このプロトコルでは、マイクロコンピュータ断層撮影法を使用して、小動物の骨格筋や内臓組織、脂肪組織、骨格組織などの除脂肪体重を費用対効果の高い定量化を可能にします。痩せた組織と脂肪組織を区別し、生物医学研究、特に小動物でのトランスレーショナル研究に大きな利点をもたらします。
方法論記事
このプロトコルでは、マイクロコンピュータ断層撮影法を使用して、小動物の骨格筋や内臓組織、脂肪組織、骨格組織などの除脂肪体重を費用対効果の高い定量化を可能にします。痩せた組織と脂肪組織を区別し、生物医学研究、特に小動物でのトランスレーショナル研究に大きな利点をもたらします。
骨格筋のサイズ、質量、および組成は、疾患の進行と治療結果の理解に直接影響を与えるため、代謝および筋肉関連疾患の研究にとって重要な特性です。生きた動物の除脂肪体重、脂肪体重、骨格量を定量化することは、代謝、生理学、薬理学、および老年科学の研究において重要です。しかし、特に除脂肪体重の正確な体組成測定を行うことは、従来の評価技術に固有の制限により、依然として困難です。マイクロコンピュータ断層撮影法(マイクロCT)は、小動物モデルの内部構造を高解像度で可視化できる非侵襲的放射線技術です。標準化されたマイクロCT法は、特に老化研究中や同じ動物内の異なる時点において、より信頼性が高くインパクトのある結果を得て、トランスレーショナルリサーチを大幅に強化することができます。その可能性にもかかわらず、画像取得および解析方法の標準化の欠如は、異なる研究間での結果の比較可能性を著しく妨げています。ここでは、これらの課題に対処し、小動物モデルを含む研究の一貫性を促進するために、マイクロCTを使用したリーン質量分析のための包括的で詳細な低コストのプロトコルを提示します。
サイズ、質量、および組成は、筋肉関連および代謝性疾患のメカニズムを研究するための重要な骨格筋の特性です1。サルコペニア、悪液質、萎縮、およびミオパチーは、質量の減少、組成の変化、および筋肉機能の障害という共通の表現型を共有しています2,3,4,5。しかし、生きている動物の体組成を定量化することは、依然として非常に複雑で技術的に困難です6。
in vivoイメージングと体組成分析の主な方法論は、デュアルエネルギーX線吸収測定法(DXA)、コンピューター断層撮影法(CT)、および磁気共鳴画像法(MRI)です。これらの方法は、主に除脂肪体重の減少につながる疾患のスクリーニングと監視に用いられます 7,8,9,10,11.DXAは、その低コストにより、体組成分析のゴールドスタンダードです。しかし、DXAはMRIやCTに比べて、筋肉や脂肪組織を空間的に分解できないという大きな欠点があります1。
MRIは、強い磁場と電波を使用して、体の内部構造12の詳細な画像を生成します。CTに対する主な利点の1つは、その優れたコントラスト分解能であり、異なる軟部組織タイプ1,13,14間の優れた鑑別を可能にします。CTとは異なり、MRIは電離放射線を使用しないため、繰り返し使用しても安全です15,16。ただし、MRIはより高価でアクセスしにくく、スキャン時間が長くなり、メンテナンスコストが高くなります13,17。そのため、小動物分析に適したMRI装置は通常利用できません。
マイクロCTは従来のCTと似ていますが、小さな構造や生物医学研究向けに調整されています18。マイクロCTは、小動物モデルの内部構造を詳細に可視化できる、先進的な非侵襲的放射線評価技術です。マイクロCTは、X線を使用して体の内部構造の詳細な画像を作成し、さまざまな組織タイプによるX線の減衰の違いに依存しています。マイクロCTスキャン中、マウスは円形のガントリーをゆっくりと移動するテーブルに横たわります。ガントリー内では、X線管がマウスの周りを回転し、さまざまな角度からX線を放出します。反対側の検出器は、これらのX線が物体18を通過した後にこれらのX線を捕捉する。
マイクロCTスキャナーのソフトウェアは、これらの複数の角度からのデータを処理して、体の2次元断面画像(スライス)を再構築します。再構築を通じて、これらのスライスを組み合わせて、内部の解剖学的構造を包括的に表現することができます19。マイクロCTスキャンによって生成される画像は、体内のさまざまな組織によるさまざまな程度のX線減衰に基づいています。この減衰は、無線密度20,21 を標準化するスケールであるハウンズフィールド単位 (HU) を使用して定量化されます。HU スケールは、各構造の値がわずかに異なるため、セグメンテーションの基本です。
本稿では、骨、除脂肪組織、脂肪組織1を正確に区別するために、HU値を用いた。確立されたHUの範囲を参照することにより、体組成の正確な分析と比較を確保しました。ここでは、マイクロCTを使用して画像を取得する方法と、除脂肪体重、脂肪体重、骨格体重の視覚化と定量化への応用を示します。
すべての方法は、リオデジャネイロのリオデジャネイロ連邦大学(UFRJ)の動物施設管理および使用委員会(IACUC - UFRJ;A16/23-025-20)。スキャンは、6か月と22か月の雄C57BL/6マウスで行われました。
1.動物の調理
2. 画像の取得と再構成
3. 画像解析
) をクリックします。
)を見つけてクリックします。
を見つけて、各組織タイプのHU値を入力します:除脂肪組織(-29〜225 HU)、脂肪組織(-190〜-30 HU)、骨(500〜5,000 HU)。 「適用 」ボタンをクリックします。
)を見つけます。
) をクリックします。解剖面ウィンドウ内で、マウスのスクロールボタンを使用して、CTスキャンを前後に移動します。
) をクリックすると、選択したウィンドウに関係なく、4 つのウィンドウが表示された画面に戻ります。
)をクリックします。
)」オプションを選択します。これにより、メインメニューのすぐ下にセカンダリメニューが開きます。 [新規ラインの作成 ] ボタン (
) を見つけます。イメージングテーブル上で鎮静剤を投与した動物を解剖学的に適切に配置することで、一貫した再現性のあるスキャン結果が得られ、信頼性の高い結果を得るためのデータ取得の有効性が強調されます。特殊なガス供給システムや気化器など、イメージング全体を通じて動物に適切な鎮静剤を投与することは、正確な解剖学的評価の基本です(図1)。
図2は、さまざまな解剖学的平面でのセグメンテーションとレンダリングを示しており、冠状面、矢状面、および横方向の画像を示しています。これらの画像は、骨格組織、脂肪組織、および痩せた組織の段階的なセグメンテーションを示しており、すべての組織タイプを統合した完全にセグメント化された表現で最高潮に達し、組織間の明確な区別を強調し、特定された組織タイプに基づく領域特異的なマーキングを示しています。装置の制限により全身の捕捉が不可能であるにもかかわらず、この方法は、さまざまな解剖学的平面にわたる組織の分布と組成に関する詳細な情報を提供します。
図 3 は、骨 (青)、脂肪組織 (黄色)、除脂肪組織 (赤) の組織タイプを強調した 3D レンダリングを示しており、解剖学的構造を包括的に視覚化しています。この視覚化は、解剖学的研究に不可欠な詳細な3Dモデルを生成する上でのプロトコルの有効性を強調しています。
表1 は、イメージング日の動物の体重に対する正規化された組織質量(除脂肪体重、体脂肪、および骨格質量)の詳細です。提示された値は、方法論のステップ3.5.1.1で詳述されているように、組織体積(cm³単位)に対応する組織密度を掛けた結果です。
表2 は、各動物の体重分布と除脂肪脂肪率、体脂肪率、骨格組織の割合を示す絶対体組成値を示しています。これにより、各組織タイプの総量と、それが各標本の全体的な体組成にどのように寄与しているかを評価できます。
補足表S1 は、各分析者が各動物の体組成分析を完了するのにかかる時間と、分析者間での結果のばらつきを示しています。除脂肪体重、体脂肪量、骨格量などの体組成指標の測定において、経験豊富なオペレーター(アナリスト1、2、5)と経験の浅いオペレーター(アナリスト3、4)の間に大きなばらつきがあるかどうかを評価します。
図4は、成人と高齢者の比較体組成分析を示しています。除脂肪体重率の減少と体脂肪の増加が明らかになり、これは典型的な老化パターンと一致しています。これらの知見は、前臨床研究の方法論を前進させるために不可欠な重要な解剖学的データを提供するイメージングプロトコルの堅牢性と精度を総合的に強調しています。

図1:動物の調製((A)イメージングプロセス全体を通じて動物の鎮静に使用される装置、例えばガス供給システムや気化器など。(B)マイクロCTスキャンシステム。(C)麻酔をかけられた動物は、マウスのベッドに仰向けで横たわっています。適切なポジショニングは、一貫性と再現性のある結果を得るために重要です。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:異なる解剖学的平面におけるスライスのセグメンテーションと可視化(A)冠状面、(B)矢状面、(C)横面。画像は左から右に、セグメント化されていないスキャン(灰色)、骨のセグメンテーション(青)、体脂肪のセグメンテーション(黄色)、除脂肪組織のセグメンテーション(赤)、そして最後に、すべてのセグメンテーションを含む完全なセグメンテーションを示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:3Dレンダリング。 画像は左から右に、被写体の3Dレンダリングを表示し、さまざまな組織タイプ(骨は青、体脂肪は黄色、除脂肪組織は赤)を強調し、最終的な画像は骨、脂肪組織、除脂肪組織を組み合わせた包括的なビューを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:成体マウスと高齢マウスの体組成の比較。 棒グラフは、骨格組織(成人:10.5±0.5%、高齢者:9.9±1.0%、p=0.19)、体脂肪(成人:17.2±5.7%、高齢者:27.9±4.4%、p=0.03)、除脂肪体重(成人:72.3±5.7%、高齢者:62.3±3.6%、p=0.03)の体組成割合を示しています。データは、動物(成人:n = 3、高齢者:n = 3)のMEAN ± SDとして示されています。統計量は、片側p値(*p < 0.05)の対応のないt検定を使用して計算しました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 傾く | |||
| 動物ID | 除脂肪体重(g) | 重さ(g) | 正規化 (重み) |
| 高齢者1 | 15.1 | 37.4 | 0.4 |
| 高齢者2 | 14.4 | 44.4 | 0.3 |
| 高齢者3 | 14.3 | 37.7 | 0.4 |
| アダルト 1 | 12.3 | 29.1 | 0.4 |
| アダルト 2 | 16.5 | 30.4 | 0.5 |
| アダルト 3 | 16.1 | 31.7 | 0.5 |
| 体脂肪 | |||
| 動物ID | 体脂肪量(g) | 重さ(g) | 正規化 (重み) |
| 高齢者1 | 6.4 | 37.4 | 0.2 |
| 高齢者2 | 8.2 | 44.4 | 0.2 |
| 高齢者3 | 5.3 | 37.7 | 0.1 |
| アダルト 1 | 4.4 | 29.1 | 0.2 |
| アダルト 2 | 2.7 | 30.4 | 0.1 |
| アダルト 3 | 3.4 | 31.7 | 0.1 |
| 骨格 | |||
| 動物ID | 骨格質量(g) | 重さ(g) | 正規化 (重み) |
| 高齢者1 | 2.3 | 37.4 | 0.06 |
| 高齢者2 | 2.3 | 44.4 | 0.05 |
| 高齢者3 | 2.4 | 37.7 | 0.06 |
| アダルト 1 | 2.0 | 29.1 | 0.07 |
| アダルト 2 | 2.3 | 30.4 | 0.08 |
| アダルト 3 | 2.2 | 31.7 | 0.07 |
表1:画像撮影日の動物の体重による質量の正規化。 セクション3.7で説明したように、組織の質量は、検査当日の動物の体重によって正規化できます。この正規化は、動物の体重に基づいて、除脂肪組織、脂肪組織、および骨組織に適用されています。
| 体組成(g) | ||||
| セグメンテーションボリューム X 1.05 | セグメンテーションボリューム X 0.95 | セグメンテーションボリューム X 1.92 | リーン+脂肪+スケルトン | |
| 動物ID | 除脂肪体重(g) | 体脂肪量(g) | 骨格質量(g) | 総質量(g) |
| 高齢者1 | 15.1 | 6.4 | 2.3 | 23.8 |
| 高齢者2 | 14.3 | 8.2 | 2.3 | 24.9 |
| 高齢者3 | 14.3 | 5.3 | 2.4 | 22.0 |
| アダルト 1 | 12.3 | 4.4 | 2.0 | 18.6 |
| アダルト 2 | 16.5 | 2.7 | 2.3 | 21.5 |
| アダルト 3 | 16.1 | 3.4 | 2.2 | 21.7 |
| 体組成(%) | ||||
| 動物ID | 除脂肪体重 (%) | 体脂肪量(%) | 骨格量(%) | 総質量(%) |
| 高齢者1 | 63.6 | 26.8 | 9.6 | 100 |
| 高齢者2 | 58.1 | 32.8 | 9.0 | 100 |
| 高齢者3 | 64.9 | 24.1 | 11.0 | 100 |
| アダルト 1 | 65.9 | 23.5 | 10.6 | 100 |
| アダルト 2 | 76.8 | 12.4 | 10.9 | 100 |
| アダルト 3 | 74.3 | 15.7 | 9.9 | 100 |
表2:体組成。 (A)動物の体組成(グラム単位)。(B)体組成の割合。
補足表S1:さまざまなオペレーターによって評価された体組成。 各評価について、除脂肪体重、体脂肪量、骨格量、および分析にかかった時間(分単位)を記録しました。アナリスト1、2、5は経験豊富なオペレーターでしたが、アナリスト3と4は経験が浅く、研究で説明されているプロトコルのみに従いました。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S1:さまざまな生物学的および非生物学的材料の密度範囲。 この図は、さまざまな生体組織と非生物学的物質の密度範囲を示しています。値は文献から取得し、最適な組織分化を達成するために調整しました。骨が最も密度が高く、次いで除脂肪組織を示しますが、体脂肪は大幅に低い密度を示します。このデバイスは、密度0で水を基準として較正されました。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
トモグラフィーによる評価は、詳細な体組成情報を得るための効果的で非侵襲的な方法です。特にマイクロCTは、前臨床試験に貴重なアウトカム指標を提供します。骨分野では、マイクロアーキテクチャ23と骨リモデリング24の分析が特に興味深いため、マイクロCTはさまざまな用途を持っています。内部生物学的構造の形態を評価することは、特定の組織における血管系の密度を分析することでその機能を評価し、代謝について推論できるため、生物医学研究にも関連しています25。脂肪塊の内分泌および代謝研究のために、マイクロCTの使用は、生きた小動物における基本的な情報を提供する26,27。さらに、マイクロCTは、動物学や植物学などの他の分野にも適用でき、小さな昆虫や植物の構造を評価するために使用されている28,29。
マイクロCTの大きな制限は、コストが高く、画像解析ソフトウェアへのアクセスが限られていることです。さらに、正確な測定には、特に動物の解剖学に関する事前の解剖学的知識が不可欠です。この原稿では、市販の代替品に匹敵する結果を出すことができる3Dスライサーソフトウェアを紹介します。このシステムはまた、半自動30であるため、広範な解剖学的知識の要件を減らします。
マイクロCTによって取得され、ソフトウェアによって分析された画像は、マウスの体組成が老化中のヒトの体組成と同様の軌道をたどることを示し、総脂肪組織の増加とそれに伴う除脂肪体重の減少を特徴とする31。これらの結果は、成体マウス(6か月)と高齢マウス(22か月)を比較すると明らかでした。
装置の制限により、麻酔マスクは頭部の取り込みをブロックします。そのため、頭部全体を捉えて正確にセグメント化することはできませんでした。その結果、我々は、アトラス骨(C1)を解剖学的基準点として使用する慣習を確立し、ここで使用する機器のこの点より下の領域に分析を集中させた。したがって、C1 より上のすべての画像が削除対象として選択されました。装置は完全な尾の長さを取得していませんでした。したがって、すべての分析で尾部は基底領域から取り除かれました。実験間の再現性を維持するために、選択した除外領域の解剖学的ポイントを確立することをお勧めします。
この記事では、アクセス可能で費用対効果の高いプロトコルを使用して断層画像を分析する方法を紹介します。このソフトウェアは、除脂肪体重、脂肪組織、骨格組織の3つの組織タイプを区別することに成功しました。しかし、マウスの体組成解析に共通する課題である骨格筋と内臓を区別することができませんでした。
マイクロCTには、内臓組織と骨格筋量を区別する能力がありません。この制限にもかかわらず、私たちの結果は、体組成に影響を与える疾患、特に肥大や萎縮などの骨格筋に影響を与える疾患の研究に対するソフトウェアの価値を示しています。非侵襲的な検査として繰り返すことができ、縦断的な体組成のモニタリングが可能です。この機能は、保護治療を評価し、多くの代謝性疾患をモデル化するためのプロトコルを開発するのに役立ちます。
著者は、競合する利益を宣言しません。
この研究は、リオデジャネイロ州のカルロス・シャーガス・フィーリョ研究支援財団(FAPERJ;E-26/010.002643/2019 および E-26/201.335/2022)、Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior -Brazil (CAPES)-001 ファイナンス コード。Programa Institucional de bolsas de iniciação científica da Universidade Federal do Rio de Janeiro.全米科学技術開発評議会(CNPq;FFB:001。306236/2022-2 TMO-C: 309339/2023-5)著者らは、国立構造生物学・バイオイメージングセンター(CENABIO)/リオデジャネイロ連邦大学が、その施設、特に小動物イメージングユニット(UIPA)のmicroPET/SPECT/CTプラットフォームを使用していることを認めています。 補足図S1 は BioRender.com で作成されました。
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 3DSlicer, version 5.6.2 | 3D Slicer platform | 画像解析と科学的な視覚化のための無料のオープンソースソフトウェアです。 | |
| Amide、バージョン1.0.1 | Amideプラットフォーム | 処理されたDICOMイメージのハウンズフィールド単位の値を補正するために使用される無料のオープンソースソフトウェア。 | |
| Amira、バージョン4.1 | サーモフィッシャーサイエンティフィ | ファントムの生データから空気と水のハウンズフィールド単位の値を抽出し、画像をDICOMファイルに変換するために使用されます。 | |
| イソフォリン | クリストália | イソフルランは、気化による一般的な吸入麻酔で使用するための不燃性の液体麻酔薬です。 | |
| トライアンフ XOサブシステム | Gamma Medica-Ideas Flex | 前臨床小動物イメージング用に設計されたアドバンストイメージングサブシステムで、定量的および定性的な分析のための高解像度CTおよびPET機能を提供します。 |
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