方法論記事

浮体研究所:環境DNA分析のために運航フェリーから海水サンプルを収集およびろ過するための標準操作手順

DOI：

10.3791/67366

⸱

2025年8月1日

 , 
1Department of Earth and Environmental Sciences, University of Milano-Bicocca, 2Marine Research and Higher Education Center (MaRHE Center), 3National Biodiversity Future Centre (NBFC)

この記事について

サマリー

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ここでは、運航中のフェリーやその他の商船からの海水サンプルの収集とろ過を通じて海洋eDNAを回収するための新しいプロトコルを紹介します。

要約

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環境DNAの痕跡から情報を取得するための遺伝的ツールは、標的および分類学的に広範な生物多様性の特性評価の両方のために十分に確立されています。しかし、海洋の文脈では、深海や沖合など、アクセスの悪い場所からeDNAサンプルを収集することは依然として制限である可能性があります。広大な外洋を横断する定期フェリーや商船の使用は、環境サンプルを収集するための貴重な日和見的なプラットフォームを構成することができます。どんな気象条件でも、いつでもデータを収集できることから、経時的な再現性、ルートが一定であること、コストと燃料排出量の総削減まで、利点は数え切れないほどあります。これまでの研究では、このアプローチが可能であり、成功していることが示されています。ただし、これらの大型船舶の腹部からサンプルを取得するプロセスは、すぐには行われない場合があります。この作品は、大型船からの海水の収集とろ過がどのように準備され、手配され、実行されるかを詳細に示しています。

概要

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過去数十年で、環境DNA(eDNA)の分析、つまり環境中の生物が残した遺伝物質の検出は、淡水および海洋動物のコミュニティの有望な監視ツールとして急速に成長しました。この分子技術は、単一のサンプル内の複数の分類群を同時に識別する可能性を提供し(メタバーコードアプローチ)、サンプリングされた領域に生息または横切る生物群集の検出を可能にします1,2,3,4,5。

現在、本当の課題は、大規模な地理的スケールにわたってサンプルを収集することは経済的および/またはロジスティック的に実行不可能であることが多いため、サンプリングスポットに到達することであり、その結果、遠洋地域は通常、よりアクセスしやすい沿岸地域と比較してサンプリングが不十分です6。フェリーやその他の商船を使用すると、通常、季節を通して一定であり、広い領域をカバーする特定の輸送ルートをたどるため、再現性の高いサンプリング横断面が可能になります ....

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プロトコル

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1. 実験室での準備

  1. ギアチェックリスト
    1. サンプル収集とサンプルろ過の両方のために機内に持ち込むアイテムについては、チェックリストを参照してください。 補足ファイル1に示されている。各項目とその用途については、以下のセクションで説明します。
    2. 補足ファイル1のコピーを印刷し、サンプリングキャンペーンの出発前に記入してください。
  2. バッグインボックスサンプリングシステムの準備
    1. バッグインボックスは、可能であれば、乗船前に実験室のドラフトの下に準備してください。3つの開口部(袋の開口部、袋を閉じるキャップの一部、蛇口の出口)をシールフィルムで密閉します(図3、 材料表)。
    2. キャップを取り外して内側に密封した状態で袋をしっかりと丸め、粘着テープで閉じて、輸送中に再び開かないようにします(図3)。
    3. この操作は、前述のシール操作中にバッグに空気を入れないようにして、(i)バッグに入る空気によって運ばれる汚染の可能性を回避し、(ii)折りたたまれたバッグ....

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結果

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説明されているようにプロトコルを実行すると、3 つのレプリカに FSS の数を乗算した数に等しい数のフィルターがオペレーターによって収集されます。各フィルターは、両面のうちの片面に生物学的痕跡(環境DNA)を保持します。eDNA抽出後の分析ステップは、研究課題、ターゲット、および目標に大きく依存します。たとえば、Valsecchiらによるパイロット研究では、9、記載されているeDNA収集プロトコルにより、複製可能で体系的な海洋巨大動物調査の設計が可能になりました。メタバーコードアプローチを使用し、分析する2つの異なる脊椎動物特異的マーカーを選択すると、いくつかの脊椎動物種(硬骨魚、エラスモブランチ、クジラ類)を検出することができました。これらの結果により、種の相対的な存在量(図13)とその空間分布を推測することができ、したがって、サンプリングされたルートとその栄養構造9に沿った脊椎動物群集の構成を再構築することができました。このアプローチで得られた海洋環境DNAは、生物のあらゆるグル.......

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ディスカッション

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プロトコルの手順はシンプルかつ簡単なため、商用フェリーで作業する際には考慮すべき関連考慮事項がいくつかあります。冷却水誘導パイプは通常、エンジンルームエリアにあり、アクセスが制限されたり、事前の許可が必要になったりする場合があります。したがって、適切な個人用保護具とともに、そのような許可を確実に取得することが極めて重要です (図 4)。さらに、汚染を避けるために、集水とろ過は可能な限り無菌状態で行う必要があります。サンプルの保存と移動、コールドチェーンの維持も、ろ過前に確認する必要がある重要なステップです。サンプルの輸送も容易になることを考慮して、収集後すぐにBiBに含まれる水をろ過することが常に望ましいです。ただし、不可能な場合は、サンプルの品質に影響を与えることなく最大2週間保存できます9。サンプルを効果的に保管するには、BiB を新鮮な場所に保管し、輸送中に太陽にさらされないようにする必要があります。さらに、ろ過中に失われやすくなる細胞外 DNA の放出につ.......

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開示事項

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著者らは開示するものは何もない。

謝辞

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ここで提示された方法のテストと開発を可能にしてくれた人々、つまり、地中海(および非地中海)のクジラ類をフェリーの密集したネットワークに依存して常に視覚的に監視するFLTプロジェクトを何十年にもわたって指揮してきたアントネッラ・アルカンジェリ(ISPRA)に深く感謝します。コルシカ島とサルデーニャ島のフェリーズのクリスティーナ・ピズッティは、熱意を持って挑戦を受け入れ、彼らの船団の空母で初めて方法論をテストするための後方支援を提供してくれました(撮影を行ったビデオメーカーの乗組員も歓迎しました)。Fulvio Maffucciは、船上サンプル収集の許可証を発行するために、さまざまな海事会社と取引しました。eDNAとフェリーの探索を開始した修士論文プロジェクトであるRoberto Lombardoに感謝します。最後に、LIFE-CONCEPTU MARISプロジェクトに関連して、地中海を渡るいくつかの異なる船舶(グリマルディライン、ミノアライン、ティレニア、バレアリア、コルシカ、サルデーニャフェリー、グランディナビヴェローチ(GNV))で私たちの方法をテストする機会を与えてくれた海事会社に感謝します。現在進行中のEU資金提供のLIFE-CONCEPTU MARISプロジェクトは、標準化された運用プロトコル(SOP)をより大きな科学コミュニティと一般の人々に広めることを可能にするこのビデオ出版物の制作に資金を提供することに加えて、アプローチの大規模な再現可能性の概念実証....

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
直径4.7cmフィルターメンブレンBiosigma S.p.A.https://www.biosigma.com/0.45 & muのフィルター膜;m 気孔率、個別包装&nBSP;
4/5 L真空フラスコデュランhttps://www.duran-bottle-system.com/5 Lガラスフラスコ ストッパー付き
吸収性紙パッドアドバンテック MFS, Inc.https://www.advantecmfs.com/category/absorbent-pads-1ろ紙吸収パッド、サイズ47mm。
バッグインボックス(BiB)GMV Agricenter S.r.l.https://www.gmvagricenter.it/10リットルの蛇口付きバッグインボックス
シリンダー ザルトリウスAGhttps://shop.sartorius.com/in/industrial-microbiology-filtration-devices/biosart-100-monitors/p/M_Biosart_100_Monitors#Biostart 100モニターシリンダー、0.45&μ;mメンブレン付属 
シーリングフィルムMerckhttps://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/sigma/hs234526a?utm_source=bing&utm_medium=
cpc&utm_campaign=all+product_
dsa_WW_%28bing+ebizpfs%29&
utm_id=626946489&utm_content=
1166583023365595&msclkid=
d2b55b82440b1aef56fc3ca803c
6486f&utm_term=%2Fproduct%2F		4インチ×125フィートの実験室用シーリングフィルムのロール
真空ポンプKNFグループhttps://knf.com/en/usLaboportポータブル真空ポンプN.96 
フィルター

参考文献

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  1. Andruszkiewicz, E. A., et al. Biomonitoring of marine vertebrates in Monterey Bay using eDNA metabarcoding. PLoS One. 12 (4), e0176343(2017).
  2. Djurhuus, A., et al. Environmental DNA reveals seasonal shifts and potential interactions in a ma....

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