慢性創傷の治療に多大な努力を払ったにもかかわらず、成功は限られています。正常な治癒を妨害し、慢性創傷の開始と発症に寄与する細胞および分子プロセスはよく理解されていません。その結果、これらの創傷に対する効果的な治療法を開発することは困難であることが判明しました。これは主に、人間の慢性創傷を模倣する動物モデルが不足していることと、慢性創傷を持つヒトでの実験が限られているためです。以前、ヒトの糖尿病性慢性創傷と多くの特徴を共有する慢性創傷を研究するマウスモデルを発表しました。このモデルには、創傷に外部細菌を導入することなく、皮膚微生物叢や環境に見られる細菌から自然に形成されるバイオフィルムの存在が含まれます。したがって、このモデルは、創傷がどのように慢性化するかについての基本的な理解を進める可能性があります。ここでは、このマウスモデルを開発するための元のプロトコルの更新を紹介します。私たちは、マウスの死亡率を~30%から~5%に減らすことに注力してきました。また、このモデルが次世代トランスクリプトームアプローチを用いて創傷慢性化の開始と進行を理解するためにどのように使用されてきたか、感染とバイオフィルムの発達中の細菌集団動態を解明し、低分子を含む治療の有効性をテストする価値を実証したかについても説明します。これまでのところ、これは介入なしで治癒しない唯一の慢性創傷モデルです。
この記事について
要約
プロトコル
最新情報：
これは、以前に提示されたプロトコルの更新です1
すべての実験は、連邦規制に従って完了し、カリフォルニア大学のポリシーと手順に準拠しており、カリフォルニア大学リバーサイド校 IACUC によって承認されています。
1.動物
ステップ 1.1 に次のメモを追加します。
注:ホモ接合性糖尿病マウスがサプライヤーから直接購入される場合は、マウスを従来のビバリウムに収容して、正常な皮膚フローラで皮膚にコロニーを形成します。男性と女性の両方を使用できます。
ステップ 1.3 の後に次のセクションを追加します。
1.4.ジェノタイピングを行う
注:前述のステップ1.31まで動物を繁殖させた後、ジェノタイピングを実行します。以下のプロトコルは、以前に公開された手順2 から変更されました。オスマウスとメスマウスの両方で、離乳時の14〜21日という早い時期に遺伝子型を決定できます。
1.4.1. 粗DNA抽出
1.4.1.1. マウスから耳パンチ生検を収集し、組織サンプルを微量遠心チューブに入れます。
1.4.1.2. 180 μLの50 mM NaOHを加え、サンプルが水没するようにします。
1.4.1.3. サンプルを95°Cで10分間インキュベートし、5分ごとにチューブを減圧してボルテックスします。
1.4.1.4. サンプルを氷上で少なくとも1分間冷却します。
1.4.1.5. 20 μL の 1 M Tris HCl を pH 8.0 で添加し、ボルテックスします。
1.4.1.6. サンプルは、使用するまで-20°Cで保存してください。
1.4.2. ポリメラーゼ連鎖反応
1.4.2.1 次のプライマー混合物を微量遠心チューブに組み立てます (プライマーの表)。
注:プライマーは 、LepRの点突然変異の周囲の領域を増幅します。
1.4.2.2. PCRチューブに20 μLのポリメラーゼ連鎖反応を設定します。10 μLの2x Taqポリメラーゼマスターミックス( Taq DNAポリメラーゼ、dNTP、MgCl2、およびKCIを含む)、1 μLのプライマーミックス( プライマーの表を参照)、4 μLの粗DNA抽出物、および5 μLのH2Oを加えます。
1.4.2.3. サーモサイクルパラメータを次のように設定します。94 °C で 2 分間。97°Cで30秒、52°Cで45秒、72°Cで45秒の40サイクル。続いて、72°Cで2分間、10°Cで無限保持します。
1.4.2.4. PCRが完了したら、4 μLの6x DNAローディング色素をPCR産物に加え、2%アガロースゲルで分離します(図1)。
注:各PCR反応は、610 bpの共通産物、406 bp変異T対立遺伝子産物、および264 bp野生型G対立遺伝子の3つのPCR産物を生成します。野生型遺伝子型は610 bpと264 bpの産物で構成され、ヘテロ接合体遺伝子型は3つの産物すべてで構成され、 db / db遺伝子型は610 bpと406 bpの産物で構成されています。
2.ビバリウムと畜産
ステップ 2.1 を次のステップと注記に置き換えます。
2.1 db/db マウスを従来のビバリウム(バリア/特異的病原体のない施設ではない)に収容し、微生物叢が db/db マウスの皮膚に定着できるようにします。慢性創傷に苦しむヒトを具体的にモデル化するために、研究の必須病原体は、より厳しいビバリウムのクリーン条件で失われる可能性があるため、マウス環境で見られる天然病原体への曝露を防ぐための特別な予防措置を講じないでください。
注:これらのマウスは非常に大きく、糖尿病であるため、慢性創傷実験に使用する前に、ケージあたり最大3 db / db マウスを収容するのが最善です。
3. 慢性創傷の発生の要件
ステップ 3.2 の後に次のステップを追加します。
3.3. 創傷組織の乾燥を避けるために、創傷を常に透明なフィルム包帯で覆い続けてください。
5. 試薬のセットアップ
5.2 以降に次のメモを追加します。
注: 材料表に記載されている会社のATZのみを使用してください。他社のATZはこのモデルと互換性がなく、死亡率が増加します。
6. 手術
6.1. 治療と麻酔
注: 最新の麻酔体制については、以下に説明します。
6.1.5. オープンシステムでは、O2 とともに送達された5%イソフルランを流速(2〜3.5 L / min)でマウスに投与して麻酔を誘導します。マウスの状態を継続的に監視します。
注:マウスが意識を失うか動かなくなったら、白い手術用パッドの上に置き、手術中にイソフルランを継続的に投与できるように気化器に固定されたノーズコーンで頭を取り付けます。
6.1.6. オープンシステムでは、手術中に同じ流量で 1% イソフルランを投与し、イソフルランの流量を調整して麻酔の深さを維持します。
6.3. 傷つけ
6.3.5. 手順の最後にマウスへの1%イソフルランの投与を中止します。
7. 術後の治療と回復
元のプロトコルのステップ 7.1 を次のステップに置き換え、次の点に注意してください。
7.1. 手術直後に透明フィルム包帯を塗布した後、インスリン注射器を使用して、透明フィルム包帯を針で貫通させ、マウスの背側にできた傷の上部にMSAを局所的に沈着させます。手術後 10 分以内に滅菌 PBS 溶液で 150 mg/kg の MSA を使用します。この濃度は、前述のように広範な文献検索の後に決定されました 3,4。
注:MSAは、常に攪拌しないと沈殿する傾向があります。MSAを創傷に適用して計算された用量をマウスに届ける前に、MSAが溶液に完全に溶解していることを確認してください。
元のプロトコルのステップ 7.4 を次のステップに置き換えます。
7.4. 手術後 6 時間でブプレネクスの 2 回目の投与を行います。次に、最初の48時間、地域のIACUC規則に従ってマウスに定期的に投与します。
注:このマウスモデルで皮下投与する必要がある鎮痛薬の徐放性製剤を使用することはお勧めしません。脂質結合ブプレノルフィンは、中鎖脂肪酸トリグリセリド(MCT)油に懸濁されてもよい。MCTオイルの効果は非常に若いdb / dbマウスでテストされていますが、高齢または高齢の肥満db / dbマウスに対するMCTの効果はテストされていません5,6。マウスの体重を考えると、創傷の近くに大量の鎮痛剤を皮下注射すると、創傷治癒の細胞および分子プロセス、および慢性創傷の開始と発生に大きな影響を与える可能性があります。また、この鎮痛剤はこれらのマウスの高レベルの脂肪に溶解するため、痛みを殺すのに効果がなく、有毒になる可能性があります。
8. データ収集、負傷後のマウスの取り扱い、生存戦略、その他のヒント
8.1 データ収集
ステップ8.1.3の後に次の手順を追加します。
8.1.4. 分析のために収集された組織には、対照創傷と慢性創傷の両方で創傷縁から 2 mm 離れた組織のみが含まれるようにしてください。創傷は、MSA の適用後 1-2 時間で切除によって収集できます。
8.1.5. 透明なフィルムドレッシングを貫通して、滅菌注射器を使用して、創傷から蓄積した余分な液体、または創傷滲出液を収集します。細菌研究の場合は-20°C、化学および分子研究の場合は-80°Cで保管してください。
8.1.6 10日後にバイオフィルムを含む創傷組織全体を採取するには、鉗子とハサミで切除する前に、PBS中の4%PFAを創傷に10分間局所的に塗布します。組織を除去するときは、創傷組織が追加の正常組織で支えられるように、さらに5〜10 mmの創傷マージンを追加します。PBS中の4%PFAでの固定を継続し、その後洗浄して包埋の準備を行います。
注: 手術後 10 日の慢性創傷は、組織学のために収集するには壊れやすくなる可能性があります。
8.5. 生存戦略
8.5.1. 追加の水分補給サポートを提供する:マウスが無気力になり、手術と慢性化の生成がストレスになるため、積極的に飲食しないか確認する。手術後最初の48〜72時間の間に、温かい(35〜38°C)生理食塩水を体重10 gあたり0.25 mLの容量で皮下または腹腔内に投与します。水分補給のサポートは、マウスの無気力度に応じて、1日2〜3回まで必要になる場合があります。また、食品ペレットやウォータージェルを寝具に入れて簡単にアクセスすることもできますが、より頻繁なケージ交換が必要になる場合があります。
8.5.2. 追加の暖かさのサポートを提供する: 手術直後および動物体内で、循環水 (93 °C) で温めたパッド上のケージにマウスを入れると、手術後の生存率が大幅に向上します。ケージをパッドの上と 1/2 の外に置き、動物が熱くなりすぎた場合は熱から離れ、寒くなった場合はパッドの上を移動できるようにします。
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結果
図1:ヘテロ接合体を同定して育種者を作成するためのジェノタイピング。ゲルの例は、8つの未知のマウスサンプルの結果を示しています。サンプル2と5は、3つのバンド(610 bp、406 bp、および264 bp)を含むため、ヘテロ接合体です。サンプル1、3、4、6、7、および8は、2つのバンド(610 bpと264 bp)しか含まないため、野生型です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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ディスカッション
この慢性創傷モデルを使用した所見:
このモデルは、慢性創傷の開始と進行の細胞および分子メカニズムを理解するために、いくつかの研究を実行するために使用されてきました。抗酸化酵素を阻害することにより、 db/db マウスに慢性創傷が作られることが示されています。創傷には当初、特定のバイオフィルム形成細菌用に選択された多微生物群集が含まれていました。慢性化は、マウスIPにα-トコフェロールを投与し、創傷に局所的に塗布した N-アセチルシステインの2つの抗酸化物質でマウスを治療することによって逆転しました。これらの治療により、OSが大幅に減少し、バイオフィルムが治療に対する感受性を高め、適切なコラーゲンの沈着とリモデリングにより健康な肉芽組織が形成されることがわかりました3。これらのデータは、慢性創傷を生成および逆転させることができることを初めて示しており、創傷の慢性化の発症におけるバイオフィルムの存在と...
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1mmイヤーパンチ | フィッシャーブランド | 13812201 | 穴径2mm3 |
| -アミノ-1,2,4-トリアゾール(ATZ) | TCI | A0432 | |
| 70%エタノール | |||
| アキュパンチ 7mm皮膚生検パンチ | Acuderm Inc. | P750 | |
| ガロース | |||
| B6.BKS(D)-Leprdb/J | ジャクソン研究所 | 00697 | モ接合体とヘテロ接合体が利用可能 |
| ブプレネックス(ブプレノルフィンHCl) | ヘンリースタインアニマルヘルス | 059122 | 0.3 mg / ml、クラス3 |
| ルローディング染料、パープル(6X) | ニューイングランドバイオラボ | B7024S | |
| 手袋、 | |||
| なだめるようなアロエとラノリンを含む脱毛ローション | Nair | 化学脱毛、温 | |
| 熱療法(水)ポンプ、HTP-1500 | Adroit MedicalSystems | ||
| 加熱パッド | Conair | Moist Dry Heating Pad | |
| Hose Adapters | Adroit MedicalSystems | ||
| インスリンシリンジ | BD | 329461 | 0.35 mm (28G) x 12.7 mm (1/2") |
| イソフルラン | Henry Schein Animal Health | 029405 | NDC 11695-6776-2 |
| イソフルラン気化器 | JA Baulch &アソシエイト | ||
| Kimwipes | |||
| Maxi-Therm Hyper-Hypothermia ブランケット | シンシナティ サブゼロ | Cat No. 247 | 22"x30インチ再利用可能なヘビーデューティーパッド |
| メルカプトコハク酸 (MSA) | Aldrich | 88460 | |
| マウスノーズコーン | |||
| 酸素 | タンクは気化システムと互換性がある必要があります | ||
| リン酸緩衝液 (PBS)オート | クレーブ滅菌 | ||
| 鋭い外科用ハサミ | |||
| 小さなプラスチック容器 | |||
| 水酸化ナトリウム | |||
| Taq 2X マスター ミックス | ニューイングランド バイオラボ | M0270L | |
| Tegaderm | 3M | 参照: 1624W | 透明フィルムドレッシング (6 cm x 7 cm) |
| 薄い金属スパチュラ | |||
| Tri-HCl | |||
| チューブ | |||
| ピンセット | |||
| ワールバリカン | ワル | リチウムイオン プロ |
参考文献
- Kim, J. H., Martins-Green, M. Protocol to create chronic wounds in diabetic mice. J Vis Exp. (151), e57656(2019).
- He, J. -F., Tan, T., Zhu, H. A novel and quick PCR-based method to genotype mice with a leptin receptor mutation (db/db mice). Acta Pharmacol Sin. 39 (1), 117-123 (2018).
- Dhall, S., et al. Generating and reversing chronic wounds in diabetic mice by manipulating wound redox parameters. J Diabetes Res. 2014 (562625), (2014).
- Kim, J., Martins-Green, M. Protocol to create chronic wounds in diabetic mice. Nat Protoc Exch. , (2016).
- Martínez-Carrillo, B. E., et al. Changes in metabolic regulation and the microbiota composition after supplementation with different fatty acids in db/db mice. Int J Food Sci. , (2022).
- Zhang, Y., et al. Medium-chain triglyceride activated brown adipose tissue and induced reduction of fat mass in C57BL/6J mice fed high-fat diet. Biomed Environ Sci. 28 (2), 97-104 (2015).
- Basu, P., Kim, J. H., Saeed, S., Martins-Green, M. Using systems biology approaches to identify signalling pathways activated during chronic wound initiation. Wound Repair Regen. 29 (6), 881-898 (2021).
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- Kim, J. H., et al. Skin microbiota and its role in health and disease with an emphasis on wound healing and chronic wound development. , Elsevier eBooks. 297-311 (2022).
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