ヒト多能性幹細胞由来脳アッセンブロイドを用いたてんかんモデリングのための多電極アレイプラットフォーム

Summary

このプロトコルは、 in vitroでてんかんをモデル化するための多電極アレイ上の背腹融合アッサンブロイドを安定してプレートすることを目的としています。

Abstract

ヒト脳オルガノイドは、ヒト多能性幹細胞(hPSC)に由来する三次元(3D)構造で、胎児の脳の発達の側面を再現しています。 in vitro で背側と腹側領域に特異的な脳オルガノイドを融合させると、興奮性ニューロンと抑制性ニューロンと機能的に統合されたマイクロ回路を持つアセンブロイドが生成されます。アッセンブロイドは、その構造の複雑さと多様なニューロン集団により、異常なネットワーク活動を研究するための有用な in vitro ツールとなっています。マルチ電極アレイ(MEA)記録は、細胞膜の完全性を損なうことなく、ニューロン集団からの電場電位、スパイク、および縦方向のネットワークダイナミクスを捕捉する方法として機能します。しかし、長期間の記録のためにアッセンブロイドを電極に接着することは、サイズが大きく、電極との接触表面積が限られているため、困難な場合があります。ここでは、2ヶ月間にわたる電気生理学的活動を記録するために、MEAプレート上にアッサンブロイドをプレート化する方法を示します。現在のプロトコルはヒト皮質オルガノイドを利用していますが、他の脳領域をモデル化するために分化したオルガノイドに広く適応させることができます。このプロトコルは、ニューロンネットワークの発達を研究するための堅牢で縦断的な電気生理学的アッセイを確立し、このプラットフォームはてんかんの治療開発のための薬物スクリーニングに使用される可能性を秘めています。

Introduction

ヒト多能性幹細胞(hPSC)由来の脳オルガノイドは、生体内の組織構造と発生過程を反映した空間的に自己組織化された3D構造です。それらは、前駆細胞(神経上皮細胞、放射状グリア、ニューロン前駆細胞、グリア前駆細胞)、ニューロン(皮質様興奮性ニューロンおよび抑制性介在ニューロン)、およびグリア細胞(アストロサイトおよびオリゴデンドロサイト)^1,2を含む複数の細胞タイプで構成されています。アッセンブロイドは、3D培養内で複数の脳領域や細胞系統を統合することができる次世代の脳オルガノイドです。これらは、in vivoの対応する領域に似たさまざまな脳領域間の接続をモデル化し、ニューロンとアストロサイト間の相互作用を捕捉して成熟した複雑な神経ネットワークをよりよく模倣し、神経回路の組み立てを研究するための有用なツールを提供します。したがって、アッセンブロイドは、てんかんの病態生理学の特徴を再現するために広く使用されているツールになりつつあり、疾患の原因の根底にある可能性のある異常な神経ネットワークを調査するために機能的な手段が必要です3,4,5,6。

皮質グルタミン酸作動性ニューロンとGABA作動性介在ニューロンとの間の相互作用をモデル化するために、いくつかのグループが背側と腹側の脳に似た別々のオルガノイドを開発し、それらを融合させて多領域集合体7,8,9,10を作りました。ここでは、地域特異的な神経サブタイプを有する前述のアッサンブロイド培養プロトコルを適用した⁹。しかし、大きな障壁は、神経発達中のニューラルネットワーク活動を監視するための再現性のある機能アッセイがないことです。オルガノイドのネットワークの多くの機能試験では、分化のバッチや細胞株間で高いばらつきを持つ結果が得られます。オルガノイドをスライスまたは解離する技術は、シナプ^{スの結合性}を切断することにより、オルガノイドの固有のネットワークを変化させます8。

マルチ電極アレイ(MEA)は、培養条件や細胞膜の完全性を乱すことなく、オルガノイドの電気生理学的特性を特徴付けるために、高い時間分解能でネットワーク活動の経時的な大規模なビューを提供します¹¹。パッチクランプ電気生理学と比較して、MEAは、単一細胞ではなく、ニューロンの大規模な集団に基づくハイスループットデータ取得を可能にします。MEAプラットフォームは電極密度が異なり、脳オルガノイド研究のさまざまなニーズに対応しています¹²。このプロトコルで示されているように、広く使用されているシステムは、ウェルあたり8〜64個の電極を記録します13,14,15。ウェルあたり最大26,400個の電極を備えた高密度MEAにより、空間分解能と時間分解能の向上、活動電位伝搬速度の定量化、および光遺伝学的刺激14,16,17との組み合わせが可能になります。したがって、MEAは、in vitroでてんかんをモデル化するための強力なツールであり、抗てんかん薬スクリーニングのトランスレーショナルパラダイムとして機能します。

大きな課題の1つは、長期記録のために疎水性金属表面で大型アッセンブロイドを安定させることです。このプロトコールでは、薬理学的アッセイとともに長期の縦断的記録のために、無傷のアッサンブロイドをMEAプレートにプレーティングするための詳細な方法論を概説しています。このプロトコルのユニークな利点には、電気的活性を失うことなくアッサンブロイドを電極表面に安定して付着させること、プレーティング後の機能ネットワークの成熟を促進するための市販の神経生理学的基礎媒体の使用、薬物治療のような下流の機能アッセイの実施可能性、および他の領域特異的プロトコルで生成されたオルガノイドへの広範な適用が含まれます。

目標は、てんかんにおけるネットワーク活性の調査、疾患特異的な変化の検討、および治療可能な可能性のある薬剤の試験を行うための、高い時間分解能を持つ機能アッセイを提供することです。このプロトコルの最も困難なステップについて、MEAプレートにアセンブロイドをめっきする技術と、これらの培養物からの代表的な記録を示すビデオ説明が提供されています。

Protocol

以下に示すすべての実験手順は、ミシガン大学医学部の治験審査委員会およびヒト多能性幹細胞研究監視委員会の倫理ガイドラインに従って実施されました。このプロトコルおよび代表的な実験で使用されたiPSC系統は、市販の供給源から得られたヒト包皮線維芽細胞に由来しました。この研究で使用した細胞株、試薬、および機器の詳細は、 材料表に記載されています。

1. iPS細胞からの運命特異的脳オルガノイドの作製

注:このプロトコルには、6ウェルプレートの5つのコンフルエント(~85%)ウェルからマイクロウェル培養プレートに3つのウェルを調製するための情報が含まれています。iPSCのメンテナンスプロトコルは細胞株によって異なります。

1. 表1に詳述された組成物を用いて、個々の細胞培養培地を調製します。4°Cの光を避けて最大2週間保管してください。
2. マイクロウェル培養プレートで使用するすべてのウェルを1 mLのDMEM/F-12で1回すすぎます。1 mL/ウェルのmTeSR plus + 50 μM Y-27632を添加し、プレートを2000 x g で室温で5分間回転させ、マイクロウェルから気泡を除去します。プレートを37°Cの5%_CO2 インキュベーターに保管します。
3. 分化したiPS細胞の領域を、無菌P10ピペットチップを顕微鏡下で層流クリーンベンチに置き、スクリーニングします。カルシウムやマグネシウムを含まない1 mL/well PBSで単層から細胞破片を洗い流します。
4. 予め温めた細胞解離試薬1 mL/ウェルを添加し、プレートを37°Cの5%CO₂ インキュベーターに4〜7分間(細胞株の特性とコンフルエンシーに応じて)置いて、ほとんどの細胞が浮き上がるまで、2〜3分ごとに穏やかに攪拌しながら、単層を単一細胞に解離します。
5. 各ウェルに4 mLのDMEM/F-12を添加して細胞解離試薬を希釈し、10 mLの血清ピペットで適度に粉砕します。同じラインのすべてのウェルから細胞懸濁液を50 mLのコニカルチューブに集めます。
6. 室温で200 x g で4分間遠心し、10 mLの血清ピペットを使用して上清を吸引し、2 mLのmTeSR plus + 50 μM Y-27632で細胞を再懸濁します。10 μLの細胞懸濁液を取り出し、1:1(v/v)ミックスとトリパンブルーを混合し、自動セルカウンターで細胞をカウントします。
7. プレート3 x 10 ウェルあたり⁶ 個の生細胞、ラインあたり3ウェル。必要に応じてmTeSRプラス+ 50 μM Y-27632を追加し、総容量を2 mL/ウェルにします。プレートを100 x g で室温で3分間回転させ、インキュベーターに戻します。
   注:ここで使用するマイクロウェル培養プレートには、ウェルあたり300個のマイクロウェルが含まれているため、3 x 10⁶ 個の細胞をプレーティングすると、10,000個の細胞/マイクロウェルが得られます。
8. 翌日、1 mLの培地を静かに取り出し、P1000ピペットチップを使用して1 mLのmTeSRと培地(Y-27632なし)をゆっくりと加えて、半容量の培地交換を行います。先端を培地表面に近づけ、底部の凝集細胞を乱さないように、できるだけゆっくりと吸引します。
9. メディア交換の翌日に倒立顕微鏡で確認すると、各骨材の輪郭がはっきりと見えます。P1000ピペットチップで各ウェルから元の培地を取り出します。
10. 0.5 mLの神経誘導培地(NIM)にドルソモルフィン(DM)およびSB-4321542(SB)を無菌の切断P1000チップで各ウェルに適度に噴霧します。すぐに、培地に懸濁した凝集体を静かにピペで持ち上げ、滅菌済みの10 cm懸濁培養皿に移します。すべてのアグリゲートが転送されるまで繰り返します。トリチュレーションしないでください。
11. 必要に応じてNIM + SB/DMを追加し、総容量を10 mL/ディッシュにします。37°Cの5%_CO2 インキュベーター内のオービタルシェーカーにディッシュを置き、凝集体の自発的融合を防ぎます。移管日をオルガノイド培養の0日目としてマークします。
12. 1日目から終了までは、表1のメディアレシピと図1のメディア交換タイムライン⁹に従います。特に、オルガノイドは4日目に「背側」と「腹側」の2つの懸濁培養皿に分けられます。
    注:覚えておくべきいくつかの重要なタイムポイント:オルガノイドの拡大は、培地がEGF/FGFを含む神経分化培地(NDM)に切り替えられる6日目に始まります。ニューロンの分化は、NDM + BDNF/NT3によって25日目からサポートされ、オルガノイドは成長因子なしでNDMで46日目から維持されます。

2. ウイルスの標識とアッセンブロイドの作製

注:ウイルス標識^7,9は、アセンブロイド中の各領域特異的オルガノイドの同一性を認識し、特定の電極からの電気生理学的活性をアセンブロイド領域に割り当てるために推奨されます。各MEAウェルに1つのオルガノイドのみを播種する場合に最適です。このプロトコールは、単一のオルガノイドプレーティングにも適用できます。

1. 使用するウイルスストックと希釈培地の量を計算します:標識する各オルガノイドには、ウイルスを含む200 μLの培地が必要です。背側オルガノイドは、通常1:1000(v/v)、または約2 x 10¹⁰ vg/mLの希釈比でpAAV1-CAG-tdTomatoで標識されます。腹側オルガノイドには、1:300 (v/v)、または 2 x 10¹¹ vg/mL pAAV1-mDLX-GFP ウイルスが使用されます。
   注:希釈液は所望の効果まで滴定する必要があり、ウイルス力価の影響を受けます。
2. 適量のメディアを37°Cにウォームアップします。 -80°Cで保存したウイルスストックを氷上で解凍します。標識されたすべてのオルガノイドを収容するのに十分な量の48ウェルプレートを標識します。
3. フードに漂白剤を10%配合したビーカーを入れます。ウイルスと接触する物質をビーカーに排出します。完全に解凍したウイルスを培養培地で希釈し、「背側」と「腹側」とラベル付けした別々の15 mL円錐管に入れます。
4. 56日目のオルガノイドを培養皿から48ウェルプレートに移します。1ウェルにつき1つのオルガノイドは、静的培養における自然融合を防ぐために推奨されます。残存培地をできるだけ取り除きます。
5. 各ウェルにそれぞれ200 μLのウイルス-培地混合物を加えます。プレートを37°Cの5%_CO2 インキュベーターに戻します。滅菌済みの空のプレートでプレートを傾けて、ウイルス粒子をウェルの底に集中させ、形質導入効率を最適化します。
   注:ウイルス粒子は15 mLのコニカルチューブの底に沈む傾向があるため、チューブを頻繁に反転させてウイルスを培地と混合してから各ウェルにウイルスを添加することは、すべてのオルガノイドの均一な形質導入効率を確保するために非常に重要です。
6. 翌日(57日目)に、各ウェルに800 μLの培地を追加して、総容量を1 mL/ウェルにします。
7. 3日後(60日目)に、標識したオルガノイドで全培地交換を行います。ウイルス粒子と接触する材料は漂白します。
8. 3日後(63日目)に、落射蛍光倒立顕微鏡で蛍光発現を確認します。信号が強い場合は、アッセンブロイドの生成を開始します(手順2.9を参照)。
9. 標識されたすべてのオルガノイドを1 mL/ウェルPBSで2回すすぎ、オルガノイド融合中にウイルス粒子が残ることによる交差汚染を防ぎます。切断したP1000ピペットチップを使用して、1つの腹側オルガノイドを各背側ウェルに移し(またはその逆)、それに応じてアッセンブロイドプレートに再ラベルを付けます。ステップ2.5のようにプレートを傾けると、融合が良くなります。
10. 融合手順の3日後(66日目)に、アッセンブロイドを中断することなく、半量培地の交換を慎重に行ってください。通常、安定したアッセンブロイドを形成するのに約1週間かかります(70日目)。

3. 前処理されたMEAプレートへのアッセンブロイドの配置

注:アッセンブロイドをめっきする前に、MEAプレートの表面処理手順を完了するには少なくとも4日かかります。時間を節約するために、背側オルガノイドと腹側オルガノイドの融合(ステップ2.9)とMEA前処理を並行して行うことができます。

1. 表面の前処理とコーティング用の試薬を準備します。
   1. 1%洗剤/酵素溶液を調製するには、0.5 gの酵素/洗剤粉末を50 mLの脱イオン水に溶解します。.粉末が完全に溶解するまで、徹底的にボルテックスします。MEAウェルに溶液を添加する前に、バイオセーフティキャビネット内の滅菌チューブトップ真空フィルターで溶液を滅菌します。毎回使用する前に新鮮にしてください。
      注:洗剤/酵素は、MEA表面を滅菌し、MEA製造プロセスから残留油を除去し、表面が親水性化合物ポリエチレンイミン(PEI)¹⁸との相互作用を促進するのに十分な親水性であることを確認します。
   2. 0.07% PEI溶液¹⁹を調製するには、まず、1 mLの50% PEI溶液1 mLを15 mLのコニカルチューブに混合し、6 mLの1xホウ酸バッファーを添加して、ストック7% PEI溶液を作製します。1 mLのストック7% PEI溶液を99 mLの1xホウ酸塩バッファーで希釈し、最終作業濃度を達成します。滅菌するには、使用前にバイオセーフティキャビネット内の0.22μmフィルターユニットでろ過してください。
      注:正に帯電したポリマーであるPEIは、一次コーティングプロセスで、負に帯電した二次コーティングと基底膜マトリックス(BMM)およびアッサンブロイド²⁰の付着を容易にするために使用されます。ストック溶液は非常に粘性が高いため、コニカルチューブにピペッティングする代わりに注いで50%PEIを1mL取り出します。必要な量は、円錐形のチューブに計量することでより簡単に測定でき、50% PEI溶液の密度は1.08 g / mLです。7%ストックPEI溶液は、-20°Cで1 mLアリコートに最大1ヶ月間保存できます。バイオセーフティキャビネットで後続のすべての手順を実行します。
2. 各アッセンブロイドのサイズを考慮して、ウェルごとに64個の電極を備えた6ウェルMEAプレートを使用して、ウェルごとに1つのアッセンブロイドを収容します。十分な生物学的複製を確保するために、実験に必要なMEAプレートの数を計算します。
3. 1 mLの1%界面活性剤/酵素溶液を滅菌MEAプレートの各ウェルに加えます。ピペットチップで電極を傷つけないように注意してください。洗浄に真空吸引器を使用する場合は、先端が電極アレイに触れないようにしてください。37°Cのインキュベーターで2時間インキュベートします。
4. 洗剤/酵素を取り除き、1.5 mLの滅菌脱イオン水で各ウェルを5回洗浄します。洗剤/酵素は生体適合性がないため、残りの化学物質が完全に洗い流されていることを確認することが重要です。
5. プレコンディショニングのために、各ウェルに1 mLの培地を充填します。プレートを37°Cの5%CO₂ インキュベーターに2日間戻します。MEA表面を細胞培養条件にさらすと、細胞の接着が促進されます。
6. 培地を取り出し、各ウェルのMEA電極を50μLの0.07%PEI溶液で覆い、一次コーティングを行います。37°Cで1時間インキュベートします。
7. PEI溶液を完全に吸引します。各ウェルを1 mLの滅菌脱イオン水で洗浄します。合計3回のクイックウォッシュを行います。プレートをバイオセーフティキャビネットで室温で15分間乾燥させ、蓋を外します。
8. 各ウェルの電極領域を、二次コーティング用の培地で希釈した50μLの1:20(v / v)BMMで覆います。MEAプレートを37°Cインキュベーターに一晩戻します。井戸を囲むコンパートメントに滅菌水を追加して、コーティングの過程で十分な湿度を確保します。
9. 翌日、希釈したBMMを真空で吸引し、表面に薄い層を残します。厚い層が形成された場合は、P1000ピペットチップを使用して、電極接触領域に培地を強制的にスプレーします。厚い塊を取り除くために、必要な回数だけ洗ってください。
   注:残留の厚いBMMは、電極と細胞の接触を妨げる可能性があります。
10. P1000チップを広くカットしたアッサンブロイドを採取し、できるだけ媒体を移さないようにウェル内の電極の上に置きます。
11. 解剖スコープの下の層流フードで、滅菌解剖針またはP20チップを使用して、背側オルガノイドと腹側オルガノイドの両方が電極でほとんど覆われている目的の場所にアッサンブロイドを慎重に押し込みます。P20チップを使用して、アッセンブロイドの周りの液体を取り除きます。これをすべてのアッセンブロイドまたはサブセットに対して繰り返しますが、これは数分以内に実行できます。
    注意: ピペットチップや針でMEA表面に触れたり引っかいたりしないでください。ピペットの先端でアッセンブロイドを突いたり引き裂いたりしないようにしてください。オルガノイドが完全に乾燥するのを防ぐために、できるだけ早くめっきを終了します。
12. アッセンブロイドを37°Cで10分間インキュベートします(培地なし)。プレートをインキュベーターから層流フードに移し、培養培地で希釈した1:50 BMMの小滴を2〜3滴、解剖スコープ下のアッセンブロイドの上に適用します。37°Cでさらに30分間インキュベートします。
13. 解剖スコープの下で、アッサンブロイドの近くに3滴の培養培地を慎重に加えます。これにより、オルガノイドの水分が保たれます。37°Cで1時間インキュベートします。
    注意: 後続の手順でアッセンブロイドが移動または浮かぶ場合は、手順3.11からメッキを再開する必要があります。
14. 1時間ごとに、解剖スコープの下で各ウェルに20〜50μLの細胞培養培地を慎重に加えます。これは一日のうちに行うことができます。目標は、一日の終わりに総容量が少なくとも250μLに達することです。
15. 翌日、解剖スコープの下ですべてのアッサンブロイドが沈殿し、安定化しているかどうかを確認します。さらに750 μLの培地を添加して、総容量1 mL/ウェルにします。プレートを少なくとも2日間邪魔しないままにします。
16. 500 μLの培養培地を取り出し、700 μLの神経生理学的基礎培地を添加することにより、毎週培地交換を慎重に行ってください。追加される媒体の量は蒸発を考慮しており、使用されているMEAプレートの蒸発量に応じて調整できます。必要に応じて井戸の周りに滅菌水を追加して、MEA井戸からの蒸発を最小限に抑えます。

4. MEAの記録とデータ分析

1. 神経生理学的基礎培地に切り替えてから約 1 週間後 (通常は 78 日目頃) に MEA 記録を開始します。
2. 記録チャンバーが設定温度(通常は37°C)に達するまで待ちます。プレートをデバイスに移し、記録する前に少なくとも5分間平衡化させます。
3. ハードウェアのライブ設定
   1. サンプリング周波数、つまり生の電圧データが記録されるレートを設定します。デフォルト設定(12.5kHz)を推奨します。
   2. アナログ モード (通常は、この場合のように Neural Spikes) を指定して、特定のアプリケーションのハードウェア帯域幅とゲインを構成します。記録中のアクティビティを視覚的に監視するには、 スパイク検出器 モジュールと バースト検出器 モジュールを使用します。
      注意: アナログ設定は、生のボリュームに影響しますtageデータの記録方法は、データの記録後に変更することはできません。
   3. (オプション)記録データにハードウェアデジタルフィルターを適用します。ローパスフィルターオプションには、2kHzまたは3kHzのカイザーウィンドウが含まれます。デフォルト設定は、アナログ設定を選択した後に変更できます。
   4. 中央値による参照 (デフォルト) に設定され、この場合のようにニューラル記録に強く推奨されます。参照は、チャネルのグループに共通するノイズ干渉を減らすことにより、低振幅信号の品質を向上させます。
      注:上記のパラメータは、アッセンブロイドで見られる活性に応じて必要に応じて調整できますが、特定の実験のすべての記録で一貫性を保つ必要があります。
4. プレートマップと説明を追加します(必要な場合)。同じプレートの以前の記録からプレートマップをインポートして、一貫性を確保し、バッチデータ処理を容易にします。ファイルに適切な名前が付けられていることを確認します。
5. 信号が良好である (ノイズやアーティファクトが少ない) 場合は、生データを記録します。一般的に、代表的なサンプルには2〜5分の録音で十分です。
6. 実験デザインに応じて、週に1〜2回、5〜15分にわたって電気的活動を縦断的に記録します。各メディア交換の直後に電気的活動が低下するため、次の録音ラウンドを開始する前に、メディア交換のたびに少なくとも24時間待ってください。
7. (オプション)電気的活動を局所化して背側オルガノイドと腹側オルガノイドを区別する必要がある場合、または各電極の活性を個別に分析する必要がある場合は、各記録後に明視野および落射蛍光下で各集合体の画像を取得します(図2B)。
8. データを分析するときは、スパイク/バースト検出器や統計コンパイラなどの解析構成を適用します。スパイク検出には、ベースラインから 5.5 から 6 標準偏差に設定された適応しきい値を使用します。バーストを 100 ミリ秒¹³ で ≥5 のスパイクを持つアクティビティとして識別します。ネットワーク活動を定義するには、全アクティブ電極の25%以上が100ミリ秒以内に発火し、ネットワークバースト^13,14ごとに最低50のスパイクが発生する。
   注:これらのパラメータは、特定の実験の燃焼特性に応じて調整されます。低振幅のスパイクの感度を上げるために、スパイク検出の適応閾値を下げることができます。バースト検出には、さまざまな方法を使用することができ、バックグラウンドアクティビティとは大きく異なるスパイクのバーストを検出するようにパラメータを適合させることができます。ネットワーク活動パラメータは、特にアッセンブロイドが電極の全フィールドをカバーしていない場合、電極のより低い割合に変調される可能性があります。縦断的な比較を可能にするために、実験の期間中、すべてのパラメータの一貫性を保つ必要があります。
9. Statistics Compiler モジュールを実行して、記録されたデータを再生しながらバッチ処理を行います。高度な分析のために、高度なメトリクスやスパイク出力ファイルをエクスポートします。
   注:高度なメトリクス出力には 、 平均発火、バースト、および同期の電極、ウェル、およびグループ平均を含む.csvファイルが含まれています。スパイク出力(.spkファイル)には、すべてのスパイクの波形トレースが含まれており、スパイクソートなどの高度な分析のために他のプラットフォームにインポートできます。

5. エンドポイント薬理学的アッセイとプレートリサイクル

注:薬物治療アッセイは、アセンブロイドが十分に成熟し、電気的活性がピークに達した後に実施できます。ベースライン/治療前活動と治療後活動の記録は、同じ日に実施する必要があります。

1. アッセンブロイドの真上に1〜10μLの薬液を加え、プレートを静かに渦巻かせて均一な混合物を確保します。場合によっては、グルタミン酸/GABA受容体アゴニスト/アンタゴニストを用いたシナプス関連薬物治療アッセイ(図2E)など、薬物含有培地でのインキュベーション時間を長くすることが推奨されます(詳細については、「結果」のセクションを参照)。
   注:大きな体積変化は一般的に電気的活動を一時的に減少させるため、最終的な作業濃度を達成するために、各ウェルに少量の薬物溶液を追加することをお勧めします。目的の薬物が溶解するビヒクルの添加が電気生理学的パラメータの有意な変化を引き起こさないようにすることが重要です。
2. 十分なPBS洗浄(通常は3回)を行い、治療後の記録後に薬物を洗い流します。薬物のウォッシュアウトの翌日に追加の録音を行い、電気的活動がベースラインレベルに戻るかどうかを確認します。.
3. 必要に応じて、記録の最後に培地を強制的にピペットで動かして、アッセンブロイドをMEAプレートから分離し、ライブイメージング、ホールマウント免疫染色のための4%パラホルムアルデヒドによる固定、RNAまたはタンパク質抽出のための溶解などのさらなる実験を行います。
4. 分析目的では、各条件に対して少なくとも 3 回の技術的および生物学的レプリケートを使用します。電気生理学的データを n ≥ 3 回の複製の平均として表します。
5. 実験の最後にプレートをリサイクルするには、付着したアッセンブロイドを取り除いた後、残りの媒体を吸引します。滅菌PBSで一度洗ってください。金属領域を200 μL/ウェルの0.25%トリプシン-EDTAで完全に覆い、プレートを37°Cのインキュベーターに一晩戻します。
6. 翌日、トリプシンを吸引し、70%滅菌エタノールで2回、滅菌脱イオン水で3回洗浄します。
7. バイオセーフティキャビネット内のプレートを蓋を外した状態で15分間、または完全に乾くまで風乾します。洗浄したプレートをビニール袋に密封し、将来使用するまで室温で保管してください。
   注意: よく洗浄されたMEAプレートは、記録品質を大幅に損なうことなく3回再利用できます。

Results

ヒト背腹側集合体を6ウェルMEAプレート(分化あたりn = 6、分化3)に播種し、各ウェルには64個の電極が含まれていました(図2A)。縦断的記録が計画された10個のアッセンブロイドのうち9個は、in vitroで50日以上にわたって電極にしっかりと付着していました(図2D)。薬理学的アッセイ用に指定された8つのアッサンブロイドのうち6つは、開発段階に適したネットワーク活性により、ウォッシュアウトフェーズを通じて成功裏に沈殿しました(図2E)。1つの代表的なウェルからの位相差および蛍光画像が示されており(図2B)、AAV-CAG-tdTomatoで標識された背側オルガノイドとAAV-mDLX-GFPで標識された腹側オルガノイドは容易に区別できます^7,9。

MEA上のニューロンの活動を解析し、さまざまなパラメータを通じて、全体的な細胞の興奮性とネットワーク活動を評価することができます。培養全体の全体的な発火率は、細胞およびネットワークの興奮性に関する情報を提供し、複数の電極間での同期バーストの頻度は、ニューロンのシナプス的に活性なネットワークの範囲を示します。空間的に異なる電極を横切って短時間に複数回繰り返されるスパイク(ネットワークバースト)は、発作様活性との生物学的相関関係として役立つ可能性がありますが、MEA上のアセンブロイドは 、真正な 発作を起こす可能性のある生物全体と比較して制限されています。 図2C は、84日目および91日目に市販の神経生理学的基礎培地で培養されたアッサンブロイドのネットワークバーストパターンを示しており、ニューロンの機能的成熟により、後の時点でバースト時間が増加する可能性があります。この場合、細胞およびネットワークの活性は、アセンブロイドがプレーティングされた日から徐々に上昇し、通常は92日目にピークに達し、125日目にほぼ衰退します(図2D)。後の段階での成熟の増加は、後の記録時点での同期バースト期間の延長に寄与している可能性があります。

GABA_A 受容体拮抗薬であるBicucullineは、108日目に薬物を添加した後の有意な発火率および(ネットワーク)バースト頻度によって示されるように、アッセンブロイドの同期ネットワーク活性を増強します(図2E)。これは、以前にシングルセル電気生理学記録²¹で実証されたものと類似している。薬理学的アッセイの検出力分析は、G*Power3 ベースを使用して、効果サイズ 0.94、アルファ値 0.05 で実施されました。0.8の検出力を達成するためには、n = 5の3つの等しいサイズのグループを持つ15個のアッサンブロイドの合計サンプルが必要でした(図2E)。応答が真の信号イベントであり、少量のメディアの追加から生じる可能性のある信号強度の変化ではないことを確認するための車両制御が含まれています(図2E)。

図1:調査の概要。 重要な段階および対応する低分子の補足を詳述する分化プロトコルのMEAタイムライン上の二重標識アッサンブロイドの生成およびめっきのためのプロトコル(組成に関する追加情報については、 表1 および 材料の表を参照)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:アッサンブロイドのMEA記録 (A)82日目、すなわちめっき後10日目における単一のMEAプレート(n = 6ウェル)からの平均焼成活動のヒートマップ。すべてのウェルは、同じ条件と遺伝子型の培養物を表しています。(B)アッサンブロイドの代表的な位相コントラストおよび共焦点画像、背側アッセンブロイドは赤で、腹側は緑でラベル付けされています。白い矢印は、腹側から背側へのGABA作動性介在ニューロンの移動を示しています。スケールバー = 500 μm. (C) 代表的なラスターは、1つのウェルから120秒を超える記録時間をプロットします。ネットワークバーストは紫色のボックスで強調表示されます。78日目(めっきの1週間後、記録開始日)と92日目(めっきの3週間後、活動がピークに達する日)の2つの別々の時点が示されています。(D)78日目から127日目までの平均発火率、バースト頻度、およびネットワークバースト頻度の定量化(n = 3微分、3アッサンブロイド/微分)。各曲線は、3つの微分(色分け)からコンパイルされた1つの個々の集合体を示します。赤い曲線は平均値を示しています。(E)バイキュクリンアッセイ結果の定量化(n = 6アッセンブロイド/条件)。棒グラフはSEM±平均として表示されました。各ドットは、3つの分化(色分け)からコンパイルされた1つの集合体を表します。ノンパラメトリックなフリードマン検定を実行しました。**p < 0.01;ns、重要ではありません。MEA、多電極アレイ。ヒートマップとラスタープロットは、分析ソフトウェアNeural Metric Toolを使用して生成されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:さまざまな差別化段階にあるメディアのコンポーネント。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

Discussion

iPS細胞由来アッサンブロイドにおけるネットワーク活性の電気生理学的記録のためのMEAベースの方法は、てんかんのin vitroモデリングに使用されてきました^22,23。興奮性シナプス結合と抑制性シナプス結合を統合したこの提案されたプラットフォームは、ニューロンの過興奮性のメカニズムと、てんかん発生の過程における皮質介在ニューロンの役割に対処する可能性を秘めています。さらに、このプラットフォームは、薬理学的摂動が存在する場合でも、約50日間in vitroでアッセンブロイドを安定化し、縦断的な電気生理学的データを収集することができるため、潜在的な治療標的を持つ化合物を試験するためのアプローチを提供します。

成熟した比較的大きなアッサンブロイドを疎水性表面上でin vitro で長期間安定化させることは、技術的に困難でした。この障害を克服するために、逆に帯電した化学物質で2回コーティング戦略を適用し、オルガノイドの電極表面への短期および長期の接着を促進します。このプロトコルは、プレートコーティング試薬をポリ-L-オルニチン(PLO)/ラミニンからPEI/BMMに切り替えることにより、以前に使用されていた方法²⁴ を最適化し、高い成功率と低い毒性で固体結合を実現します。さらに、この安定化された長期培養システムは、ハイスループットなデータが得られる可能性を秘めています。例えば、デュアルウイルスによる事前標識は、個々の電極によるスパイクソーティングを補完し、異なる領域からの活性を局在化して比較することができます。提案されたプラットフォームはまた、アッセンブロイド²⁵の無傷の構造を破壊することなく介在ニューロン機能に非常に関連する、局所的な場電位を記録するための安定したツールを提供する。このプロトコルの主な制限は、アッセンブロイドがめっき後に平坦化されるため、初期の3D構造が保存されるかどうかについて懸念が生じることです。オルガノイドを電極²⁶ で包み込むより高度なMEAプラットフォームを使用して、電極の周囲にオルガノイドを成長させることで、この制限を克服できる可能性がある。

オルガノイドの電気生理学的記録のためのMEAベースの方法の主な障害の1つは、分化プロトコルや分化のバッチ間での実験結果のばらつきと再現性です。これまでの研究によると、MEAによって測定されたニューロンのネットワーク活動は、背側と腹側の両方のオルガノイドのニューロンの成熟状態に依存していることが示されている²⁷。比較的成熟したニューロンと回路を使用して、後の時点でアセンブロイドから記録することは、一貫性を向上させる1つの方法です。さらに、ハイスループットデータを生成するマルチウェルMEAシステムを選択することで、実験の変動性に照らして統計的な比較が可能になります。培養物の電気生理学的活性が特定の時点で予想されるものと一致しない場合、免疫細胞化学分析やトランスクリプトーム分析などの品質管理手段のために、機能プラットフォームから無傷の培養物を収集することが重要であり、役立ちます。

提案されたプラットフォームにとって最も重要なことは、背側に領域的に指定された興奮性皮質ニューロンと腹側に抑制性介在ニューロンを機能的に統合することです。文献に見られる脳領域特異的オルガノイドの作製のためのプロトコルは、培地条件、培養のタイミング、収量、および成熟プロファイル、その他の要因に関連して大きく異なる²⁸。このプロトコルは、興奮性ニューロンおよびGABA作動性介在ニューロンを生成する能力において皮質および神経節の隆起に特異的であるが、十分に確立された分化技術を使用して、運動ニューロン²⁹ およびプルキンエ細胞³⁰などの他のアイデンティティを示すiPS細胞由来ニューロンを生成することができる。したがって、提案されたプラットフォームは、大脳皮質と脊髄/小脳との間の神経回路をモデル化する可能性を秘めています。プレーティングのタイミングとウイルス標識による細胞型の可視化に関連するいくつかの最適化の後、この方法は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)¹⁷のようなてんかん以外の他の疾患モデルに変換することができる。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Corning 非TC処理培養皿	Corning	08-772-32	シェーカーでの懸濁培養用
100 mL Beaker	フィッシャーサイエンティフィック	FB100100
100%エタノール	フィッシャーサイエンティフィック	BP28184-4L
2-メルカプトエタノール(&β-ME)	サーモフィッシャー	21985023	作業濃度100μM
48ウェル細胞培養プレート	Fisher Scientific	50-202-140
6ウェル細胞培養プレート	Fisher Scientific	07-200-83
Aggrewell 800	Fisher Scientific	501974754
Allegra X-14R 冷蔵遠心分離機	Beckman Coulter	BE-AX14R
アロプレグナノロン	ケイマン	16930	5mg を DMSO に懸濁して 1 mM ストック溶液を得る。分注して&-minusで凍結します。80°C.1:10,000に希釈して使用します。使用濃度100nM。
自動セルカウンター	Thermo Fisher	AMQAX2000
Axion CytoView MEA 6 ウェルプレート	Axion Biosystems	M384-tMEA-6B
Axion Maestro MEA プラットフォーム	Axion Biosystems	Maestro	温度環境制御付き
B-27 サプリメント (レギュラー、ビタミン A を含む)	Thermo Fisher	21985023
B-27 サプリメント (ビタミン A なし)	Thermo Fisher	12587010
基底膜マトリックス - Geltrex	Thermo Fisher	A1569601
ビーズバス	フィッシャーサイエンティフィ	10-876-001	Isotemp
卓上倒立顕微鏡	オリンパス	CKX53	層流クリーンベンチに保管
Bicuculline	Sigma-Aldrich	14340	作業濃度 10 &M
漂白剤	CLOROX	67619-26
ホウ酸塩緩衝液 20x	Thermo Fisher	28341	1x
BrainPhys 培地	StemCell Technologies	5790
細胞解離試薬 (StemPro Accutase)	Thermo Fisher	A1110501
Celltron オービタルシェーカー	HT-Infors	I69222
界面活性剤/酵素 (Terg-A-Zyme)	シグマ アルドリッチ	Z273287	使用濃度 1% m/v
DMEM/F12 + HEPES/L-グルタミン	サーモフィッシャー	113300
DMSO	シグマ アルドリッチ	67685
ドルソモルフィン	シグマ アルドリッチ	P5499	5mgをDMSOに溶解して、10mMの原液を得る。分注して&-minusで凍結します。20°C.1:2000で希釈して使用します。(作業濃度 5 &M)
カルシウムまたはマグネシウムを含まないD-PBS	Thermo Fisher	14190144
グリア細胞株由来神経栄養 (GDNF)	Peprotech	450-10	溶解 100 &1mLのPBS中のgを100&μに;g/mLです。分注して&-minusで凍結します。20°C.1:5000に希釈して使用します。(使用濃度20 ng / mL)。
GlutaMAXサプリメント	サーモフィッシャー	35050061
血球計	選択顕微鏡 科学	63510-20
HEPES	サーモフィッシャー	15630080
ヘラガード ECO クリーンベンチ	サーモフィッシャー	51029692
湿度制御細胞培養インキュベーター	サーモフィッシャー	370	37 度に設定;C、5%CO2
IWP-2	Selleckchem	S7085	リコート、&-minusで凍結します。80°C。室温で解凍すると沈殿します。冷凍アリコートは、37°Cに直接配置する必要があります。使用前にC。
ノックアウト血清置換(KOSR)	Thermo Fisher	10828010
mTeSRplus(培地+サプリメント)	StemCell Technologies	100-0276	cGMP、ヒトiPS細胞用安定化フィーダーフリー培地
N2サプリメント	Thermo Fisher	17502048
Neurobasal A	Thermo Fisher	21103049
非必須アミノ酸(NEAA)	サーモフィッシャー	11140050
NT3	Peprotech	450-03	ディゾルブ 100 &1mLのPBS中のgを100&μに;g/mLです。分注して&-minusで凍結します。20°C.1:5000に希釈して使用します。(使用濃度20 ng / mL)。
NuFF ヒト新生児包皮線維芽細胞	MTI-GlobalStem	GSC-3002
パラフィルム	パラフィルム	P7793
ペニシリン/ストレプトマイシン	サーモフィッシャー	15140122
ピペット (P10、P200、P1000)	エッペンドルフ	EP4926000034	オートクレーブカット オルガノイド採取用 P1000 チップ
ポリ (エチレンイミン) (PEI)	シグマ・アルドリッチ	P3143	無菌ホウ酸緩衝液で原液を希釈する。作業濃度0.07%。詳細は原稿でご覧ください。
組換えヒト上皮成長因子(EGF)	R&D Systems	236-EG-200	PBS に懸濁。分注し、-20°Cで凍結します。
組換えヒト線維芽細胞増殖因子(FGF)-塩基性	ペプロテック	100-18B	はPBSで吊り下げられています。分注し、-20°Cで凍結します。
換えヒト脳由来神経栄養因子 (BDNF)	Peprotech	450-02	再構成前に短時間遠心分離します。100 & ミューを溶かします。1 mLのPBS中のgを100&μに;g/mLです。分注して&-minusで凍結します。20°C.1:5000に希釈して使用します。(使用濃度20 ng / mL)。
レチノイン酸(RA)	Sigma-Aldrich	R262510	mgを3.3 mLのDMSOに溶解して、100 mMのストック溶液を得る。在庫100&muを分注します。L /チューブで凍結し、&-マイナスで凍結します。80°C。200 & ミューを取ります。Lの100 mMストックを10倍に希釈し(1.8 mLのDMSOを添加)、10 mMストックを作成します。アリコート50μL/チューブで保管し、&-minusで保管します。80°C.1:100,000に希釈して使用します。(使用濃度100 nM)。
ROCK阻害剤Y-27632	Tocris	1254	10 mMストックSAG
(平滑化アゴニスト)		S7779	リコートおよび&-minusで凍結;80°C.ストック濃度1mM。1:10,000希釈(使用濃度100 nM)で使用してください。
SB-431542	Tocris	1614	5mgを1.3mLのDMSOに溶解して、10 mMのストック溶液を得る。分注して&-minusで凍結します。80°C.1:1000に希釈して使用します。(作業濃度 10 &M)
血清ピペットフィラー	Fisher Scientific	14-387-166
Steriflip 真空管トップフィルター	Sigma-Aldrich	SE1M179M6
滅菌細胞培養フード	Baker Company	SG-600
トリパンブルー溶液 (0.4%)	Thermo Fisher	15250061
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Fisher	25200056
ズーム実体顕微鏡	オリンパス	SZ61/SZ51	層流クリーンベンチに保管