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アデノ随伴ウイルス血清型8(AAV8)送達低分子ヘアピンRNAの脾腔内注射による肝臓における効率的な遺伝子ノックダウン

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DOI：

10.3791/67376

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2024年11月1日

 , 
1Institute of Biosciences and Technology, Texas A&M University Health Science Center, 2Department of Translational Medical Sciences, College of Medicine, Texas A&M University Health Science Center

この記事について

サマリー

このプロトコルは、AAV8送達small ヘアピンRNAの脾腔内注射が、門脈注射と同じ遺伝子ノックダウン効率を肝臓で達成する方法を説明しており、周術期および術後の死亡率と合併症がはるかに低い、より簡単な手順を表しています。

要約

肝臓は、重要な代謝機能を果たす主要な器官です。肝臓での遺伝子発現を効率的かつ安全にノックダウンする方法を開発することは、肝臓の病態生理学における遺伝子機能を決定するための重要なツールを提供します。本研究では、目的の標的遺伝子であるヌクレオステミン(NS)に対してsmall hairpin RNA(shRNA)を発現するように操作されたアデノ随伴ウイルス血清型8(AAV8)の脾腔内注射の方法について述べる。NSを標的とするshRNA(AAV8-shNS1)を発現するAAV8の脾腔内注射は、スクランブル配列shRNA(AAV8-shScr)を発現するAAV8の注射と比較して、門脈注射と同等の肝臓でのNSのノックダウン効率を達成しました。さらに、AAV8-shRNAウイルスの注射は、肝実質における最小限の炎症反応を引き起こしました。最も重要なことは、この脾腔内注射プロトコルは技術的に要求が厳しくなく、門脈注射を行う際の周術期および術後の死亡の主な原因である注射部位での出血を最小限に抑えたことです。この研究では、肝臓で効率的な遺伝子ノックダウンを達成するための改良された比較的安全な方法が報告されています。

概要

肝臓は、栄養素や化学物質を代謝する重要な器官ですが、細胞毒性や発がん性の障害にも常にさらされています。成人の肝臓は損傷後に再生することができますが、その再生力は1歳までに著しく妨げられます。今日まで、末期の慢性肝疾患または大規模な急性肝障害の患者に対する唯一の治療選択肢は肝移植であり、これには多くの課題があります2。目的の遺伝子の機能を調べることにより、肝臓の分子病態生理学をよりよく理解するために、RNAiを介したノックダウンやloxP部位の存在下でのCreリコンビナーゼによる標的欠失など、in vivoアプリケーション用の遺伝子操作が開発されました3。Cre-expressionカセットおよびshRNAコンストラクトは、ウイルスビヒクルで送達することができます。

アデノ随伴ウイルス血清型8(AAV8)は、選択的な組織タイプ(肝臓、骨格筋、心臓、脳、膵臓など)への遺伝子導入のための堅牢なベクターであり、高効率で炎症反応が少ない4,5。体内臓器を標的とするために、AAV8は一般的に尾静脈注射によって導入され、ウイルス粒子はまず肺を通過してから体循環に到達します。対照的に、門脈注射では、肺を循環する前に最初に肝臓に到達することができ、隔離と希釈の潜在的な原因となります。しかし、門脈注射は技術的に困難であり、手術による出血や高い死亡率によって複雑になることがよくあります。肝臓で効率的な遺伝子ノックダウン(KD)を達成し、術期/術後死亡率が高いという問題を回避するために、遺伝子操作されたshRNAを標的とするヌクレオステミン(NS)(AAV8-shNS1)を運ぶAAV8の脾腔内注射法をテストし、そのKD効率を門脈注射AAV8-shNS1のKD効率と比較しました。

NSは、最初に神経幹細胞で発見され、後に他のいくつかの種類の幹細胞や癌で発見された幹細胞/前駆細胞が豊富なタンパク質です6,7。NSの生物学的重要性は、in vivoの生殖細胞系NSノックアウト(NSKO)マウスの初期胚致死表現型3,8およびNSKDによるin vitroでの自己複製の摂動によって示されています9,10。成体動物では、精巣や再生中のいくつかの組織に高レベルのNS発現が見られ、これには、水晶体切除後の脱分化型イモリ色素上皮細胞や四肢切断後の筋細胞11、心臓損傷後のマウス心筋細胞12、肝障害後の肝細胞(CCl 4など)や外科的切除後の肝細胞などの再生哺乳動物組織(例えば、CCl4など)が含まれます。 肝部分切除術)13,14.さらに、NSは、乳腺、肝臓、および口腔腫瘍の発生に重要な役割を果たすことが示されています15,16,17。機構的には、NSは複製ゲノムをDNA損傷から保護することにより自己複製を促進することが示されています18,19。しかし、NSKO生殖細胞系の早期胚致死表現型により、成体臓器におけるNSKDの生物学的活性をさらに決定するためには、組織発生完了後にNSKDを一時的に導入する実験的方法が必要である。

この記事では、NSを例に、効率的で手順による死亡率が低い in vivo 肝臓遺伝子KD法の確立と試験について説明します。

プロトコル

この研究で完了したすべての動物実験は、ヒューストンのテキサスA&M大学健康科学センターの動物管理および使用委員会(IACUC)によって審査および承認され(承認番号:2021-0264-IBT)、関連するすべての規制および施設のガイドラインに従って実施されました。雌のC57BL/6Jマウス(生後4-5ヶ月、体重23-30g)を用いた。使用した試薬や機器の詳細は 、資料表に記載されています。

1. AAV8- shRNAの設計と製造

注:手続きの詳細については、Sands et al.4 を参照してください。

  1. 目的遺伝子のコード領域内の21ヌクレオチド長配列を標的とするデザインセンスおよびアンチセンスshRNAオリゴヌクレオチド。この場合、マウスNS(shNS1)とネガティブコントロールとしての21ヌクレオチドのスクランブル配列(shScr)を使用しました(図1A、下段)。
  2. ヘアピン構造には、TTCAAGAGAのステムループ配列、5'鈍末端、3'XhoI適合凝集末端、および5'-GAA CTA AAA CAG CAG CAG AAA-3'(shNS1)の遺伝子特異的標的センス配列、または5'-TCT CGC TTG GGC GAG AGT AAG-3'(shScr)のスクランブル配列が含まれます。
  3. オリゴヌクレオチドの各ペアをリン酸化し、アニールします。
  4. AAV遺伝子導入ベクター、AV5-siRNA-GFP(図1A、上段)をHpaIおよびXhoIと共に消化し、脱リン酸化し、ベクターフラグメントをゲル化します。
  5. アニーリングしたオリゴヌクレオチドをゲル精製ベクターにライゲーションします。
  6. ライゲーションされたDNA産物をサブクローニング効率で有能なDH5α細菌に形質転換します。
  7. アンピシリン耐性によって単一クローンを選択し、プラスミドミニプレップ用に100 mLの細菌培養物を増殖させます。シーケンシングにより正しいクローニングを確認し、市販のエンドトキシンフリーキットを使用してプラスミドを調製します(メーカーの指示に従ってください)。
  8. iMFectinトランスフェクション試薬を使用して、AV5トランスファーベクター、Rep/Cap血清型8、およびAdF6ヘルパープラスミドを293T細胞にトランスフェクションすることにより、AAV8ウイルスをパックします。合計40×15cmの皿をトランスフェクションし、トランスフェクション後3日目に収穫/消化しました。
  9. 細胞溶解により細胞関連AAV8を回収し、培地分泌型AAV8を40%PEGで沈殿させます。消化後、AAV8ウイルスを細胞溶解物と培地に混合し、不連続なヨージキサノール勾配で精製し、分子量カットオフ遠心分離ユニット(1,00,000 MW)に濃縮します。
  10. プライマーを用いた絶対エンドポイントqPCRにより、AAV8力価を定量します:WPRE-172(5'- TTTATGAGGAGTTGTGGCCC-3')およびWPRE-392(5'- CAACACACGGAATTGTCAG-3')。

2. AAV8の脾腔内注射(図1B、1C) 

  1. C57BL6/Jマウスを2%イソフルランと酸素で満たされた麻酔チャンバーに入れます(施設で承認されたプロトコルに従います)。意識を失った後、マウスを右横臥位で無菌手術領域に移します。2%イソフルランとノーズコーンを介して供給される酸素によって麻酔を維持します。
  2. 切開部位を2%クロルヘキシジンで滅菌し、続いて80%エタノールで滅菌します。6.3インチの医療用ハサミを使用して、左上腹部壁に15mmの切開を行い、続いて腹膜に10mmの切開を行います。
  3. 鉗子を使用して脾臓をそっと露出させ、臓器の下に置いた濡れたガーゼで所定の位置に保持します。
  4. AAV8ウイルス(50μL)を30秒かけて穏やかに混合し、先端を表面から3mmの深さに配置した30G針を使用して脾臓に注入します(図1B)。注射部位を綿棒で覆い、1分間圧縮します。
  5. 4-0吸収性のクロミック腸縫合糸で腹膜を縫合します。
  6. 4-0シルク縫合糸で腹壁と皮膚を閉じます。
  7. 電気ヒートパッドの上の清潔なケージにマウスを置き、回復するまで監視します。

3. AAV8の門脈注入

  1. イソフルラン吸入 (2%) と酸素を混合して C57BL6/J マウスに麻酔します (施設で承認されたプロトコルに従います)。
  2. 開腹術4,13を皮膚の正中線切開(~1インチ)から行い、次に腹膜に挿入します。
  3. マウスの左側に滅菌生理食塩水に浸した滅菌ガーゼパッドを置き、滅菌綿棒を使用して大腸と小腸を優しく引き出します。濡れたガーゼの上に腸を置き、皮膚に触れたり乾燥したりしないようにパッドで覆います。
  4. AAVウイルスを門脈に32Gの滅菌針で50μLの容量で注入します。針をポート静脈に3〜5mm5度未満の角度で挿入します。逆流を避けるために、血液が針を通り過ぎて5秒間流れるのを待ちます。
  5. 出血を避けるために、静脈全体が閉鎖され、出血がなくなるまで(約5分)穏やかな圧力で注射部位の上に滅菌綿棒の先端を置きます。
  6. 内臓をそっと腹腔に戻します。
  7. 4-0シルク縫合糸で腹壁と皮膚を閉じます。

4. qRT-PCR解析

  1. 製造元の指示に従って、市販のRNA単離試薬を使用して、50〜100 mgの肝臓組織4,13からRNAを抽出します(材料の表を参照)。
  2. 全RNAから1本鎖cDNAをランダムヘキサマーおよびM-MLV逆転写酵素20,21を用いて合成します。
  3. 以前に発表された報告22,23に従って、単色リアルタイムPCR検出システムとsupermix SYBRグリーン試薬を使用して、標的遺伝子と参照遺伝子との間のΔC(t)値を決定します。
  4. 4 回の生物学的反復と 3 回のテクニカル反復(n = 12)から ΔΔC(t) 値を測定します。すべての反応について、Tm を60°Cに設定します。2つの参照遺伝子、 Rps3 および Rplp0を使用して結果を確認します。
  5. プライマー配列を次のように設計します:Ns、5'-gtc tga tct agt acc aaa gg-3'および5'-ggg aaa cca atc act cca ac-3';Rps3、5'-atg gcg gtg cag att tcc aa-3 'および5'-cat tct gtg tcc tgg tgg c-3 ';Rplp0、5'-ctg aag tgc tcg aca tca ca-3' および 5'-agt ctc cac aga caa tgc ca-3'。

結果

脾臓内 と脾臓内による肝臓における遺伝子KDの効率AAV8-shRNAの門脈注入
AAV8ウイルスストックを、ミリリットル(gc/mL)あたり2E+12ゲノムコピー(gc)の使用濃度に希釈しました。個々のマウスに1E+11 gcのAAV8-shNS1またはAAV8-shScr(50 μL)を脾臓内または門脈注射 により 注射しました。注射の2週間後、RNA単離、1本鎖cDNA合成、およびqPCR分析のために肝臓組織を採取しました。その結果、脾腔内注射法は、 Rsp3 と Rplp0 を内部基準として用いた門脈注射法(16.3±3.6%)と統計的に同等のNSKD効率(20.8%±4.4%)を達成しました(図2)。さらに注目すべきは、脾腔内注射の施術は15分以内に完了し、施術による死亡がほとんどなかったのに対し、門脈注射法は通常、多くの練習で25〜30分かかり、死亡率が高い(死亡率~25%〜30%)と関連していたことです。

組織炎症反応
AAV8-shScr(図3A)またはAAV8-shNS1(図3B)の門脈注射または脾腔内注射を受けたマウスから肝臓組織を採取し、対照マウス(図3C)と比較しました。炎症反応はH&E染色4によって調べた。その結果、AAV8-shScrもAAV8-shNS1も、脾腔内注射(Spl)または門脈注射(PV)法のいずれかで注入されたPBSと比較して、肝実質で顕著な炎症反応を引き起こさなかったことが示されました(図3A-C)。

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図1:AAV8-shRNAの設計と脾腔内注入手順の図(A)(上)in vivoノックダウン実験用のアデノ随伴ウイルス血清型8(AAV8)を作製するために設計されたAV5-siRNA-GFPプラスミドの図。AV5-siRNA-GFPには、CMVプロモーター駆動型shRNA配列とEGFPが含まれています。(ボトム)マウスNS(shNS1)またはスクランブルされた21ヌクレオチド配列(Scr)上の21ヌクレオチド配列を標的とするために設計された小さなヘアピンRNAiコンストラクト。(B)脾腔内AAV8注入手順の概略ワークフロー図。(C)外科的処置の段階的なビュー。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:脾臓内注射と門脈注射による肝臓におけるAAV8-shRNAを介したヌクレオステミン(NS)のノックダウンの効率。 AAV8-shScrまたはAAV8-shNS1(1E + 11 gc)の脾臓内(Spl)または門脈(PV)注射を受けてから2週間後にマウスから採取した肝臓サンプルにおけるNS発現のqRT-PCRアッセイ。グラフは、Rps3 (A) と Rplp0 (B) の 2 つの内部コントロールを基準にした結果を示しています。バーは±それぞれが3回のPCRテクニカルリピートを持つ4つの生物学的複製の平均SEMを示しています。*p < 0.01;**p < 0.001;p < 0.0001 です。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:PBS、AAV8-shScr、またはAAV8-shNS1の脾腔内注射または門脈注射後の肝臓組織の組織学。 AAV8-shScr (A) または AAV8-shNS1 (B) の脾腔内注射 (Spl) または門脈注射 (PV) の 2 週間後における肝臓組織の H&E 染色を、対照の非 AAV8 注射サンプルと比較 (C) と比較。スケールバー:100μm。右側のパネルは、左側のパネルのインセットを拡大して表示しています。スケールバー:50μm。2つの異なる動物からの6〜9つの切片が各グループで調べられました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

野生型バックグラウンド24,25におけるshRNA発現コンストラクト24,25またはフロックスバックグラウンド26におけるCreリコンビナーゼ発現コンストラクトのいずれかのウイルス導入による遺伝子KDは、インビボでの遺伝子機能を誘導可能で時間制御された方法で調べる強力な方法である。in vivo遺伝子KO/KD研究の理想的な導入方法は、目的の臓器で高いKO/KD効率を達成し、さらに、手順自体が技術的に簡単で、術期/術後の死亡率が最小限であるべきです。

肝臓のような内臓の場合、ウイルス粒子は、尾静脈27または門脈28,29からの注射、または脾臓への直接注射(脾腔内注射)30,31によって導入することができる。門脈注射と脾腔内注射は、ウイルス粒子を門脈循環に導入し、それが下大静脈に入る前に肝臓に排出され、その後、肺循環に入ります。対照的に、尾静脈注射によって導入されたウイルス粒子は、門脈循環をバイパスして、体循環に到達する前に肺循環に入ります。肝臓など門脈循環を受けている臓器の場合、門脈注射と脾腔内注射は、肺に隔離されたり、体循環で希釈されたりすることなく、ウイルス粒子をそれらの臓器に直接送達できるという利点があります。脳など門脈循環を受けていない臓器の場合、尾静脈注射は、肺循環に到達する前にウイルス粒子を肝臓にさらさず、その後、体循環に到達するのに有益である可能性があります。

本研究では、AAV8-shNS1を1動物あたり1E+11 gcの用量で注射した結果、1E+10 gcと比較してKD効率が優れていましたが、ポータル内注射 により 5E+11 gcと同等のKD効果が得られました(データは示していません)。1E+11 gc の投与量で、門脈注入法と脾腔内注射法を比較すると、肝臓での NSKD 効率に統計的な差は見られず、70% から 80% の KD 効率が達成されました。肝臓における門脈注入AAV8の遺伝子KD効果は、コンストラクト依存的に最大6週間持続することがある23。特に、手術による出血や大網/腹膜の癒着などの手術関連の合併症、および技術的な困難は、門脈注射法と比較して脾腔内注射法の方が有意に少なく、低いです。その結果、門脈注射は1回行うのに対し、脾腔内注射は繰り返し行うことができる32。最後に、門脈注射またはAAV8-shScrまたはAAV8-NS1の脾腔内注射を受けた肝臓の実質では、炎症反応はほとんどまたはまったくありませんでした。しかし、最後の知見は、非常に高い力価のAAVが依然として実験結果を混乱させる炎症反応を引き起こす可能性を排除するものではありません。したがって、最適なAAV投与量は、KD効率とAAV8誘導反応との間で経験的に決定され、バランスをとる必要があり、異なる標的遺伝子および/または配列間で異なる可能性があります。結論として、これらの結果は、AAV8-shRNAの脾腔内注射が、肝臓で in vivo 遺伝子KDを達成するための非常に効率的で比較的安全で簡単な方法であることを示しています。

開示事項

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

この研究は、テキサス州がん予防研究所(CPRIT)のRYTのIndividual Investigator Research Award(RP200081)の支援を受けました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アミコンフィルター遠心分離ユニットMilliporeSigmaUFC9100高速限外ろ過
AV5-siRNA-GFP Addgene #124972プラスミド
コンピテントDH5&α;細菌 Invitrogen#18265-017ニング用の化学的にコンピテントな株 
HpaI ニューイングランド バイオラボR0105制限酵素
iMFectin トランスフェクション試薬 GenDepotI7100-101
M-MLV 逆転写酵素 PromegaM1708RNA依存性DNAポリメラーゼ 
MyiQ単色リアルタイムPCR検出システム Bio-RadBUN9740RADqRT-PCR
オメガエンドトキシンフリーキット BioteckD6915-03ミドDNAミディプレップ 
ランダムヘキサマー Invitrogen48190-011
スーパーミックス SYBR グリーン試薬 Bio-Rad1708882リアルタイム PCR アプリケーション
T4 DNA リガーゼPromegaM1801
TRIzol 試薬 Life Technologies15596-018高品質のトータル RNA
XhoINew England BiolabsR0146制限酵素
クロープラス の単離

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