雌のショウジョウバエ・メラノガスター生殖幹細胞ニッチの長時間のライブイメージング

生物学的プロセスのライブイメージングは、直接的な実験的証拠を得るのに役立ちます。高度な共焦点顕微鏡と方法論の最適化の組み合わせにより、複数の生物学的事象を高精度で探索することができます。組織の操作と解剖、サンプルの調製と保存、顕微鏡撮影の設定などのプロトコルのステップを最適化することは、得られた結果の信頼性と堅牢性を最大化するために重要です。ここでは、特にショウジョウバエのメラノガスター卵巣に焦点を当てた拡張イメージングのためにサンプルを監視するためのプロトコルを紹介します。Drosophila melanogaster卵巣は、幅広い発生過程の解析のための優れたモデルシステムです。とりわけ、ショウジョウバエのこの生殖器官であるDrosophila melanogasterには、非常に明確に定義された成虫幹細胞ニッチが含まれています。このGSCニッチは、成人期の雌性配偶子の発達を維持します。ショウジョウバエの卵巣は約18個の卵巣で構成されており、ゲルマリウムに卵腔が発達しています。各ゲルマリウムの先端では、2-4個のGSCが、主に8-10個の細胞の末端フィラメント、5-8個のキャップ細胞のロゼット、および2-3個の前方エスコート細胞によって形成される体細胞ニッチに維持されています(図1A)。この体細胞ニッチは、GSCに、その幹細胞性を維持し、増殖を制御し、分化を防ぐために不可欠なシグナルと物理的サポートを提供します^1,2,3,4,5.

GSCは通常、非対称に分裂して体細胞ニッチと接触し続ける新しい幹細胞と、体細胞キャップ細胞との直接の接触を失って分化する娘細胞である嚢胞芽細胞(CB)を生成します。GSCとCBには、非常に動的で細胞質のオルガネラであるスペクトロソームが含まれており、その主な機能は、有糸分裂中の有糸分裂紡錘体の正しい向きです⁶。CBは不完全な細胞質分裂で4回分裂して16細胞嚢胞を発症し、生殖細胞の1つが卵子に特異的になり、他の15細胞がナース細胞になります。CBスペクトロソームは、16セルの相互接続された生殖細胞をつなぐフューソームと呼ばれる分岐構造に成長します。このスペクトロソームは、セリン-スレオニンキナーゼPar-1や膜成分Hu-li tai shao(Hts)^{7などの小さな小胞や骨格タンパク質に富}んでいます。GSC細胞周期中、スペクトロソームは新しい材料の追加によって成長し、その形状を変化させ、G1、S、G2、およびM相の同定を可能にします（図1B)^8,9。

私たちは最近、最大16時間の生きたGSCのイメージングを可能にするショウジョウバエゲルマリウムのex vivo培養法を実装しました。これらの細胞は平均して15.5時間ごとに分裂するため⁸、この方法ではGSC細胞周期の大部分を撮影することができます。したがって、他のツールと組み合わせることで、私たちの培養方法は、GSC細胞周期中の分光体形態の記述と、in vivo⁸ (図1C)での異なる細胞周期の持続時間の分析を可能にしました。ここでは、この拡張ライブイメージング法の詳細なプロトコルを、その方法論を説明するステップバイステップのガイド付きビデオで提供します（図2)によってサポートされます。

注:ステップ1.4は少なくとも2日前に行う必要があります。手順2.1と2.2は1日前に行うことができます。

1. 実験前の設定 I

1. ストレプトマイシン/ペニシリン抗生物質ミックス(10,000 U/mLペニシリンおよび10 mg/mLストレプトマイシン)の100 μLアリコートを調製し、使用するまで-20°Cで保存します。
2. オートクレーブ滅菌した純水を使用して15 mLの溶液を調製し、4°Cで保存し、1か月以内に使用してください:重炭酸ナトリウム(NaHCO₃)0.1 M pH 8.0および0.1% Tween 20。
3. 汚染を避けるために、層流フードに次の培地と溶液を調製します。滅菌済みのフィルターチップとチューブを使用してください。
   1. 希釈されていないウシ胎児血清(FBS)の2 mLアリコートを調製し、無菌条件で使用するまで-20°Cで保存します。
   2. 15%FBSと0.6%ストレプトマイシン/ペニシリン抗生物質ミックスを添加したシュナイダーのショウジョウバエ培地を準備します。7 mLのアリコートを調製し、4°Cで保存します。1つのアリコートは、2つのMatTekプレートに十分です(セクション2を参照)。
      1. リンゲル溶液(128 mM NaCl、2 mM KCl、1.8 mM CaCl₂、4 mM MgCl₂、35.5 mM スクロース、5 mM Hepes、オートクレーブ純水中、pH 6.9)を調製します。1 mLのアリコートを調製し、使用するまで-20°Cで保存します。
4. GFP(ポリユビキチン-mGFP6::p ar-1ライン)に融合したPar-1タンパク質を構成的かつ遍在的に発現する生後1〜2日齢のハエを、酵母粉末を添加したフライフードを含む新しいチューブに集めます。インキュベーターで25°Cで2日間培養してから解剖してください.
   注:このステップは、蛍光タグが付けられた関心のある任意のレポーターで実行できます。

2. ガラス底板のコーティングと準備

1. 35 mmポリD-リジンコーティングプレート(ガラス底皿、材料表参照)のカバーガラスの中央に、特定のCell-Tak接着剤(以下、細胞および組織接着剤)を3 μL滴ずつ塗布します。滅菌チップを使用してください.
   注:細胞および組織接着剤は4°Cで保存する必要があります。2つの遺伝的条件(通常は対照条件と変異条件)を用いた実験の場合、同じガラス底板に、十分に分離された2滴の接着剤を別々に滴下します。これにより、両方の遺伝的背景が同じ条件で画像化されるようになります。
2. その直後に、メーカーが推奨するように等量(このプロトコールセットアップでは3 μL)の0.1 M NaHCO₃ pH 8.0を3 μLの接着剤滴に慎重に加え、ピペッティングで混合します。
3. 完全に蒸発させるには、プレートを室温(RT)で20分間インキュベートし、4°Cで一晩保存して翌日使用します。あるいは、調製したプレートを37°Cで25分間インキュベートし、完全に蒸発するまでインキュベートし、直接次のステップに進みます。どちらの場合も、プレートをカバーで維持します。滅菌チップを使用してください。
4. 準備したガラス底皿をベンチに15〜20分間置いて、RTに到達させます。
5. 用意したプレートを3回丁寧に洗います。接着剤層に触れたり、邪魔したりしないでください。各洗浄で、6 μLのオートクレーブ滅菌純水を加え、3回の洗浄のそれぞれできれいなチップを使用して水を取り除き、NaHCO₃溶液の残留物を除去します。
6. ほこりの粒子を避けるために蓋をして5〜10分間解剖しながら、清潔で準備されたプレートをRTに置いて、水を完全に蒸発させます。

3. ショウジョウバエ卵巣解剖と卵巣の分離と装着

注:卵巣解剖は、サンプル組織の接着剤への付着を妨げる可能性のあるタンパク質の存在を防ぐために、FBSを含まないリンガー溶液(シュナイダー培地の代わりに)で行われます。

1. 開始する前に、3ウェル解剖皿、鉗子、および解剖針を70%エタノールで洗浄します。
2. 3つのウェルのそれぞれに十分な容量(~200 μL)のリンゲル溶液を加えます。
3. 2対の鉗子の助けを借りて、最初のウェルで200μLのリンゲル溶液中の5人の酵母栄養雌の卵巣を、標準的な手順に従って解剖します^10,11。胸部と腹部の交差点にあるショウジョウバエの女性を鉗子の1つでつかみます。次に、後腹部のキューティクルをそっと引き裂き、2つの卵巣が露出するまで腹部のキューティクルを引っ張ります。
4. 解剖した卵巣をセカンドウェルに移し、他の組織の残骸や解剖による破片による汚染を減らします。
5. 発光ダイオード(LED)照明と細かい点の鉗子を備えた実体顕微鏡(ズーム8X-13.5X)を使用して、15〜20個の卵巣の筋肉鞘を取り外します。1組の鉗子を使用して卵巣の全身を固定し、2番目の鉗子を使用して後期の卵室をスムーズにつかみ、筋肉が壊れて遅れるまでゆっくりとストレッチします
   注:卵巣のこの部分との接触を減らすだけで、胚葉への損傷を避けることが不可欠です。ステージ8〜9より古い卵室を取り外します。
6. 鉗子を使用して、15-20筋シースフリー卵巣を1つずつ、200μLのリンガー培地を含む3番目のウェルに移します。
7. ピペッティングにより、20-200 μLチップを0.1% Tween 20で事前に湿らせます。これにより、卵子が先端のプラスチック壁に付着するのを防ぎます。
8. 筋被覆のない卵巣を含むリンゲル液6μLを、あらかじめ濡れた先端を使用して、調製した接着プレート(RTに保持)に移します
   注:卵巣沈着後のゲルマリアの剥離を防ぐために、先端と接着剤層との間の接触をすべて避けてください(次のステップ)。ゲルマリアの約30%が思ったように癒着しません。
9. 転写された卵巣が接着面に付着するように、解剖針または鉗子を使用して接着面に接触するまで、リンガードロップの底まで慎重に押し下げます
   注:卵巣が落ち着いたら、卵巣を再配置しようとしないでください。
10. 15%FBSと0.6%ストレプトマイシン/ペニシリン抗生物質ミックスを添加したシュナイダーの培地3mLをMatTekプレートに慎重に充填します(ステップ1.3)。卵巣の剥離を防ぐため、プレートの外縁に1mLずつゆっくりと加えます。
11. 筋肉鞘のない卵巣を平らな面に載せたプレートを顕微鏡ステーションに運びます。

4. 共焦点顕微鏡を用いたライブイメージング

1. スピニングディスク顕微鏡または共焦点顕微鏡(同様の装置も使用可能)の63倍対物レンズにプレートを置き、サンプルの焦点を合わせます。各ガーマリウムの中央の z 平面を選択します。
2. 次の実験パラメータを設定します:キャプチャタイプ:3Dタイムラプス、レーザー出力を70/100に調整、励起波長:488 nm、Zスタックの範囲:30 μm、Zスタック間の距離:1.2 μm、持続時間:17時間、時間間隔:10分ごと。
3. 可能な場合は、マルチポジションオプションを使用して、サンプルのXY座標を再定義し、Zスタックがこの位置の中央に配置されるため、各ゲルマリウムの中央にあるZ平面を選択します。取得を開始します.
   注:ゲルマリウムの通常の幅は30μmであるため、各Zスタックは~25-27セクションになります。共焦点にもよりますが、10分間隔で少なくとも25個のゲルマリアを画像化できます。通常、40x/1.30 NAまたは63x/1.40 NAの油浸プラナポ補正対物レンズが使用されます。
4. ImarisまたはImageJ(フィジー)ソフトウェアを使用して、時間とZ軸で画像を解析し、スペクトロソーム形態の特定の変化を視覚化します^12,13。それらの観測の特定の時間が表示されます (図 1B')。ムービーをマウントするには、各時点で最適な Z 平面を手動で選択します。

この拡張ライブイメージングプロトコルにより、明らかな生物学的障害なしに、ニッチ内の女性のGSCの非対称有糸分裂を記録することができます。そのために、GFP::P ar-1タンパク質を遍在的に発現するゲルマリアを使用し、GSC細胞周期を通じて5つの異なるスペクトロソーム形態(Round、Plug、Bar、Fusing、および感嘆符（図1B,C)を区別します。より詳細な説明では、Round-G2スペクトロソーム(図1C、パネルa)の強いGFP:Par1シグナルがG2-M-G1フェーズ中に劇的に減少することを観察しました。重要なことに、このトランスジェニック系統を使用すると、GFP::P ar-1のほとんどがスペクトロソームを離れて初期前期に細胞質を満たすため、有糸分裂へのGSCの侵入を視覚化することもできます(図1C、パネルb)。さらに、細胞質GFP::P ar-1は、この正確な瞬間にGFP信号が核質に入るため、核膜透過(NEP)step8,14の正確な検出を可能にします（図1C、パネルb)。有糸分裂と核膜の再構築後、GFP:Par1シグナルはRound-G1スペクトロソーム(図1C、パネルc)で徐々に回復します。GFP:Par1材料をRound-G1スペクトロソームに新たに追加すると、Plug(図1C、パネルd)、Bar(図1C、パネルe)、およびFusing(図1C、パネルf)スペクトロソーム形態の形成が促進されます。最後に、GFP:Par1マーカーは、収縮性アクトミオシン環に加えて、細胞質分裂中に形成される微小管に富んだタンパク質性構造である中体の形成の結果として、感嘆符スペクトロソーム(Exclamation point spectrosomes)図1C、パネルe)の可視化を可能にします。

図1:生きたGSCのスペクトロソームサイクルダイナミクス (A) 末端フィラメント細胞(TFC、青)、遷移細胞(TC、赤)、キャップセル(CpC、紫)、およびエスコート細胞(EC、灰色)で構成される生殖幹細胞(GSC)ニッチの概略図。GSC(黄色)には、スペクトロソーム(緑)と呼ばれる特徴的な細胞小器官が含まれています。GSC細胞周期中、スペクトロソームは球形から細長い形へ、そして再び球形へと循環します。GSCは分裂して娘細胞である嚢胞芽細胞(CB、オレンジ色)を生成し、ニッチとの接触を失い、球状のスペクトロソームも含みます。CBは、不完全な細胞質分裂で4回連続して同期して分割し、フューソームによって相互接続された2、4、8、および16細胞の嚢胞を生成します。(B)細胞周期中に生成されるさまざまなスペクトロソーム形状を表す図。(B')スペクトロソーム形態の観察に期待される時間。(C)GSCニッチのGFP::P ar-1信号を示す17時間の長さの動画の時点画像。時間0分(0')は、核エンベロープ透過化(NEP)に対応します。このパネルは、5つの異なるスペクトロソーム形態(白と緑の矢印)を示しています:ラウンド(G2とG1の両方、パネルaとc)、プラグ(パネルd)、バー(パネルe)、ヒューズ(パネルf)、感嘆符(パネルe、緑の矢印)。後者のスペクトロソーム形態は、70'で示される2番目のGSC(緑の点線)に属します。GSCは黄色と緑の点線で区切られています。GSC分割後のCBは、オレンジ色の点線で区切られています。パネルAとBは、Villa-Fombuena et al.8の許可を得て適応しました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:ショウジョウバエの長時間ライブイメージングのためのCell-Tak接着剤の取り付け方法。 (1)接着剤でガラス底皿を準備するための段階的なプロセス。(2)リンゲル液中のショウジョウバエ卵巣解剖と個々の筋肉を含まない卵巣調製物の概要。(3)筋鞘のない卵巣をガラス底皿に移します。(4)ガラス底の皿に、補充したシュナイダーのメディウムを入れます。(5)倒立共焦点顕微鏡を使用して10時間から16時間のゲルマリアを画像化します。この図は、Villa-Fombuena et al.8の許可を得て採用されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。