このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

雌のショウジョウバエ・メラノガスター生殖幹細胞ニッチの長時間のライブイメージング

1.4K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/67389

⸱

2024年12月20日

 ,  , 
1Centro Andaluz de Biología del Desarrollo, CSIC/Universidad Pablo de Olavide/JA, 2Departamento de Genética, Facultad de Biología, Universidad de Sevilla

この記事について

サマリー

ここでは、ショウジョウバエの卵巣ニッチにおける生殖幹細胞(GSC)の非対称分裂のライブイメージングを行うための詳細なプロトコルを提供します。私たちは、スペクトロソームタンパク質Par-1の緑色蛍光タンパク質(GFP)融合を遍在的に発現するトランスジェニックラインを使用しています。

要約

ライブイメージング法は、動的な細胞プロセスを詳細かつリアルタイムで分析することを可能にします。ショウジョウバエの卵巣は、細胞分裂、幹細胞性、分化、遊走、アポトーシス、オートファジー、細胞接着など、無数の発生過程のダイナミクスを経時的に探求するための優れたモデルです。最近では、メスのショウジョウバエGSCニッチの拡張ex vivo培養とライブイメージングを実施しました。GFP::P ar-1導入遺伝子を持つショウジョウバエ系統を例にとると、この方法では、GSCのニッチ内での非対称分裂を可視化し、細胞周期に沿ったスペクトロソーム形態の変化を記述できます。ここでは、Drosophila germariaのex vivo培養の詳細なプロトコールを提示し、メスのGSCニッチの長期にわたる可視化を可能にします。重要なことに、このプロトコルは、ストックセンターやショウジョウバエの研究コミュニティで利用可能な複数の蛍光タグ付きタンパク質を持つライブイメージングGSCに広く適用できます。

概要

生物学的プロセスのライブイメージングは、直接的な実験的証拠を得るのに役立ちます。高度な共焦点顕微鏡と方法論の最適化の組み合わせにより、複数の生物学的事象を高精度で探索することができます。組織の操作と解剖、サンプルの調製と保存、顕微鏡撮影の設定などのプロトコルのステップを最適化することは、得られた結果の信頼性と堅牢性を最大化するために重要です。ここでは、特にショウジョウバエのメラノガスター卵巣に焦点を当てた拡張イメージングのためにサンプルを監視するためのプロトコルを紹介します。Drosophila melanogaster卵巣は、幅広い発生過程の解析のための優れたモデルシステムです。とりわけ、ショウジョウバエのこの生殖器官であるDrosophila melanogasterには、非常に明確に定義された成虫幹細胞ニッチが含まれています。このGSCニッチは、成人期の雌性配偶子の発達を維持します。ショウジョウバエの卵巣は約18個の卵巣で構成されており、ゲルマリウムに卵腔が発達しています。各ゲルマリウムの先端では、2-4個のGSCが、主に8-10個の細胞の末端フィラメント、5-8個のキャップ細胞のロゼット、および2-3個の前方エスコート細胞によって形成される体細胞ニッチに維持されています(図1A)。この体細胞ニッチは、GSCに、その幹細胞性を維持し、増殖を制御し、分化を防ぐために不可欠なシグナルと物理的サポートを提供します1,2,3,4,5.

GSCは通常、非対称に分裂して体細胞ニッチと接触し続ける新しい幹細胞と、体細胞キャップ細胞との直接の接触を失って分化する娘細胞である嚢胞芽細胞(CB)を生成します。GSCとCBには、非常に動的で細胞質のオルガネラであるスペクトロソームが含まれており、その主な機能は、有糸分裂中の有糸分裂紡錘体の正しい向きです6。CBは不完全な細胞質分裂で4回分裂して16細胞嚢胞を発症し、生殖細胞の1つが卵子に特異的になり、他の15細胞がナース細胞になります。CBスペクトロソームは、16セルの相互接続された生殖細胞をつなぐフューソームと呼ばれる分岐構造に成長します。このスペクトロソームは、セリン-スレオニンキナーゼPar-1や膜成分Hu-li tai shao(Hts)7などの小さな小胞や骨格タンパク質に富んでいます。GSC細胞周期中、スペクトロソームは新しい材料の追加によって成長し、その形状を変化させ、G1、S、G2、およびM相の同定を可能にします（図1B)8,9。

私たちは最近、最大16時間の生きたGSCのイメージングを可能にするショウジョウバエゲルマリウムのex vivo培養法を実装しました。これらの細胞は平均して15.5時間ごとに分裂するため8、この方法ではGSC細胞周期の大部分を撮影することができます。したがって、他のツールと組み合わせることで、私たちの培養方法は、GSC細胞周期中の分光体形態の記述と、in vivo8 (図1C)での異なる細胞周期の持続時間の分析を可能にしました。ここでは、この拡張ライブイメージング法の詳細なプロトコルを、その方法論を説明するステップバイステップのガイド付きビデオで提供します（図2)によってサポートされます。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

注:ステップ1.4は少なくとも2日前に行う必要があります。手順2.1と2.2は1日前に行うことができます。

1. 実験前の設定 I

  1. ストレプトマイシン/ペニシリン抗生物質ミックス(10,000 U/mLペニシリンおよび10 mg/mLストレプトマイシン)の100 μLアリコートを調製し、使用するまで-20°Cで保存します。
  2. オートクレーブ滅菌した純水を使用して15 mLの溶液を調製し、4°Cで保存し、1か月以内に使用してください:重炭酸ナトリウム(NaHCO3)0.1 M pH 8.0および0.1% Tween 20。
  3. 汚染を避けるために、層流フードに次の培地と溶液を調製します。滅菌済みのフィルターチップとチューブを使用してください。
    1. 希釈されていないウシ胎児血清(FBS)の2 mLアリコートを調製し、無菌条件で使用するまで-20°Cで保存します。
    2. 15%FBSと0.6%ストレプトマイシン/ペニシリン抗生物質ミックスを添加したシュナイダーのショウジョウバエ培地を準備します。7 mLのアリコートを調製し、4°Cで保存します。1つのアリコートは、2つのMatTekプレートに十分です(セクション2を参照)。
      1. リンゲル溶液(128 mM NaCl、2 mM KCl、1.8 mM CaCl2、4 mM MgCl2、35.5 mM スクロース、5 mM Hepes、オートクレーブ純水中、pH 6.9)を調製します。1 mLのアリコートを調製し、使用するまで-20°Cで保存します。
  4. GFP(ポリユビキチン-mGFP6::p ar-1ライン)に融合したPar-1タンパク質を構成的かつ遍在的に発現する生後1〜2日齢のハエを、酵母粉末を添加したフライフードを含む新しいチューブに集めます。インキュベーターで25°Cで2日間培養してから解剖してください.
    注:このステップは、蛍光タグが付けられた関心のある任意のレポーターで実行できます。

2. ガラス底板のコーティングと準備

  1. 35 mmポリD-リジンコーティングプレート(ガラス底皿、材料表参照)のカバーガラスの中央に、特定のCell-Tak接着剤(以下、細胞および組織接着剤)を3 μL滴ずつ塗布します。滅菌チップを使用してください.
    注:細胞および組織接着剤は4°Cで保存する必要があります。2つの遺伝的条件(通常は対照条件と変異条件)を用いた実験の場合、同じガラス底板に、十分に分離された2滴の接着剤を別々に滴下します。これにより、両方の遺伝的背景が同じ条件で画像化されるようになります。
  2. その直後に、メーカーが推奨するように等量(このプロトコールセットアップでは3 μL)の0.1 M NaHCO3 pH 8.0を3 μLの接着剤滴に慎重に加え、ピペッティングで混合します。
  3. 完全に蒸発させるには、プレートを室温(RT)で20分間インキュベートし、4°Cで一晩保存して翌日使用します。あるいは、調製したプレートを37°Cで25分間インキュベートし、完全に蒸発するまでインキュベートし、直接次のステップに進みます。どちらの場合も、プレートをカバーで維持します。滅菌チップを使用してください。
  4. 準備したガラス底皿をベンチに15〜20分間置いて、RTに到達させます。
  5. 用意したプレートを3回丁寧に洗います。接着剤層に触れたり、邪魔したりしないでください。各洗浄で、6 μLのオートクレーブ滅菌純水を加え、3回の洗浄のそれぞれできれいなチップを使用して水を取り除き、NaHCO3溶液の残留物を除去します。
  6. ほこりの粒子を避けるために蓋をして5〜10分間解剖しながら、清潔で準備されたプレートをRTに置いて、水を完全に蒸発させます。

3. ショウジョウバエ卵巣解剖と卵巣の分離と装着

注:卵巣解剖は、サンプル組織の接着剤への付着を妨げる可能性のあるタンパク質の存在を防ぐために、FBSを含まないリンガー溶液(シュナイダー培地の代わりに)で行われます。

  1. 開始する前に、3ウェル解剖皿、鉗子、および解剖針を70%エタノールで洗浄します。
  2. 3つのウェルのそれぞれに十分な容量(~200 μL)のリンゲル溶液を加えます。
  3. 2対の鉗子の助けを借りて、最初のウェルで200μLのリンゲル溶液中の5人の酵母栄養雌の卵巣を、標準的な手順に従って解剖します10,11。胸部と腹部の交差点にあるショウジョウバエの女性を鉗子の1つでつかみます。次に、後腹部のキューティクルをそっと引き裂き、2つの卵巣が露出するまで腹部のキューティクルを引っ張ります。
  4. 解剖した卵巣をセカンドウェルに移し、他の組織の残骸や解剖による破片による汚染を減らします。
  5. 発光ダイオード(LED)照明と細かい点の鉗子を備えた実体顕微鏡(ズーム8X-13.5X)を使用して、15〜20個の卵巣の筋肉鞘を取り外します。1組の鉗子を使用して卵巣の全身を固定し、2番目の鉗子を使用して後期の卵室をスムーズにつかみ、筋肉が壊れて遅れるまでゆっくりとストレッチします
    注:卵巣のこの部分との接触を減らすだけで、胚葉への損傷を避けることが不可欠です。ステージ8〜9より古い卵室を取り外します。
  6. 鉗子を使用して、15-20筋シースフリー卵巣を1つずつ、200μLのリンガー培地を含む3番目のウェルに移します。
  7. ピペッティングにより、20-200 μLチップを0.1% Tween 20で事前に湿らせます。これにより、卵子が先端のプラスチック壁に付着するのを防ぎます。
  8. 筋被覆のない卵巣を含むリンゲル液6μLを、あらかじめ濡れた先端を使用して、調製した接着プレート(RTに保持)に移します
    注:卵巣沈着後のゲルマリアの剥離を防ぐために、先端と接着剤層との間の接触をすべて避けてください(次のステップ)。ゲルマリアの約30%が思ったように癒着しません。
  9. 転写された卵巣が接着面に付着するように、解剖針または鉗子を使用して接着面に接触するまで、リンガードロップの底まで慎重に押し下げます
    注:卵巣が落ち着いたら、卵巣を再配置しようとしないでください。
  10. 15%FBSと0.6%ストレプトマイシン/ペニシリン抗生物質ミックスを添加したシュナイダーの培地3mLをMatTekプレートに慎重に充填します(ステップ1.3)。卵巣の剥離を防ぐため、プレートの外縁に1mLずつゆっくりと加えます。
  11. 筋肉鞘のない卵巣を平らな面に載せたプレートを顕微鏡ステーションに運びます。

4. 共焦点顕微鏡を用いたライブイメージング

  1. スピニングディスク顕微鏡または共焦点顕微鏡(同様の装置も使用可能)の63倍対物レンズにプレートを置き、サンプルの焦点を合わせます。各ガーマリウムの中央の z 平面を選択します。
  2. 次の実験パラメータを設定します:キャプチャタイプ:3Dタイムラプス、レーザー出力を70/100に調整、励起波長:488 nm、Zスタックの範囲:30 μm、Zスタック間の距離:1.2 μm、持続時間:17時間、時間間隔:10分ごと。
  3. 可能な場合は、マルチポジションオプションを使用して、サンプルのXY座標を再定義し、Zスタックがこの位置の中央に配置されるため、各ゲルマリウムの中央にあるZ平面を選択します。取得を開始します.
    注:ゲルマリウムの通常の幅は30μmであるため、各Zスタックは~25-27セクションになります。共焦点にもよりますが、10分間隔で少なくとも25個のゲルマリアを画像化できます。通常、40x/1.30 NAまたは63x/1.40 NAの油浸プラナポ補正対物レンズが使用されます。
  4. ImarisまたはImageJ(フィジー)ソフトウェアを使用して、時間とZ軸で画像を解析し、スペクトロソーム形態の特定の変化を視覚化します12,13。それらの観測の特定の時間が表示されます (図 1B')。ムービーをマウントするには、各時点で最適な Z 平面を手動で選択します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

この拡張ライブイメージングプロトコルを用いることで、生物学的な乱れを与えることなく、ニッチ内における雌性GSCの非対称有糸分裂を記録することが可能です。この目的のため、GFP::Par-1タンパク質を普遍的に発現する生殖巣を使用します。これにより、GSCの細胞周期を通じて、Round、Plug、Bar、Fusing、Exclamation pointという5つの明確なスペクトロソーム形態を区別することができます（Figure 1B,C）。より詳細に説明すると、Round-G2スペクトロソームの強いGFP:Par1シグナル（Figure 1C、パネルa）は、G2-M-G1期に劇的に減少することが観察されました。重要な点として、このトランスジェニック株の使用により、GSCの有糸分裂への進入を可視化できることです。これは、前期の初期にほとんどのGFP::Par-1がスペクトロソームから離脱し、細胞質を満たすためです（Figure 1C

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

ここでは、ショウジョウバエメラノガスターGSCニッチを最大16時間の長期間監視するためのプロトコルを提示します。ショウジョウバエの生物学的プロセスをex vivoで撮影するためのプロトコルのほとんどは、より短い時間枠に焦点を当てており、複数の例は、想像上の翼ディスク15、16、17、胚性腺18、19、または卵巣20、21、22、23に見られます.確かに、画像取得の期間は、精査されている発達プロセスによって異なります。一過性事象は、...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

原稿に対する有益なコメントをいただいたAcaimo González Reyes氏とMaría Olmedo López氏に感謝します。本研究は、PID2021-125480NB-I00 (H. S-G)、Junta de Andalucía (J. G-M) の "Ayudas a la contratación de personal Investigador Doctor"、VI and VII PPIT-Seville University (P. R-R) の "Ayuda a proyectos de investigación precompetitivos"、VI PPIT-Seville University (P. R-R) の "Contrato de Acceso de I+D+i" の支援を受けました。私たちは、元の出版物(doi:10.1242/DEV.199716)から改変された画像を共有する権利を提供してくださったCompany of Biologists Ltd

に感謝の意を表します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
9ウェルガラスプレートコーニング 7220-85n/a
塩化カルシウム二水和物Sigma AldrichC3881CaCl2·2H<サブ>2O;リンゲル溶液の調製には
、Cell-TakCorning 354240プラスチック、ガラス、金属、FEPポリマー、生体材料など、さまざまな種類の表面に細胞や組織切片を接着するために使用される細胞および組織接着剤。
デュモン#5鉗子 ファインサイエンス11252-20該当なし
デュモン #55 鉗子 ファインサイエンス11255-20寸法 0.05 mm x 0.02 mm、長さ 11 cm
ウシ胎児血清Gibco10500-064認定、熱不活性化、EU 承認、南アメリカ原産地 
ガラス底皿MatTekP35GC-1.5-10-C35 mm皿、No.1.5カバースリップ、ガラス径10 mm、 ポリ-D-リジンコーティング
HEPESSigma AldrichH4034リンゲル液を調製するには
マグネシウム シグマ アルドリッチM1028MgCl2;リンガー溶液を準備するには
、ニードルホルダーRoboz RS-6061軽量、中空ステンレス製ハンドル、長さ 4 3/4 インチ。
ニコン SMZ18 双眼鏡 Nikonhttps://www.microscope.
healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific1514012210,000 U/mL
塩化カリウムSigma AldrichP3911KCl;リンガー溶液を調製するには
、シュナイダーのショウジョウバエミディアムバイオウエスト L0207昆虫細胞用細胞培養液
重炭酸ナトリウムSigma AldrichS8875 NaHCO3; ≥99.5%、粉末
ナトリウムSigma AldrichS9888NaCl;リンガー溶液を調製するには、
ショ糖シグマアルドリッチS9378≥99.5%(GC);リンガー溶液を調製するにはタングステン
解剖ニードルロボズ RS-60640.25 mm、超微細、1ミクロンチップ(Pk 10)
Tween 20Sigma AldrichP9416for molecular biology、粘性液体
酵母粉末ΣAldrich51475n / a
塩化塩化

参考文献

  1. Li, L., Xie, T. Stem cell niche: structure and function. Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 605-631 (2005).
  2. Drummond-Barbosa, D. Local and physiological control of germline stem cell lineages in Drosophila melanogaster. Genetics. 213 (1), e234(2019).
  3. Eliazer, S., Buszczak, M. Finding a niche: studies from the Drosophila ovary. Stem Cell Res Ther. 2 (6), 45(2011).
  4. Rojas-Ríos, P., Guerrero, I., González-Reyes, A. Cytoneme-mediated delivery of Hedgehog regulates the expression of bone morphogenetic proteins to maintain germline stem cells in Drosophila. PLoS Biol. 10 (4), e1001298(2012).
  5. Rojas-Ríos, P., González-Reyes, A. Concise review: the plasticity of stem cell niches: a general property behind tissue homeostasis and repair. Stem Cells. 32 (4), 852-859 (2014).
  6. Deng, W., Lin, H. Spectrosomes and fusomes anchor mitotic spindles during asymmetric germ cell divisions and facilitate the formation of a polarized microtubule array for oocyte specification in Drosophila. Dev Biol. 189 (1), 79-94 (1997).
  7. Huynh, J. R., Shulman, J. M., Benton, R., St Johnston, D. PAR-1 is required for the maintenance of oocyte fate in Drosophila. Development. 128 (7), 1201-1210 (2001).
  8. Villa-Fombuena, G., Lobo-Pecellín, M., Marín-Menguiano, M., Rojas-Ríos, P., González-Reyes, A. Live imaging of the Drosophila ovarian niche shows spectrosome and centrosome dynamics during asymmetric germline stem cell division. Development (Cambridge). 148 (18), dev199716(2021).
  9. De Cuevas, M., Spradling, A. C. Morphogenesis of the Drosophila fusome and its implications for oocyte specification. Development. 125 (15), 2781-2789 (1998).
  10. Wong Li, C., Schedl, P. Dissection of Drosophila ovaries. J Vis Exp. (1), 52(2006).
  11. Merkle, J. A. Dissection, fixation, and standard staining of adult Drosophila ovaries. Methods Mol Biol. 2626, 49-68 (2023).
  12. Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  13. Miura, K. Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences. F1000Res. 9, 95(2020).
  14. Duan, T., Cupp, R., Geyer, P. K. Drosophila female germline stem cells undergo mitosis without nuclear breakdown. Curr Biol. 31 (7), 1602-1610 (2021).
  15. Aldaz, S., Escudero, L. M., Freeman, M. Live imaging of Drosophila imaginal disc development. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (32), 14217-14222 (2010).
  16. Dye, N. A. Cultivation and live imaging of Drosophila imaginal discs. Methods Mol Biol. 2540, 275-285 (2022).
  17. Sohr, A., Du, L., Roy, S. Ex vivo Drosophila wing imaginal disc culture and furin inhibitor assay. Bio Protoc. 9 (16), e3336(2019).
  18. Anllo, L., Plasschaert, L. W., Sui, J., DiNardo, S. Live imaging reveals hub cell assembly and compaction dynamics during morphogenesis of the Drosophila testis niche. Dev Biol. 446 (1), 25-34 (2019).
  19. Gärthner, S. M. K., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. Ex vivo culture of Drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment. J Vis Exp. 91, e51868(2014).
  20. Wilcockson, S. G., Ashe, H. L. Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically receive and attenuate BMP signaling. Dev Cell. 50 (3), 296-310 (2019).
  21. Jackson, J. A., Imran Alsous, J., Martin, A. C. Live imaging of nurse cell behavior in late stages of Drosophila oogenesis. Methods Mol Biol. 2626, 191-206 (2023).
  22. Díaz de la Loza, M. C., Díaz-Torres, A., Zurita, F., et al. Laminin levels regulate tissue migration and anterior-posterior polarity during egg morphogenesis in Drosophila. Cell Rep. 20 (1), 121-133 (2017).
  23. Christophorou, N., Rubin, T., Bonnet, I., Piolot, T., Arnaud, M., Huynh, J. R. Microtubule-driven nuclear rotations promote meiotic chromosome dynamics. Nat Cell Biol. 17 (11), 1388-1398 (2015).
  24. Bers, D. M. Cardiac excitation-contraction coupling. Nature. 415 (6868), 198-205 (2002).
  25. Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).
  26. Zielke, N., Korzelius, J., van Straaten, M., et al. Fly-FUCCI: a versatile tool for studying cell proliferation in complex tissues. Cell Rep. 7 (2), 588-598 (2014).
  27. Hinnant, T. D., Alvarez, A. A., Ables, E. T. Temporal remodeling of the cell cycle accompanies differentiation in the Drosophila germline. Dev Biol. 429 (1), 118-131 (2017).
  28. Hsu, H. J., LaFever, L., Drummond-Barbosa, D. Diet controls normal and tumorous germline stem cells via insulin-dependent and -independent mechanisms in Drosophila. Dev Biol. 313 (2), 700-712 (2008).
  29. Andersen, D., Horne-Badovinac, S. Influence of ovarian muscle contraction and oocyte growth on egg chamber elongation in Drosophila. Development (Cambridge). 143 (8), 1375-1382 (2016).
  30. Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps. Dev Biol. 314 (2), 360-372 (2008).
  31. Ables, E. T., Drummond-Barbosa, D. Cyclin E controls Drosophila female germline stem cell maintenance independently of its role in proliferation by modulating responsiveness to niche signals. Development (Cambridge). 140, 4267-4276 (2013).
  32. Lin, H., Spradling, A. C. Germline stem cell division and egg chamber development in transplanted Drosophila germaria. Dev Biol. 159 (1), 140-152 (1993).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

ショウジョウバエ生殖系列幹細胞ニッチex vivo培養生殖系列幹細胞非対称分裂スペクトロソームダイナミクス共焦点顕微鏡法蛍光タンパク質タグ付け細胞周期解析
雌のショウジョウバエ・メラノガスター生殖幹細胞ニッチの長時間のライブイメージング
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。