方法論記事

浮体研究所:環境DNA分析のために運航フェリーから海水サンプルを収集およびろ過するための標準操作手順

DOI：

10.3791/67366

⸱

2025年8月1日

 , 
1Department of Earth and Environmental Sciences, University of Milano-Bicocca, 2Marine Research and Higher Education Center (MaRHE Center), 3National Biodiversity Future Centre (NBFC)

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、運航中のフェリーやその他の商船からの海水サンプルの収集とろ過を通じて海洋eDNAを回収するための新しいプロトコルを紹介します。

要約

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環境DNAの痕跡から情報を取得するための遺伝的ツールは、標的および分類学的に広範な生物多様性の特性評価の両方のために十分に確立されています。しかし、海洋の文脈では、深海や沖合など、アクセスの悪い場所からeDNAサンプルを収集することは依然として制限である可能性があります。広大な外洋を横断する定期フェリーや商船の使用は、環境サンプルを収集するための貴重な日和見的なプラットフォームを構成することができます。どんな気象条件でも、いつでもデータを収集できることから、経時的な再現性、ルートが一定であること、コストと燃料排出量の総削減まで、利点は数え切れないほどあります。これまでの研究では、このアプローチが可能であり、成功していることが示されています。ただし、これらの大型船舶の腹部からサンプルを取得するプロセスは、すぐには行われない場合があります。この作品は、大型船からの海水の収集とろ過がどのように準備され、手配され、実行されるかを詳細に示しています。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

過去数十年で、環境DNA(eDNA)の分析、つまり環境中の生物が残した遺伝物質の検出は、淡水および海洋動物のコミュニティの有望な監視ツールとして急速に成長しました。この分子技術は、単一のサンプル内の複数の分類群を同時に識別する可能性を提供し(メタバーコードアプローチ)、サンプリングされた領域に生息または横切る生物群集の検出を可能にします1,2,3,4,5。

現在、本当の課題は、大規模な地理的スケールにわたってサンプルを収集することは経済的および/またはロジスティック的に実行不可能であることが多いため、サンプリングスポットに到達することであり、その結果、遠洋地域は通常、よりアクセスしやすい沿岸地域と比較してサンプリングが不十分です6。フェリーやその他の商船を使用すると、通常、季節を通して一定であり、広い領域をカバーする特定の輸送ルートをたどるため、再現性の高いサンプリング横断面が可能になります 7,8。また、フェリー航路をサンプリング手段として利用することで、天候や海況に左右されず、四季折々に検体採取が可能となり、他にも多くのメリットがあります(図1)。予備研究により、生物多様性指数9,10を評価するための実現可能性と精度の両方が証明されています。水サンプルは、エンジンの上流の海洋冷却水を遮断する派生パイプを介してフェリーのエンジンルームから収集できます。LIFE-CONCEPTU MARIS (地中海におけるタセ類および遠洋海の保護: 持続可能性における回復のための行動の管理) は、この概念実証が大規模に実施された最初のプロジェクトです: 500 サンプルの収集 (2 年間以上) を目的としており、1 つではなく複数のフェリー会社と複数の運送業者が関与します。 重要な問題を強調し、サンプリング戦略を改良して、船上で遭遇する可能性のある最も多様な状況によりよく適応することができます。海洋環境DNAサンプルの大規模な収集に関連するコンポーネントについて、プロジェクトの特徴を以下に説明します(プロジェクトの説明については、https://webgate.ec.europa.eu/life/publicWebsite/project/details/5707 をご覧ください)。

定期フェリーを使用してサンプリングキャンペーンを実施するという決定は、実際のサンプリングの前に取らなければならないいくつかのアクションを意味しており、これはこの作業で直接取り上げられている側面です。ここでは、商船からの船上サンプリングに先立って行う必要があるアクションについて簡単に説明します。

これは見逃してはならない側面であり、収集キャンペーンの成功を左右します。海運会社は営利団体であり、研究機関ではないため、船上で実施されることを意図した科学研究の目的と目的に精通しておらず、その必要もありません。これは、提案された科学プロジェクトの目的が学際的である可能性があり、海運会社自体のトップマネジメントによって伝達され、動機付けられなければならない重要かつデリケートな初期段階を意味します。CONCEPTU MARISプロジェクトの特定のケースでは、これは、海運会社がすでに目視監視プロジェクト(固定線トランセクト[FLT]7など)に関与していた数十年にわたる関係によって可能になり、この作業の対象となるサンプリングアプローチに不可欠なエンジンルームへのアクセスのゴーサインを得るために必要な相互尊重の関係が決定されました。

CONCEPTU MARISプロジェクトで採用されているサンプリング体制の種類は2つあり、サンプルは固定サンプリングステーション(FSS、下記参照)と「珍しい」クジラ類の目撃の際に採取されます。これらは、FTLトランセクト11で最も目撃されない種、すなわち、一般的なイルカ(Delphinus delphis)、キュビエのくちばしクジラ(Ziphius cavirostris)、パイロットクジラ(Globicephala melas)、リッソイルカ(Grampus griseus)、マッコウクジラ(Physeter macrocephalus)およびナガスクジラ(Balaenoptera physalus)).追加の水サンプルは、目視国勢調査チーム(FLTチーム)によって報告された希少種の目撃がFSSの1つの前後に30分以上発生した場合にのみ収集されます。目撃情報に関連して実施されるサンプリングは、必然的にすべて日周的になります。

クルーズ中も地理的位置が不変のままである固定サンプリングステーション(FSS)は、事前に特定され、作業チーム全体と合意されます。FSS の地理的位置は、1) 以前の観察/文献データに基づく生物学的に関心のある場所の存在に従って選択されます。2)水深図上の生息地の変化を示すポイント(大陸棚の端など)に優先順位が与えられます。3)指定された航路を均一にカバーし、ルート全体をカバーし、夜間のサンプルの収集も予測するために、ほぼ等距離のサンプリングサイト(約35〜45海里離れた)を選択します。

隣接するサンプルが一日の異なる時間帯に採取され、2 つの連続したサンプルの間にサンプル処理が完了するのに十分な時間を確保するために、隣接する FSS からサンプルを採取することをお勧めします (往路と復路)。つまり、FSS がサンプリングされた時系列に従って番号が付けられている場合、マップ上に連続した順序で表示されません。たとえば、6 つの FSS が選択されている場合、往路では 3 つ、復路では 3 つがサンプリングされます。「地図上のルートに沿った順序は、PortAFSS1-FSS6-FSS2-FSS5-FSS3-FSS4-PortBで、イタリック体の3つのサンプリングステーション(FSS4、FSS5、FSS6)は帰路で調査されます( 図1を参照)。

各 FSS には一意の識別番号があります(つまり、異なるルートで識別された FSS のいずれも同じ識別番号を共有しません)。番号付けは、FSS が最初にサンプリングされたときに割り当てられ、連続した番号付けが続きます。したがって、プロジェクトの最後には、番号の少ないFSSは、数年間テストされたFSSまたは最も古いデータが利用可能なFSSになります。

各サンプルは、各サンプリングステーションで収集された約13Lの海水で構成されています。海水は、サンプル処理まで、フェリーの派生パイプから「バッグインザボックス」(BiB)容器、つまり滅菌ホイルラミネートビニール袋に直接デカントされます(以下を参照)。バッグインボックスサンプリングシステム(BiBSS)の特徴と利点は、Valsecchi et al. (2021)9 によって詳細に説明されており、便宜上、図 2 でも報告されています。

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プロトコル

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1. 実験室での準備

  1. ギアチェックリスト
    1. サンプル収集とサンプルろ過の両方のために機内に持ち込むアイテムについては、チェックリストを参照してください。 補足ファイル1に示されている。各項目とその用途については、以下のセクションで説明します。
    2. 補足ファイル1のコピーを印刷し、サンプリングキャンペーンの出発前に記入してください。
  2. バッグインボックスサンプリングシステムの準備
    1. バッグインボックスは、可能であれば、乗船前に実験室のドラフトの下に準備してください。3つの開口部(袋の開口部、袋を閉じるキャップの一部、蛇口の出口)をシールフィルムで密閉します(図3、 材料表)。
    2. キャップを取り外して内側に密封した状態で袋をしっかりと丸め、粘着テープで閉じて、輸送中に再び開かないようにします(図3)。
    3. この操作は、前述のシール操作中にバッグに空気を入れないようにして、(i)バッグに入る空気によって運ばれる汚染の可能性を回避し、(ii)折りたたまれたバッグがかさばるのを防ぐために(空気が含まれている場合)の両方を行います。

2. 機内での準備

  1. 乗組員との調整
    1. 乗船後すぐに、選択したサンプリングポイントを船長とその乗組員と共有し、「固定サンプリングステーション」(FSS)として選択された各ポイントにフェリーが最も近い時間が表示されるようにします。
    2. 各FSSのサンプリング時間と、そのルートのフェリーの現在(または利用可能な場合は平均)巡航速度を書き留めて、これにより、サンプリングされた海域の延長(km)を見積もることができます。
    3. フェリーがまったく同じ地点を通過することはないので、実際のサンプリング後に各海水サンプル採取の座標を修正してください。
      注:正確なサンプリング間隔は、実際にサンプリングされた海域を忠実に識別するための最も重要なデータです。したがって、実際のサンプリング座標を報告する大まかなポイントのマップを印刷すると便利です(補 足ファイル2など)。
    4. 会社がエンジンルームへの立ち入りを許可した場合は、ルームへのエスコートを依頼する。
    5. エンジンルームに入る前に個人用保護具(PPE)を着用してください。ここでは、環境は住みにくい(耳をつんざくような騒音と高温)、潜在的に陰湿なポイント(急な階段、床の大きな隙間)でいっぱいです。エンジンルームへの立ち入りの許可が得られたら、安全靴、ヘルメット、聴覚保護ヘッドフォンなど、必要な安全装備をすべて装備してください。
    6. ろ過面が運送会社によって提供されている場合 (通常は独自の折りたたみテーブルを用意することをお勧めします)、この領域が 10% 漂白剤溶液を使用してサンプル間で消毒できることを確認してください。
  2. エンジンルームに落ち着く
    1. 船にはさまざまな海水入口があるため、パイプに含まれる可能性のある物質や生物による水サンプルの汚染を最小限に抑えるために、船舶のパイプを通る取水の経路を最小限に抑える機関室管理者に相談してください。
    2. 流入する海水を収集するのに最適なポイント/入口が特定されたら、サンプル収集に使用されるパイプを「ローカル」水で継続的にすすぐために、クルーズ中ずっとサンプル収集蛇口をわずかに開いたままにしておくことができるかどうかをスタッフに尋ねます。蛇口から絶え間なく流れ出る海水はビルジに捨ててください。

3. 水サンプル採取(エンジンルーム内)

注: 図4 は、海水サンプル収集の段階を示しています。

  1. 集水の準備
    1. 必要なギアをすべて持参してください(最初の部分 補足ファイル1 チェックリスト)エンジンルームに。計画されたサンプリング時間の少なくとも15分前にエンジンルームに到着し、10%漂白剤溶液を使用してBiBが取り扱われる領域を滅菌します。
    2. クルーズ全体を通して専用の蛇口を開いたままにしていない場合は、海水サンプルの収集のために開け、実際の引き抜きの前に少なくとも5分間水を流します(水はビルジに捨てられます)(図4A)。
    3. フィルタリングステーションを準備します。
      注:ろ過の効率を大幅に向上させることができるろ過ステーションのセットアップには、いくつかの対策があります(ステップ4.3を参照):1)大容量の魔法瓶(2 L、4 L、または5 Lフラスコ、引き出す量に応じて)。これにより、1 Lから次のフラスコまでの間にフラスコを空にするのに必要な時間を節約できることに加えて、ろ過シリンダーの取り扱いが最小限に抑えられ、汚染が最小限に抑えられます。2)複数のフィルターフラスコを直列に並べて使用することができ、複数のサンプル(バッグ)を同時にろ過できる手段です。この対策は、ドッキングポートに到達する前にバッグを処理するために必要な時間がないリスクがあるタイトなサンプリング体制で推奨されます。
    4. 油性マーカーを使用して、BiBに書き込み、BiBを準備し、ラベルを付けます:1)BiBの両側にあるサンプルの一意の英数字識別コード(特にBiBが船上ですぐに処理されず、陸上でろ過される場合は重要です)2)日付。3) BiB の充填を開始する正確な時間。
  2. 集水
    1. BiBの開口部からシールフィルムを取り外し、完全にいっぱいになるまで(約13 L)充填を開始します(図4B)。
    2. バッグがほぼいっぱいになったら、蓋からシールフィルムを取り外しますが、蛇口の開口部からは取り外しません:ろ過までタップの安全固定(赤いプラスチックタブ)の周りのシールフィルムを維持します(図4C)。BiBを蓋で密封し、完全に閉じるまでしっかりと押します。
    3. サンプル採取が完了した正確な時刻をメモしておきましょう:サンプル採取の合計時間(分)を計算することができます。
  3. 集水後
    1. サンプル採取が完了した正確な時刻をBiBに油性マーカーで書き、サンプル採取/ろ過フォーム(補足ファイル2)にすべてのデータを報告します。
    2. 充填されたBiBを保管室またはろ過エリア(エンジンルーム自体またはキャビン内の専用スペース)に移します。
    3. サンプル収集/ろ過フォーム(補足ファイル2)のすべてのデータを転送します。
      注: 補足ファイル2は 、船上で完成するサンプル収集/ろ過シートのすべての部分を示しています。
      1. サンプルの採取に関する部分(緑)は、エンジンルームからの海水採取の開始時刻と終了時刻を入力します。
      2. 次に、乗組員またはGPS記録と相談した後、サンプリングの開始と終了と巡航速度を基準に地理座標を入力します。これにより、サンプリングされた海段の長さを後で計算できます。
        注:ろ過に関連する部分(青)に関しては、ろ過が船上で行われるか、その後陸上で行われるかが示されます:ろ過時間は3つのフィルターのそれぞれに表示されます。

4. 海水サンプルのろ過

  1. ろ過の準備
    注:この時点から、ろ過プロセスは、研究プロジェクトの特定の目的に基づいて、さまざまなプロトコルに従って管理できます。ここで説明するプロトコルは、大量の海水(10リットル以上)を船上で直接効率的にろ過することを可能にし、他の一般的に使用される市販のキットやプロトコルに固有の容量制約を回避します。可能であれば、船上で水サンプルをろ過します:ろ過は、エンジンルーム自体またはキャビン(できればエンジンルームの近く)で行うことができます。eDNAの分解を制限するため、また利便性のために、収集後すぐに海水サンプルをろ過することが常に望ましいため、処理する大量の海水で下船することを避けることができます。不可能な場合は、サンプルをバッグインボックス容器に保管し、輸送して後でろ過することができます。
    1. 機内(エンジンルームまたは専用キャビン)のろ過専用スペースで、 補足ファイル1のチェックリストの2番目の部分にリストされているすべてのものを準備し、 図5に示すようにろ過システムを組み立てます。
    2. 図6および図7に示すように、ろ過シリンダー(材料表)を準備します。ステーションごとに新しいシリンダー、新しい使い捨てピンセット、または滅菌済みピンセットを使用します。
      注:1つのシリンダーを複数回使用して、同じ場所からサンプルをろ過できます。ただし、10%漂白剤で滅菌した後、真水ですすぎ、実験室で自然乾燥させた後、次のキャンペーンまで保管するために単独で梱包する必要があります。
    3. ろ過を開始する前に、サンプル収集/ろ過データログ(補足ファイル2)に記入してください。これは、処理されたリットル数を追跡し、ろ過時間(サンプル中の微粒子の量を示す)を測定するために必要です。真空ポンプが作動したらすぐにタイマーを起動してろ過時間を測定します。
  2. 機内ろ過
    1. 汚染リスクを最小限に抑えるために(特に複数のバッグが同時に処理される場合、以下を参照)、蛇口とろ過シリンダーの間に断熱スリーブ(ビニール袋)を配置して、ろ過する水の流れを周囲の環境から隔離します( 図7を参照)。
      注:環境DNAの分析に使用される技術の感度により、アプローチは環境汚染(オペレーターまたはサンプル間の相互汚染)の影響を特に受けやすいため、これは重要な予防措置です。
    2. 真空ポンプを作動させ、各フィルターに最大4 Lの水をろ過します。空気がシステムに侵入し、ろ過プロセスが遅くなるのを防ぐために、ろ過中はシリンダーを常に満杯に保ちます。
      注:膜の気孔率の選択に関しては、これは研究の目的、対象分類群、および処理される予定の水の量によって異なります。この問題は、以前の作品9,12で扱われました。 異なる気孔率のフィルターが比較されました。脊椎動物の研究とフィルターあたり4リットルの水を処理する選択には、気孔率0.45μmの膜が最良の解決策であることが証明され、細孔の飽和によるフィルターの乱雑さを引き起こすことなく大量の水を処理することができました。
    3. フラスコ内のろ過水のレベルが4Lレベルマークに達したら、真空ポンプの電源を切り、タイマーを停止し、ろ過時間の値をデータログに報告します。
      注: 12/13 L の各 BiB から、それぞれ 4 L の 3 つの技術的複製 (A、B、および C という名前) が得られます。
    4. この時点で、ピンセット(および必要に応じて、フィルターの端を持ち上げるのに役立つ滅菌つまようじ)を使用して、 図8に示すように、最初のフィルター(フィルターA)をシリンダーから回収し、フィルターへの損傷を回避します。
    5. フィルターを半分に折り(生物学的材料を保持した側を折りたたんで)、アルミホイルで包み、すぐにサンプル番号とフィルター複製のID(たとえば、15A)をラッピングに書きます。下船するまで機内冷凍庫に保管してください。
    6. ろ過シリンダー内に新しいフィルター(フィルターB)を取り付けて、別の4 Lサンプルを処理します(図9)。フラスコを空にし、4 Lが完全にろ過されるまで、2回目の反復をろ過することからやり直します。説明どおりにフィルターBを回収し、フィルターCについても同じ手順を繰り返します。
  3. グッドプラクティス
    1. ろ過時間を短縮するには、1つのフィルターで処理されたすべてのろ過水を収容できる大型の魔法瓶を使用します(したがって、この場合は少なくとも4 Lの容量)。
    2. ろ過装置を並列に配置して複数のバッグを同時にろ過することにより、ろ過時間を大幅に短縮します(つまり、単一のポンプで複数の真空フラスコを供給します)。
      注:CONCEPTU MARISキャンペーンでは、両方の戦略が採用されました(図10)。ルートに沿って収集されるサンプルの数が多くなる可能性があるため、フィルタリング効率を最大化することが非常に重要です。したがって、船上で処理する時間が足りない場合にバッグを下船させなければならないリスクを伴うサンプルの蓄積を避けるために、バッグを短時間で処理する必要があります。
    3. 偽陽性(汚染)の発生率を監視するために、ろ過手順に、クルーズごとに少なくとも1回、「ブランクバッグ」を含め、密封されたボトルから採取した飲料水で満たされた袋をサンプルと並行してろ過します。この対照サンプルは反復を必要とせず、これを残りのサンプルとして扱い、NGSランに含めます。
  4. フィルターの保管と輸送
    1. ろ過後、すべてのフィルターを-4°Cから-20°Cの間で、さらなる実験室処理まで保管してください。
    2. 図11に示すように、下船直前に機内冷凍庫からサンプルを収集し、可搬式クーラーを使用して低温で輸送できるように準備します。
      注:サンプルが船上でろ過されていない場合、キャップを上面に保持して垂直に保管し、輸送を容易にするためにプラスチック製の箱内のショッピングバッグ内でペアで支えておくと、海水バッグはより安全に輸送されます(図12)。

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結果

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説明されているようにプロトコルを実行すると、3 つのレプリカに FSS の数を乗算した数に等しい数のフィルターがオペレーターによって収集されます。各フィルターは、両面のうちの片面に生物学的痕跡(環境DNA)を保持します。eDNA抽出後の分析ステップは、研究課題、ターゲット、および目標に大きく依存します。たとえば、Valsecchiらによるパイロット研究では、9、記載されているeDNA収集プロトコルにより、複製可能で体系的な海洋巨大動物調査の設計が可能になりました。メタバーコードアプローチを使用し、分析する2つの異なる脊椎動物特異的マーカーを選択すると、いくつかの脊椎動物種(硬骨魚、エラスモブランチ、クジラ類)を検出することができました。これらの結果により、種の相対的な存在量(図13)とその空間分布を推測することができ、したがって、サンプリングされたルートとその栄養構造9に沿った脊椎動物群集の構成を再構築することができました。このアプローチで得られた海洋環境DNAは、生物のあらゆるグル...

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ディスカッション

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プロトコルの手順はシンプルかつ簡単なため、商用フェリーで作業する際には考慮すべき関連考慮事項がいくつかあります。冷却水誘導パイプは通常、エンジンルームエリアにあり、アクセスが制限されたり、事前の許可が必要になったりする場合があります。したがって、適切な個人用保護具とともに、そのような許可を確実に取得することが極めて重要です (図 4)。さらに、汚染を避けるために、集水とろ過は可能な限り無菌状態で行う必要があります。サンプルの保存と移動、コールドチェーンの維持も、ろ過前に確認する必要がある重要なステップです。サンプルの輸送も容易になることを考慮して、収集後すぐにBiBに含まれる水をろ過することが常に望ましいです。ただし、不可能な場合は、サンプルの品質に影響を与えることなく最大2週間保存できます9。サンプルを効果的に保管するには、BiB を新鮮な場所に保管し、輸送中に太陽にさらされないようにする必要があります。さらに、ろ過中に失われやすくなる細胞外 DNA の放出につ...

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開示事項

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著者らは開示するものは何もない。

謝辞

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ここで提示された方法のテストと開発を可能にしてくれた人々、つまり、地中海(および非地中海)のクジラ類をフェリーの密集したネットワークに依存して常に視覚的に監視するFLTプロジェクトを何十年にもわたって指揮してきたアントネッラ・アルカンジェリ(ISPRA)に深く感謝します。コルシカ島とサルデーニャ島のフェリーズのクリスティーナ・ピズッティは、熱意を持って挑戦を受け入れ、彼らの船団の空母で初めて方法論をテストするための後方支援を提供してくれました(撮影を行ったビデオメーカーの乗組員も歓迎しました)。Fulvio Maffucciは、船上サンプル収集の許可証を発行するために、さまざまな海事会社と取引しました。eDNAとフェリーの探索を開始した修士論文プロジェクトであるRoberto Lombardoに感謝します。最後に、LIFE-CONCEPTU MARISプロジェクトに関連して、地中海を渡るいくつかの異なる船舶(グリマルディライン、ミノアライン、ティレニア、バレアリア、コルシカ、サルデーニャフェリー、グランディナビヴェローチ(GNV))で私たちの方法をテストする機会を与えてくれた海事会社に感謝します。現在進行中のEU資金提供のLIFE-CONCEPTU MARISプロジェクトは、標準化された運用プロトコル(SOP)をより大きな科学コミュニティと一般の人々に広めることを可能にするこのビデオ出版物の制作に資金を提供することに加えて、アプローチの大規模な再現可能性の概念実証を提供します。プロトコルの映像を提供してくれたMattia Nocciola氏とFrancesco Tommasinelli氏(Triton Research)に感謝します。最後に、過去5年間に私たちと交流し、サンプリングを支援してくれたすべての乗組員に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
直径4.7cmフィルターメンブレンBiosigma S.p.A.https://www.biosigma.com/0.45 & muのフィルター膜;m 気孔率、個別包装&nBSP;
4/5 L真空フラスコデュランhttps://www.duran-bottle-system.com/5 Lガラスフラスコ ストッパー付き
吸収性紙パッドアドバンテック MFS, Inc.https://www.advantecmfs.com/category/absorbent-pads-1ろ紙吸収パッド、サイズ47mm。
バッグインボックス(BiB)GMV Agricenter S.r.l.https://www.gmvagricenter.it/10リットルの蛇口付きバッグインボックス
シリンダー ザルトリウスAGhttps://shop.sartorius.com/in/industrial-microbiology-filtration-devices/biosart-100-monitors/p/M_Biosart_100_Monitors#Biostart 100モニターシリンダー、0.45&μ;mメンブレン付属 
シーリングフィルムMerckhttps://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/sigma/hs234526a?utm_source=bing&utm_medium=
cpc&utm_campaign=all+product_
dsa_WW_%28bing+ebizpfs%29&
utm_id=626946489&utm_content=
1166583023365595&msclkid=
d2b55b82440b1aef56fc3ca803c
6486f&utm_term=%2Fproduct%2F		4インチ×125フィートの実験室用シーリングフィルムのロール
真空ポンプKNFグループhttps://knf.com/en/usLaboportポータブル真空ポンプN.96 
フィルター

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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