方法論記事

CRISPR-Cas9リボヌクレオタンパク質複合体を介した遺伝子アブレーションを用いたマウスCD4 T細胞分化の検討

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DOI：

10.3791/67380

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2025年6月20日

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1Laboratory of Immune System Biology, NIAID, NIH

この記事について

サマリー

マウス未経験のCD4 T細胞におけるCRISPR-Cas9リボ核タンパク質複合体を介した遺伝子アブレーションを使用して、CD4 T細胞の分化における遺伝子機能を調査するための適応性の高いアプローチを概説します。

要約

クラスター化された規則的な間隔を空けた短い回文反復法(CRISPR)-Cas9技術が広く利用できるようになったため、初代細胞における遺伝子ターゲティングは、T細胞の遺伝子機能を評価するための日常的な方法となっています。ノックアウト(KO)マウス系統のコストと入手可能性が限られていることを考えると、遺伝子標的動物モデルを使用してT細胞の遺伝子機能に関する予備的な仮説を検証することは法外な場合があります。しかし、あらかじめ設計されたガイドRNA(gRNA)などの市販のリソースを使用することで、研究者はT細胞の活性化や分化研究に使用できる遺伝子標的ナイーブT細胞を簡便に作製することができます。

ここでは、ヌクレオフェクション送達CRISPR-Cas9リボ核タンパク質複合体(RNP)を使用して、CD4 T細胞の分化における遺伝子機能の評価に使用できるマウス未経験の遺伝子4 T細胞を効率的に生成するためのプロトコルを概説 します。マウスの二次リンパ器官からナイーブCD4 T細胞を単離し、続いてCas9-gRNA複合体でヌクレオフェクションを行うことで、下流のT細胞活性化前に遺伝子KOが開始されることが保証され、通常はT細胞の事前活性化を必要とするレトロウイルス媒介性gRNA送達よりも戦略的な利点が得られ、ナイーブT細胞での効果の評価を防ぐことができます。さらに、このヌクレオフェクションベースの方法は、遺伝子KO動物に関連する潜在的な発生問題を回避します。

Cas9-gRNA導入に続いて、 in vitro 分極を使用してCD4 T細胞のTh1、Th2、Th17、およびTreg系統への分化を研究するためのプロトコルについて説明します。さらに、このプロトコールは、 in vitro での他のT細胞活性化研究や in vivoでの養子移植研究など、多数のダウンストリームアプリケーションに遺伝子標的CD4またはCD8 T細胞を使用することに適応できます。CRISPR-Cas9法の使用により、T細胞の遺伝子機能を評価する能力が合理化され、関心のある多くの遺伝子のルーチンKOが可能になり、研究者は遺伝子KO動物の研究に関連する制限から解放されました。

概要

クラスター化された規則的な間隔を空けた短い回文反復法(CRISPR)ベースの技術の使用により、ゲノムDNA配列を操作する能力が変わり、無数の生物学的システムにおける遺伝子機能を研究する能力が大幅に向上しました。CD4 T細胞に関しては、CRISPR-Cas9リボ核タンパク質(RNP)複合体を利用する方法が登場し、初代ナイーブT細胞における効率的な遺伝子ノックアウト(KO)を促進し、in vitroおよびin vivo研究に利用できる1,2,3,4。CD4 T細胞の分化を調節する新しい推定遺伝子の同定は、トランスクリプトーム解析やエピゲノム解析によって推進されることが多く、特に遺伝子が複数の組織に影響を及ぼし、条件付き遺伝子標的マウスを用いた評価が必要な場合には、調査するためのリソースがほとんどないか入手が困難な新規ターゲットを生成します。gRNAのレトロウイルス形質導入による遺伝子ターゲティング5,6は、T細胞の遺伝子機能の評価に使用されてきましたが、レトロウイルス感染にはT細胞の活性化が必要であり、ナイーブT細胞の遺伝子を標的にすることはできません。ナイーブT細胞におけるヌクレオフェクション送達CRISPR-Cas9は、時間とコストのかかるマウスモデルに投資する前に、関心のある新しい遺伝子を検証および調査するための比較的安価で迅速な代替ツールを提供します。

ここで説明するプロトコルでは、CRISPR-Cas9を介した遺伝子編集は、ヌクレオフェクションを介してナイーブCD4 T細胞に送達されるガイドRNA(gRNA)分子と複合体化された組換えCas9タンパク質を使用して実行されます。gRNAは、トランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)とCRISPR RNA(crRNA)の2つの異なるコンポーネントで構成されています。機能的には、tracrRNA由来の配列はgRNAとCas9との会合を促進し、crRNA配列は目的の標的DNA領域に対する特異性を含んでいます。Cas9-gRNA複合体は標的二本鎖DNA(dsDNA)の切断を媒介し、gRNAはCas9エンドヌクレアーゼ活性の配列特異性を媒介します7,8。Cas9を介したdsDNAの切断は、標的細胞9における非相同末端結合に続くインデル変異の生成を通じて、遺伝子の不活性化をもたらす。このプロトコルでは、ナイーブCD4 T細胞で堅牢なKOを確保するために、目的の遺伝子を標的とする複数のgRNAを使用することをお勧めします。

ヘルパーCD4 T細胞は、免疫系の主要なプレーヤーであり、多くの免疫細胞タイプの機能を調節するさまざまなサイトカインの産生を通じて免疫応答を導きます。特定のサイトカインの存在下でT細胞受容体(TCR)を介して刺激すると、ナイーブCD4 T細胞は、Th1、Th2、Th17、および制御性T細胞(Treg)10,11,12を含むヘルパーT細胞(Th)CD4 T細胞の異なる系統に分化することができる。これらの異なるCD4 T細胞系譜を定義するのは、特定の系統を定義する転写因子(TF)とサイトカインの発現です(図1)。CD4 T細胞の分化は、in vitro分極13,14,15を用いてモデル化することができ、系統促進サイトカインの存在下でTCRを通じて活性化されたナイーブCD4 T細胞を使用し、不適切な系統採用を防止するブロッキング抗体を用いてモデル化することができる。

ナイーブCD4 T細胞におけるCRISPR-Cas9遺伝子ターゲティングと in vitro CD4 T細胞分極を組み合わせることで、これらの細胞の遺伝子機能を評価するための堅牢なシステムが提供されます(図2)。フローサイトメトリーによるCD4の分化を評価するための試薬が広く入手可能であることを考えると、TF発現やサイトカイン産生など、CD4 T細胞の分化の重要な側面は、ここで説明するプロトコルを使用して簡単に調べることができます。CD4 T細胞の機能を調節する新規遺伝子の同定により、これらの細胞の理解が深まり、CRISPR-Cas9法と in vitro 分極を組み合わせることで、遺伝子KOマウスモデルにコミットする前に遺伝子機能を評価するための堅牢なモダリティが得られます。

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プロトコル

ここで説明するすべての手順について、野生型(WT)C57/BL6Jマウスを使用しました。マウスは、NIAID(プロトコルLISB-22E)およびNIH(Animal Welfare Assurance #A-4149-01)の動物管理および使用委員会のガイドラインに従って、特定の病原体を含まない(SPF)条件下で維持および治療されました。

1. 開始前の考慮事項

  1. gRNA試薬の選択
    注:このプロトコルで使用されるマウスゲノムを標的とする設計済みgRNA試薬の入手については、 材料表 を参照してください。
    1. 目的の遺伝子を検索し(Table of Materials、Desired crRNAs)、上位3つのランク付けされたpredesign crRNA(2 nmolフォーマット)を選択します。さらに、並行して使用するネガティブコントロールcrRNAを入手します(材料表)。
      注:機能的なgRNAの形成には、crRNAとtracrRNAの二重化が必要です。tracrRNA試薬を入手し、セクション3の手順に従ってください。
    2. カスタムターゲットgRNA配列を設計します。
      注:カスタムターゲットgRNA配列の設計は、このプロトコルの範囲外ですが、CRISPick(Table of Materials)などの公開されているツールを使用して実行できます。
  2. バッファー、メディア、および機器
    注:特に断りのない限り、冷(4°C)の緩衝液と試薬を使用してください。
    1. 手順を開始する前に、MACSバッファー、FACSバッファー、0.5% Triton X-100バッファー、1x透過化バッファー、完全なRPMI培地、および完全なIMDM培地(材料表)を調製し、4°Cで保存してください。
    2. この手順を開始する前に、ナイーブなCD4 T細胞単離および抗FITCマイクロビーズキット(材料表)を入手してください。
    3. ヌクレオフェクションを開始する前に(セクション4)、5 mLの完全IMDM培地を予温(37°C)し、IL-7を添加した10 mLの完全IMDMを5 ng/μLで37°Cに温めて調製します(材料表)。ヌクレオフェクション後にサンプルあたり125 μLが追加されることを考慮して、必要に応じて予熱した培地の量を調整します。必要に応じて、核球化された細胞の数に基づいて、IL-7を含む完全なIMDMの量を調整します(セクション4)。
    4. 抗原提示細胞(APC)の単離を開始する前に、マイトマイシンCの2 mgバイアル(0.5 mg / mLストック濃度)に4 mLの滅菌H2Oを加えてマイトマイシンC試薬を調製します。
      注:組織培養フードですべてのステップを実行し、滅菌無菌技術を使用してください。

2. ナイーブCD4 T細胞の単離

注:ナイーブCD4 T細胞は、磁気分離または細胞ソーティングを使用して単離できます。磁気分離から得られる純度は通常97%で、細胞生存率は非常に高くなりますが、電子選別は細胞生存率を犠牲にして細胞の純度を向上させることができます。ここで説明するプロトコルでは磁気絶縁を使用しますが、どちらのシナリオにも適応できます。LSカラムが適切に準備されていることを確認します(資料の表)。

  1. マウス(ここで使用したWT C57BL/6Jマウス)から脾臓とリンパ節(鼠径部、上腕部、軸部、頸部)を分離します。
  2. 70 μmのスクリーンを60 mmのディッシュに入れ、処理された各組織について5 mLの完全なRPMI(Table of Materials)をセットします。リンパ節と脾臓をさまざまな皿で処理して、収量を増やします。3mLシリンジのプランジャーを使用して、フィルターを通して組織を穏やかに粉砕します。フィルターを1〜3 mLの培地ですすぎ、シングルセル懸濁液を15 mLのコニカルチューブに移します。
  3. 必要に応じて、追加のリンパ節と脾組織について手順2.2を繰り返します。
  4. シングルセル懸濁液を500 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
  5. 次のようにセルを数える準備をします。
    1. 脾のサンプルの場合は、上清を吸引し、細胞ペレットを1 mLのACK溶解バッファーに穏やかに再懸濁し、室温で2〜5分間インキュベートした後、2 mLの完全RPMIを添加し、スピンダウンし、5 mLの完全RPMIに再懸濁して、細胞をカウントします。
    2. リンパ節細胞の場合は、上清を吸引し、細胞ペレットを5 mLの新鮮な完全RPMIに再懸濁し、細胞をカウントします。
  6. ナイーブCD4単離キットへのインプットには、脾細胞をリンパ節細胞と混合して、単離のための所望の細胞数に到達します。
    注:通常、WT-B6マウス由来の1×108 リンパ節および脾臓細胞は、2〜8×106 ナイーブCD4T細胞を産生する。
  7. プールした脾臓細胞とリンパ節細胞を500 × g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を除去し、製造元のプロトコール(naïve CD4 T細胞単離キット)に示されているように、細胞ペレットを適切な容量のMACSバッファー(材料表)に再懸濁します。
  8. ナイーブCD4+ T細胞ビオチン抗体カクテル、抗ビオチンマイクロビーズ、およびCD44マイクロビーズを使用して、ナイーブCD4 T細胞をネガティブセレクション(材料表)で分離するメーカーのプロトコルに正確に従ってください。この単離にはLSカラムを使用し、細胞を15 mLのコニカルチューブに回収します。
  9. 単離後、細胞を500 × g で5分間、4°Cで遠心分離し、上清を除去し、細胞ペレットを2 mLの完全RPMI培地に再懸濁し、細胞をカウントします。
  10. ヌクレオフェクションを開始する準備ができるまで、細胞を4°Cで保存します。

3. Cas9-gRNA複合体の形成

注:ネガティブコントロールおよび遺伝子特異的crRNAストックを調製します。ネガティブコントロール条件には1つの固有のcrRNAを使用し、遺伝子標的条件には3つの固有のcrRNAを使用することを概説します。3つの異なるcrRNAを同時に使用することで、目的の遺伝子のKOが保証されます。

  1. 二本鎖バッファーを使用して、crRNAおよびtracrRNAをストック濃度100 μMに再懸濁します(材料表)。これは、RNA1 nmolあたり10 μLのバッファーに相当します。
  2. 滅菌PCRチューブ内で個々のcrRNAとtracrRNAを1:1の比率で組み合わせ、ピペッティングで混合します。サーモサイクラーで95°Cに5分間加熱します。次に、複合体をベンチトップで少なくとも10分間RTするまで冷まします。
    注: crRNA/tracrRNA二本鎖 は、この時点から gRNA と呼ばれます。複合体は、-20°Cで保存した場合、少なくとも6か月間安定です。 通常、1回のランで6 μLのgRNA(crRNA3 μL + tracrRNA3 μL)を作製し、約5サンプル(1 μL/サンプル)に十分な材料を提供します。
  3. 遺伝子標的gRNAの場合:滅菌PCRチューブに、3 μLのgRNA(ターゲットごとに3つの固有のgRNAをそれぞれ1 μL)、Cas9タンパク質1 μL、およびデュプレックスバッファー1 μL(サンプルあたり合計5 μL)を追加します。ピペッティングで静かに混合し、すべての材料がチューブの底にあることを確認します。室温で10分間インキュベートします。このステップのタイミングをヌクレオフェクションと同期させます(ステップ4.1-4.2)。
  4. ネガティブコントロールgRNAの場合:滅菌PCRチューブに、1 μLのgRNA、1 μLのCas9タンパク質、および3 μLのデュプレックスバッファー(サンプルあたり合計5 μL)を加えます。ピペッティングで静かに混合し、すべての材料がチューブの底にあることを確認します。室温で10分間インキュベートします。再度、このステップのタイミングをヌクレオフェクションと同期させます(ステップ4.1-4.2)。
    注:ネガティブコントロールに50 pmolのgRNAを使用する(テストに3 x 50 pmolを使用するのに対し)方が費用対効果が高く、結果に影響を与えません。

4. ヌクレオフェクション - Cas9-gRNAを介した遺伝子アブレーション

  1. 精製T細胞1-8 × 106 6を500 × g で5分間、ヌクレオフェクションサンプルあたり4°Cで遠心分離します。上澄みをできるだけ慎重に取り除きます。
  2. 細胞を20 μLのP3バッファー(16.4 μLのP3 + 3.6 μLのサプリメント/サンプル;Nucleofector Kit, Table of Materials)を添加し、懸濁液をCas9-gRNA複合体を含むPCRチューブに移します。16ウェルのヌクレオキュベットを混合し、独立したウェルに移します(Nucleofector Kit、 Table of Materials)。細胞をキュベットに移す際には、ヌクレオフェクション効率に悪影響を及ぼす可能性があるため、気泡が形成されていないことを確認してください。キュベットを作業台に軽くたたいて、すべての材料が各ウェルの底にあり、気泡がないことを確認します。
  3. 参照されたヌクレオフェクターのDN100プログラムを使用してヌクレオフェクションを実行します(材料の表)。直ちに125 μLの予熱済み完全IMDM培地をヌクレオクベットウェルに加え、細胞を1.5 mLの微量遠心チューブに移します。各ウェルを125 μLの予熱培地でさらに1回すすぎ、すべての細胞が確実に収集されるようにします。
  4. 細胞を500 × g で5分間、4°Cで遠心分離し、すべての培地を取り除き、温めた完全IMDM培地200 μL+5 ng/mL IL-7に再懸濁します(材料表)。
  5. 200 μLの細胞を培養プレートに移し、加温した完全IMDM培地+ 5 ng/mL IL-7を加えて、プレートサイズに応じて次のように最終的な所望の容量にします:48ウェルプレート上のウェルあたり1〜2 ×10個の6 細胞(ウェルあたり1 mLの培地)、24ウェルプレート上のウェルあたり2〜4個の×10個の6 細胞(ウェルあたり1.5 mLの培地)容量、 12ウェルプレートに1ウェルあたり4〜6×6細胞 10個(ウェルあたり2 mLの培地)、6ウェルプレートにウェルあたり6〜10個の6 細胞×6個(ウェルあたり4 mLの培地)にウェルあたり6〜10個入り。インキュベーター内で細胞を37°C、5%CO2 で3日間培養します。
    注:タンパク質の代謝回転と下流のアッセイに応じて、この培養期間を最適化します。最適な休息期間は3日間であることがわかりましたが、これはこれらの条件を使用して、ターゲット遺伝子に基づいて1〜7日間に調整される場合があります。
  6. IMDM培地+ 5 ng/mL IL-7で培養した後、ピペッティングで細胞を再懸濁し、15mLのコニカルチューブに回収します。細胞を500 × g で5分間、4°Cで遠心分離し、上清を除去し、細胞ペレットを1 mLの完全RPMI培地に再懸濁します。
  7. 細胞をカウントして、目的のgRNA核フェクト細胞に対応する生きたナイーブCD4 T細胞の数を決定します。
    注:ヌクレオフェクションの過程で、このプロトコルの過程で入力細胞の~50%を失うことを予想し、それに応じて使用されるナイーブCD4 T細胞の数を調整します。また、この時点で、さまざまな手法(フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、qPCR、またはT7EIアッセイ)を使用して、ナイーブCD4 T細胞における遺伝子ターゲティングの効率を試験することもできます。

5. 抗原提示細胞(APC)の単離

注:単離後のAPCの治療に使用されるマイトマイシン試薬が調製されていることを確認してください(材料表)。開始する前に、メーカーの抗FITCマイクロビーズプロトコルを読み、LSカラムが適切に調製されていることを確認してください(材料表)。

  1. APC分離用に指定されたWTマウスから脾臓を分離します。
  2. 上記のようにシングルセル懸濁液(2.2、2.5.1)をACK溶解バッファーで赤血球を溶解し、細胞ペレットを5 mLの完全RPMI(4°C)に再懸濁し、細胞をカウントします。
    注:APC単離後、入力細胞の数の約半分を得ることを期待し、例えば、1×108 の入力脾細胞は、~40〜50×106 APCsをもたらす。単離のために必要な数の脾臓細胞を準備します。
  3. 細胞を500 × g で5分間、4°Cで遠心分離し、細胞ペレットを800 μLのMACSバッファーに再懸濁します(材料表)。
  4. FITC標識抗CD4抗体と抗CD8抗体(材料表)を各4μLを脾細胞に加えます。よく混合し、4°Cで15分間インキュベートします。
  5. 細胞を500 × g で5分間、4°Cで遠心分離し、上清を除去します。製造元の指示に従って、推奨容量のMACSバッファーに細胞を再懸濁し、適切な量の抗FITCマイクロビーズを添加します(材料表)。
  6. 細胞を4°Cで15分間インキュベートします。細胞を500 × g で5分間、4°Cで遠心分離します。 細胞を500 μLのMACSバッファーに再懸濁し、製造元のプロトコルに記載されているように調製したLSカラムに細胞を通し、細胞を15 mLのコニカルチューブに回収します。
  7. 細胞を600 × g で5分間、4°Cで遠心分離し、上清を除去し、2.7 mLの滅菌1x PBSに細胞を再懸濁します。
    注:APCはペレット化が不十分な場合があります。遠心分離には速度を上げてください。
  8. 300 μLのマイトマイシンC溶液を細胞に添加して、最終濃度を50 μg/mLにします。よく混合し、インキュベーター内で37°Cの水浴で30分間または37°C、5%CO2 で45分間インキュベートします。
  9. インキュベーション後、細胞を600 × g で5分間、4°Cで遠心分離し、10 mLの滅菌済み1x PBSで洗浄します。真空を使用して、できるだけ多くの上清を取り除きます。洗濯を2回繰り返します。
  10. 細胞を再び600 × g で5分間、4°Cで遠心分離し、上清を除去し、細胞ペレットを5 mLの完全RPMI培地(4°C)に再懸濁します。セルを数えます。CD4 T細胞の分化を行う準備ができるまで、APCを4°Cで保存します。

6. CD4 T細胞の分化

注:このプロトコルは、48ウェルプレートフォーマット-2 × 105 ナイーブCD4 + 1 × 106 APC/ウェル-a 1:5の比率で細胞を培養するように設定されています。細胞は完全なIMDM培地で培養されます。ここでは、Th1、Th2、Th17、およびTreg CD4 T細胞の分化条件を提供します。ただし、ユーザーの焦点に応じて、個々の系統条件を選択することもできます。

  1. 48ウェルプレートで使用する細胞数を決定し、各細胞タイプに必要な細胞数を計算します。
    注:たとえば、10ウェルの場合、1:5の比率を維持するためには、2×106 ナイーブCD4と10×106 APCが必要です。セル数が許せば、めっき時のピペッティングエラーを考慮して、1つの追加ウェルに十分なセルを計算します。
  2. 必要な数のナイーブCD4とAPCを1:5で混合し、細胞を600 × g で5分間、4°Cで遠心分離し、上清を除去し、細胞ペレットをウェルあたり500 μLの完全IMDM培地に再懸濁します(例:5 mLの培地中の10ウェルに対応する細胞)。
  3. 細胞を500 μL刻みで48ウェルプレートのウェルにプレートし、各ウェルに2 × 105 ナイーブCD4 + 1 × 106 APCが含まれていることを確認します。
  4. 所望のCD4 T細胞分化条件については、 表1に記載されているように、完全なIMDMで2倍サイトカイン+抗体ミックスを調製します。2xミックス500μLを、以前に播種した500μLの細胞増分に加えて、試薬の最終濃度を1倍にします。
    注:これらの例は、2.5 mLの2x調製に基づいており、各条件で5つのウェルに十分な量です。繰り返しになりますが、試薬の量が許せば、ピペッティングエラーを考慮して、さらに2倍の混合物を1回増やします。
  5. 500 μLの2倍サイトカイン+抗体培地を500 μLのCD4/APC細胞含有ウェルに添加し、試薬の最終濃度を1倍にします。
  6. 48ウェルプレートを37°Cのインキュベーターに5% CO2を入れて置きます。細胞を72時間培養して、CD4分極の完了を可能にします。
    注:培養期間後にプレートを検査して、しっかりとした成長を確認します。培地はインキュベーション後にオレンジ色である必要があり、黄色の培地は細胞の過剰増殖の可能性を示します。

7. CD4 T細胞の分化における遺伝子アブレーションの影響の評価

注:すべての染色ステップについて、必要な染色バッファーに適切な希釈で添加した抗体のマスターミックスを調製します。サンプルごとに50 μLの抗体/バッファーカクテルが使用されます。実験に基づいて使用する特異的抗体を調整します。ユーザーは、特定の実験に関連する抗体パネルを選択する必要があります。ここでは、ここでターゲットとする遺伝子のコンテキストでこれにアプローチするためのテンプレートを提供します。

  1. CD4分化後、上清600μLを慎重に除去し、ピペッティングで各ウェルの細胞を再懸濁します。
  2. 各ウェルから200 μLの細胞を取り出し、転写因子染色のために標識された96ウェルプレートに添加します。500 × g で4°Cで5分間遠心してサンプルをペレット化し、上清をはじき取り、表面染色に進みます(ステップ7.5)。
  3. サイトカイン解析では、PMA(50 ng/mL)、イオノマイシン(500 ng/mL)、およびGolgi Stop(1/2,000希釈)で残りの200 μLの細胞を再刺激します。2x再刺激ミックス200 μLを各ウェルに加え、37°C、5% CO2 で4時間インキュベートします。
    注:48ウェルプレートには200μLが残っているはずです。したがって、PMA(2x、100 ng/mL)、イオノマイシン(2x、1 μg/mL)、およびGolgi Stop(2x、1/1,000)の2倍混合物を200 μL加えると、最終濃度は1倍になります(材料表)。
  4. その間に、転写因子の染色を開始します。サンプルあたり目的の蛍光色素標識抗体を含む50 μLのFACSバッファーに細胞を再懸濁することにより、表面抗原染色を行います(表2)。暗所4°Cで30分間インキュベートします。
  5. 各ウェルに150 μLのFACSバッファーを加えて、染色バッファーを洗い流します。プレートを500 × g で4°Cで5分間遠心分離します。 上澄みをはじき消します。合計2回の洗浄を繰り返します。
  6. 100 μLのFoxp3固定溶液(Table of Materials)で、室温の暗所で25分間細胞を固定します。
  7. 25分後、各ウェルに100μLのFACSバッファーを加えて、固定液を洗い流します。プレートを500 × g で4°Cで5分間遠心分離し、上清をはじき飛ばします。合計2回の洗浄を繰り返します。
  8. 細胞内染色を行うには、直接標識転写因子特異的抗体を含むサンプル(表2)を含む1x Foxp3透過化バッファー50 μLに細胞を再懸濁し、暗所4°Cで最低1時間放置します。
  9. 細胞内染色が完了したら、各ウェルに100 μLのFACSバッファーを添加します。プレートを500 × g で4°Cで5分間遠心分離し、上清をはじき飛ばします。合計2回の洗浄を繰り返します。フローサイトメトリーのために、細胞を最終容量200 mLに再懸濁します。
  10. PMA/イオノマイシン/ゴルジ剤の再刺激停止後、ピペッティングで細胞を再懸濁し、各サイトカインサンプル400μLを1.5mLの微量遠心チューブに移します。サンプルを500 × g で4°Cで5分間ペレット化し、上清を除去します。細胞サンプルを100 μLのFACSバッファーに再懸濁し、表面染色のために96ウェルプレートに移します。サンプルを再びペレット化し、500 × g で4°Cで5分間遠心し、上清をはじき取ります。
  11. 表面抗原に対する蛍光抗体を含むFACSバッファーで表面染色カクテルを調製します(表2)。サンプルあたり50 μLの染色バッファーに細胞を再懸濁し、暗所で4°Cで30分間インキュベートします。
  12. 各ウェルに150 μLのFACSバッファーを加えて、染色バッファーを洗い流します。プレートを500 × g で4°Cで5分間遠心分離します。 上澄みをはじき消します。合計2回の洗浄を繰り返します。
  13. 細胞を4% PFA(Table of Materials)の100 μLに室温で25分間固定します。
  14. 各ウェルに100 μLのFACSバッファーを加えて、固定液を洗い流します。プレートを500 × g で4°Cで5分間遠心分離します。 上澄みをはじき消します。合計2回の洗浄を繰り返します。
  15. 細胞内サイトカイン染色は、1サンプルあたり0.5% Triton X-100染色バッファーを含む抗サイトカイン抗体50 μL(表2)に細胞を再懸濁し、暗所4°Cで最低1時間懸濁します。
  16. 細胞内染色が完了したら、各ウェルに100 μLのFACSバッファーを添加します。プレートを500 × g で4°Cで5分間遠心分離し、上清をはじき飛ばします。合計2回の洗浄を繰り返します。フローサイトメトリーのために、細胞を最終容量200 mLに再懸濁します。
  17. 転写因子およびサイトカイン染色サンプルをフローサイトメトリーで解析します。
    注:概説された染色パネルから予想されるフローサイトメトリープロファイルは、代表的な結果セクションに表示されます。

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結果

ナイーブCD4 T細胞の純粋な集団が我々のプロトコル(セクション2)を用いて得られたことを検証するために、フローサイトメトリーを用いて、磁気単離の前後にこれらの細胞を同定した。我々のアプローチを用いて、単離後に高純度の生CD4+TCRb+CD25-CD44-CD62L+ナイーブCD4 T細胞の集団を得た(図3A)。さらに、Cas9-gRNA複合体がナイーブCD4 T細胞に首尾よく核形成されたことを確認するため(セクション4)、コントロール細胞およびCas9-gRNA処理細胞でフローサイトメトリーを行い、本プロトコールで使用したtracrRNAに付着した色素であるAtto550の蛍光を調べました(図3B)。私たちは、コントロールと比較して核形成細胞中のCas9-gRNA複合体の堅牢な検出を観察し、ナイーブCD4 T細胞へのRNP複合体の堅牢な侵入...

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ディスカッション

CRISPR-Cas9複合体をナイーブなCD4 T細胞に導入するためのプロトコルをCD4 T細胞の分化を研究する方法と統合することで、CD4 T細胞の生物学を調節する新規遺伝子を探索するための堅牢なツールが提供されます。ここでは、取り扱いが簡単な市販のCas9およびgRNA試薬を利用するための包括的なガイドを提供します。Naïve CD4 T細胞へのCas9-gRNA複合体のヌクレオフェクションを介した導入は、非常に効率的な遺伝子編集を提供し、目的の遺伝子のほぼ完全なノックアウトを促進します。さらに、 in vitro 分極CD4 T細胞のフローサイトメトリー解析により、系統分化の包括的な調査が可能になるだけでなく、CRISPRを介した遺伝子アブレーションを検証するための便利なツールとなります。

ここでは、Cas9-gRNA-nucleofected naive CD4 T細胞を in vitro CD4 T細胞分極の文脈で使用する方法について説明します。ただし、この...

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開示事項

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

謝辞

この研究は、NIAID、NIHの学内研究プログラムの支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.5 M EDTA、pH = 8.0IPM Scientific11005-016
16% パラホルムアルデヒド、PFA電子顕微鏡Sciences 15710PBSで希釈して4% PFA固定液を調製
1x eBioscience Buffer (1x 透過化バッファー)サーモフィッシャーサイエンティフィック00-5523-00キットの透過化バッファーを使用して1x 溶液を作製 1x
PBS、pH = 7.4品質生物学的114-058-101
2-メルカプトエタノール (1000x)Gibco21985-023
4D Nucleofector Core UnitLonzaAAF-1003B
4D Nucleofector X UnitLonzaAAF-1003X
60 mm dishFalcon353002
70 & micro;mのナイロン網のこし器Fisherbrand22363548
ACKのLysing緩衝液GibcoA10492-01
Amaxa P3の初代細胞4D-Nucleofector XのキットLonzaV4XP-3032このキットは下記のものを含んでいる: P3初代細胞の解決、補足1および16井戸のnucleocuvetteのストリップ
反FITCのmicrobeadsMiltenyi Biotec130-048-701Miltenyiの反FITCのMicrobeadsのプロトコルに従う
抗マウスCD28(37.51)bioXcellBE0015-1ストック濃度については表1を参照
抗マウスCD3e(145-2C11)bioXcellBE0001-1ストック濃度については表1を参照
抗マウスIFN&γ;(XMG1.2)bioXcellBE0055
マウス IL-12p40 (C17.8bioXcellBE0051抗
マウス IL-4 (11B11)bioXcellBE0045のストック濃度については表 1 を参照
BioLite 48 ウェル マルチディッシュサーモフィッシャー サイエンティフィック130187
ウシ血清アルブミン、BSAシグマ ライフScienceA3059
Cas9 enzymeIDT1081059Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 (10mg/mL) - 核局在配列を含む
Complete IMDM + IL-7 MediaComplete IMDM with 5 ng/mL IL-7
IMDM MediaIMDM+GlutMAX, 10% FBS, 1% L-Glutamine, 1% Pen/Strep, 0.1% BME
Complete RPMI 培地RPMI-1640、10% FBS、1% L-グルタミン、1% Pen/Strep、0.1%
BME CRISPickhttps://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public
所望の crRNA IDTはIDTのウェブサイトから事前に設計されています:https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_PREDESIGN  
eBioscience FOXP3/転写因子染色バッファーセットサーモフィッシャーサイエンティフィック00-5523-00キットには、固定/透過濃縮液(4倍)、固定/透過希釈液、透過化バッファー(10倍)
FACSバッファー1x PBS、1% FBS、1 mM EDTA
ウシ胎児血清(FBS)VWR Seradigm Life Science97068-085の3つの試薬が含まれています。使用前に熱を不活性化します(56°Cまで温めます。C 45 分間)
FITC 抗マウス CD4 (RM4-5)Biolegend1005101/200 希釈 (0.5 mg/mL ストック濃度)
FITC 抗マウス CD8&α;(53-6.7)Biolegend1007061/200 希釈 (0.5 mg/mL ストック濃度)
Golgi StopBD Biosciences51-2092KZ1/2000 希釈
IMDM (1x) + GlutMAX-1 MediaGibco31980-030
Streptomyces conglobatus 由来のイオノマイシンカルシウム塩 (1 mg/mL)Sigma Aldrich10634推奨最終濃度 500 ng/mL
L-Glutamine 200 mM (100x)Gibco25030-081
LS カラムMiltenyi Biotec130-042-401
MACS バッファー1x PBS、0.5% BSA、1 mM EDTA、フィルター滅菌マイ
トマイシン C (0.5 mg/mL)Millipore SigmaM4287-2MG 
マウスNaïve CD4 T細胞分離キットMiltenyi Biotec130-104-453Miltenyi Naïに従ってください。ve CD4 T細胞単離プロトコル。このキットにはNaïが含まれています。ve CD4+ T細胞 ビオチン抗体 カクテル、抗ビオチンマイクロビーズ、CD44マイクロビーズ
ネガティブコントロールcrRNAIDT1072544独自のネガティブコントロールを設計する代わりに
ヌクレアーゼフリーデュプレックスバッファーIDT1072570
PCRチューブストリップUSA Scientific1402-2700
ペニシリン ストレプトマイシンGibco15140-023
ホルボール12-ミリスチン酸13-アセテート、PMA(100 & micro;g/mL)Sigma AldrichP8139推奨最終濃度 50 ng/mL
ProSeries 高性能 15mL 遠心分離チューブアルカリ科学PS560015 mL コニカルチューブ
組換えヒト (h) IL-2Peprotech200-02ストック濃度については表1を参照
換えヒトTGF-b1 (HEK293由来)Peprotech100-21ストックについては表1を参照濃縮
組換えマウスIL-12p70Peprotech210-12ストック濃度については表1を参照
組換えマウスIL-4Peprotech214-14ストック濃度については表1を参照
換えマウスIL-6Peprotech216-16ストック濃度については表1を参照
換えマウスIL-7Peprotech217-17100 ng/mLで調製
RPMI 1640 MediaGibco21870-076
サーマルサイクラーApplied Biosystems4375786このモデルのサーモサイクラーを使用していますが、同様の機器はこのプロトコルでうまく機能します
tracrRNA Atto550 labeled IDT1075928Atto550蛍光をリードアウトとして使用して、ヌセロエフェクション後のCas9-gRNA複合体の検出を可能にします。可能であれば、この試薬をお勧めします。 
Triton-X バッファー1x PBS、0.5% TritonX-100、0.1% BSA
TritonX-100BioRad161-0407
非標識 tracrRNA IDT1072534より費用対効果の高いtracrRNAオプションですが、Cas9-gRNA複合体のヌセロフェクション効率の評価は許可されていません
Veriti Thermal Cycler, 96-well FastThermo Fisher Scientific4375305このモデルのサーモサイクラーを使用していますが、このプロトコルでは同様の機器がうまく機能します
のストリップ 抗) のストック濃度については表 1 を参照 Complete 組組 組

参考文献

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