化の系統樹からは、ある種の複雑なパターンも現れました。例えば、HNZXは分子系統樹ではHBWFと密接に関連しているように見えましたが、PCoA散布図ではより遠い関連性がありました。この複雑さは、 Lycoris内の核型進化の傾向を予測するために複数の定量的アプローチを採用し、分子分類特性を補完することの重要性を浮き彫りにしています。

この研究の植物は、広西チワン族自治区天林県(GXTL)、湖北省方県(HBFC)、貴州省都山県(GZDS)、湖南省紫興県(HNZX)、湖北省八東県(HBBD)、湖南省新寧県(HNXN)、湖北省五峰県(HBWF)、四川省廬山県(SCLS)など、中国中部および西部からサンプリングされました。バウチャー標本は、淮華大学の植物標本館に保存されています。この研究では、45Sおよび5S rDNA FISHシグナルと末端CPDセグメント特性の組み合わせにより、 Lycoris aurea (L'Herit)の異なる集団からすべての有糸分裂染色体が効果的に区別されることがわかりました。ハーブ。ここで紹介するプロトコルは、 Lycoris aurea (L'Herit.) の異なる集団間のヘテロクロマチン分布を調査することを目的としています。ハーブ。CPD(PIとDAPIの組み合わせ)およびDAPI(4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)逆染色は、核構造とクロマチン分布を観察するための確立された技術です。染色体FISHハイブリダイゼーションのための18S-5.8-26S rRNA遺伝子領域(45S rDNA領域)および5SリボソームDNAの直接蛍光標識は簡単で、堅牢なハイブリダイゼーションシグナルを提供します。この定性的な区別は、さまざまな集団を分析する上でますます価値が増すでしょう。

この方法は、活発な有糸分裂中に根の先端の培養が必要なため、迅速な根の先端の栽培が可能な植物種に最適です。5S配列が短いため、この研究では、 シロイヌナズ ナの5S rRNA遺伝子コード領域の1-118bpヌクレオチド配列を5S rDNAプローブとして使用しました。この方法は、配列が短くシグナルが弱いため、5S rRNA遺伝子の1-118bp領域に比較的保存された塩基を持つ種を同定するためにのみ有効です。中程度の凝縮を伴う中期染色体を選択することは、この方法の成功にとって非常に重要です。染色体の凝縮は、根の収穫のタイミング、前処理の期間、および火炎焼成のタイミングと密接に関連しています。したがって、この手法では、実験の成功を確実にするために、各ステップを正確に制御する必要があります。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、競合する利益は存在しないと宣言しています。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、中国自然科学基金会(32070367)の支援を受けました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アルコール三権生物科(上海)有限公司A500737-0005(70%, 90%、 100%)
1×TNTSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. (TNTサンゴンバイオテック(上海)有限公司)B5481081回、10回;
2回;SSCSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. (SSCサンゴンバイオテック(上海)有限公司)B5481092回、20回;
45S rDNASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. (rDNAサンゴンバイオテック(上海)有限公司)両端(5 'および3'端)にTAMRAが追加されます
4'6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.E60730320ml
5S rDNASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. (rDNAサンゴンバイオテック(上海)有限公司)5'end plus 6-FAM(FITC)
Adobe Photoshopソフトウェアアドビシステムズ社CS6
αブロモナフタレンSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A602718飽和度
炎対策剤三言生物科技(上海)有限公司Vectashield H-100010 mL
生化学インキュベーターShanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LtdLRH-70
CellulaseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A42606810g
クエン酸Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A50170210g
脱イオンホルムアミド(FAD)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A600211-05000.7
デキストラン硫酸塩Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A42822910 mL
Fluorescence in situハイブリダイゼーション装置米国/Abbott ThermoBriteS500-24
Fluorescence microscopeOlympus 中国 Co.ltdBX60
氷酢酸三言生物(上海)有限公司A501931500 mL
HClAladdin Reagent Co. Ltd. (上海)H399657500 mL
製氷機Dan Ding Shanghai International Trade Co., Ltd.ST-70
ライカ生物顕微鏡ドイツ ライカインスツルメンツ Co., LtdDM6000B
Methyl alcoholSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A601617500 mL
MetMorph ソフトウェアMolecular DevicesVersion 7.35
オーブンThermo Scientific™ヘラサーム&トレード;THM#51028152
ペクチナーゼSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A00429710g
PepsinSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.1.07185100 g
ヨウ化プロピジウム(PI)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A4252591 g
RNaseASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.R464210 mg
サケ精子DNA(ssDNA)アラジン試薬 Co. Ltd. (上海)D1198711 g
クエン酸ナトリウムアラジン試薬 Co. Ltd. (上海)S18918310 g
Statistica for Windows 10.0 統計分析用
(英語)

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