Manuka Honeyで処理された創傷原因細菌の生存細胞が培養できない細胞を定量するための生死染色

サマリー

提示されたプロトコルは、Manuka Honeyで処理された細菌培養物中の生存可能だが培養不可能な細胞(VBNC)を定量化する手順を説明しています。

要約

細菌間の抗生物質耐性と耐性は、世界の健康に重大な脅威をもたらします。抗生物質の耐性と耐性に寄与するメカニズムには、遺伝子変異、耐性遺伝子の獲得、生存可能だが培養不可能(VBNC)およびその他の休眠状態への移行がそれぞれ含まれます。VBNC細胞は、非抗生物質耐性の対応物と遺伝的に同一ですが、代謝的に不活性なままでいることにより、抗生物質の影響を回避します。抗生物質は、DNAの複製や転写などの標的プロセスが活性化している場合にのみ効果を発揮します。環境ストレス要因、特に抗生物質は細菌を休眠状態に追い込む可能性があるため、この反応を最小限にするか予防するためには、代替の抗菌薬が必要です。抗菌剤のマヌカハニー(MH)は、多くの細菌に対して効果的ですが、耐性が発生することはまれです。その多面的な抗菌メカニズムにより、細菌感染症の治療に貴重な薬剤となっています。この研究では、MHが従来の抗生物質よりもVBNC細胞を誘導するが少ないという仮説を検証することにより、抗生物質耐性の発生に対するMHの抵抗性を調査しました。これを調査するために、創傷原因細菌黄色 ブドウ球菌 および 緑膿菌 を最小阻害濃度のMHまたは従来の抗生物質トブラマイシンまたはメロペネムで治療するためのプロトコルが開発されました。その後、生血プレート数を使用して代謝活性培養可能な細胞を特定し、生/死染色を使用してすべての生存細胞を特定しました。VBNC細胞の数は、生細胞数から培養可能細胞数を引いたものに等しくなりました。いくつかの実験では、培養可能な細胞数が生細胞数よりも高かったため、VBNC細胞の数が負になりました。したがって、VBNCセル番号は直接比較されませんでした。代わりに、各処理について培養可能な細胞数と生存可能な細胞数を比較しました。トブラマイシンで処理した 緑膿菌 のみ、培養可能な細胞が生細胞よりも有意に少なく、VBNC細胞の数が多かったことが示されました。このプロトコールは迅速かつ簡単で、他の病原菌におけるVBNC細胞のMH誘導を評価するために使用できます。

概要

生存可能だが培養不可能(VBNC)の休眠状態にある細菌は、抗生物質治療を生き延び、再発性、時には致命的な感染症を引き起こします^1,2,3。私たちにとってより身近なのは、遺伝性の遺伝的変化4を介して起こる抗生物質耐性です。遺伝的変化は、抗生物質の摂取を制限する、抗生物質の排出を増加させる、抗生物質の標的を修飾する、または抗生物質を不活性化するなど、いくつかのメカニズムによって特定の抗生物質に対する耐性^{を提供します4。}対照的に、休眠状態の細菌は、代謝を低下させることにより、より広範で非遺伝性の抗生物質耐性を示します^2,3。抗生物質は、DNA複製や細胞壁合成などの特定の代謝プロセスを標的とし、代謝的に不活性なVBNC細胞に対しては効果がありません⁴。VBNC細胞は、ほとんどの細菌集団において、遺伝的に同一の抗生物質感受性の兄弟とともに、確率的には少ない数で^{存在します5。}しかし、抗生物質への曝露を含む環境ストレス要因は、感受性の高い細菌細胞を抗生物質耐性VBNC状態に誘導します^3,6。抗生物質治療は、集団内の抗生物質感受性細胞を殺しますが、休眠中のVBNC細胞は残ります。その名前が示すように、VBNC細胞は、代謝活性のある兄弟の成長に適した培地では培養できません。しかし、それらの膜と遺伝物質は損傷を受けておらず、^7,8を再生することができます。抗生物質が除去されると、VBNC細胞を休眠状態から目覚めさせ、成長を回復するために、栄養素、温度、宿主因子などの特定の刺激が必要になります^3,9。VBNC細胞は、創傷感染症の主要な病因である緑膿菌や黄色ブドウ球菌など、多くの病原性細菌種で報告されています^10,11。

蜂蜜は、その抗菌特性¹²のために、創傷治療を含む医療用途で長い間使用されてきました。マヌカハニー(MH)は、マヌカブッシュ(Leptospermum scoparium)の花に由来し、その広域スペクトルの殺菌活性で注目されています(13,14,15でレビュー)。これは、従来の抗生物質に対して遺伝性耐性を示すメチシリン耐性黄色ブドウ球菌やバンコマイシン耐性腸球菌などの細菌株を含む、試験されたヒト感染原因細菌の大部分を成功裏に殺します^16,17。さらに、MHに対する誘導された細菌耐性はまれであり、ハチミツに曝露された緑膿菌のバイオフィルムおよびテストされたハチミツのサブセットの濃度を上げて培養された大腸菌でのみ検出されます18,19,20,21。このことは、MHの抗菌メカニズムが従来の抗生物質とは異なり、VBNC細胞を誘導する細胞が少ないか、または全くない可能性があることを示唆しています。この仮説は、MHが従来の抗生物質と比較してVBNC集団にどのように影響するかを決定することによって検証されました。

VBNC細胞は、代謝活性のある培養可能な兄弟や死細胞と区別する必要があります。培養可能な細胞は、細胞をルーチンの培養培地に移し、観察可能なコロニーを得るのに十分な細胞分裂に十分な期間インキュベートする生存プレートカウント技術を使用してカウントされます。VBNC細胞を死細胞と区別するためのいくつかの方法が、それらの無傷の膜と低レベルの転写に基づいて開発されています。基質および蛍光色素の取り込みは、顕微鏡法またはフローサイトメトリーと組み合わされて、顕微鏡法またはフローサイトメトリーによる細胞の直接カウントを可能にし、無傷の膜を示す色で^22,23。電子伝達鎖が無傷の細胞膜に存在することを必要とする呼吸アッセイも、生存細胞と死細胞を区別するために使用されてきた²⁴。増幅を防ぐDNA修飾色素と組み合わせた定量的PCR(qPCR)法も開発されています。生細胞からのDNAのみが増幅され、無傷の膜は色素²⁵を排除します。VBNC細胞は休眠状態にありますが、それでも低レベルで遺伝子を転写するため、逆転写PCR²⁶を使用して死細胞と区別するためにも使用できます。

この研究では、MHで処理された2つの創傷原因病原菌、 黄色ブドウ球菌 と 緑酸菌 のVBNC細胞を定量するためのアッセイを開発しました。MHおよび従来の抗生物質による細菌の処理、および培養可能な細胞と生存細胞を検出するための生肉数および死染色の使用について説明します。この簡単で安価なプロトコルにより、多くの細菌性病原体で抗生物質耐性VBNC細胞を誘導するMHの能力の分析が可能になります。

プロトコル

緑膿菌(ATCC9721)と黄色ブドウ球菌(ATCC29213)はバイオセーフティレベル2の薬剤に分類されるため、作業が行われる部屋はアクセスが制限され、培養物の攪拌や遠心分離など、飛沫やエアロゾルを発生させる可能性のある操作のためのバイオセーフティキャビネットを装備する必要があります。このプロトコルのすべてのステップで、白衣、保護メガネ、手袋などの個人用保護具(PPE)を着用してください。実験で使用したすべての試薬および機器は、材料表に記載されています。

1.無菌培養液と寒天培地の調製

1. Luria Bertani と Mueller Hinton、NaCl (0.85%)、抗生物質、ガラス器具を準備します。
   1. 製造元の指示に従ってブロス培地を準備し、寒天培地の1.5%に寒天粉末を加えます。0.85 gのNaClを100 mLのdH₂0に加えて、0.85%NaClを調製します。容器にオートクレーブテープを貼り、オートクレーブ対応容器に入れ、使用量に応じた液サイクルでオートクレーブを打つ。
   2. オートクレーブサイクルが完了したら、寒天を約60°Cに冷却してから、滅菌ペトリ皿に注ぎます。
2. 細菌の希釈および治療のために、抗生物質トブラマイシンおよびメロペネムのdH₂O溶液中の100 μg/mLのストック溶液を調製します。0.2 μmの滅菌フィルターに接続された5 mLの滅菌シリンジを使用して、抗生物質ストックを滅菌します。
   1. 滅菌した抗生物質ストックを-20°Cで複数の小さなアリコートに保管し、複数回の凍結融解サイクルによる活性の損失を防ぎます。

2. -80°Cからアーカイブされた 黄色ブドウ球菌 株と 緑膿菌 株の取得(1日目)

1. 凍結細菌株の小さなアリコートを80°Cの冷凍バイアルからLuria Bertani(LB)寒天にストリーキングするための材料を集めます。これには、複数の滅菌木の棒と、生物と日付がラベル付けされたLB寒天プレートが含まれます。
2. -80°Cの冷凍庫を開け、目的のバイアルをすばやく取り出し、冷凍庫のドアを閉じます。各バイアルを順番に開き、滅菌スティックを使用して、適切にラベル付けされたLB寒天プレートに少量の凍結細菌をこすり落とします。バイアルキャップを元に戻し、すぐに-80°Cの冷凍庫に戻します。
3. 接種したLB寒天プレートを寒天側を上にして、好気性(大気圧)条件下で37°Cで18〜24時間インキュベートします。インキュベーション期間後、接種したLB寒天プレートをグラフトテープで密封し、4°Cで1週間以内に保管します。必要に応じて、-80°Cの冷凍ストックから新鮮な細菌培養物を毎週接種します。

3. 黄色ブドウ球菌 と 緑膿菌 のマヌカハニー(MH)と抗生物質による治療のための準備(2日目)

1. 各菌株のLBブロス培養を開始するために必要な材料(小型の滅菌試験管、5 mLの血清学的ピペット、滅菌LBブロス、接種ループなど)を収集します。また、血清ピペット、ブンゼンバーナー、および振とうインキュベーターで使用するための手動または電動ピペッターを用意してください。
2. ブンゼンバーナーの炎の隣で作業し、血清学的ピペットを使用して、2 mLのLBブロスを2つの滅菌試験管に移します。ブンゼンバーナーの炎で接種ループを滅菌し、次にLB寒天プレートからLBブロスで適切にラベル付けされた試験管にバクテリアでいっぱいのクォーターループを移します。
   1. 好気性条件下で、37°Cの振とう(~250rpm)インキュベーターで試験管を18〜24時間インキュベートします。

4. MH の準備と 、黄色ブドウ球菌 と 緑膿菌 (T = 0) の MH および抗生物質治療のセットアップ (3 日目)

1. Mueller Hintonブロスと寒天プレート、2日目のLBブロス細菌培養、滅菌試験管、氷上の抗生物質ストック、ピペット(P20、P200、P1000)とチップ、15 mLチューブ、血清ピペットとピペッター、マイクロチューブなど、実験に必要な材料を集めます。
   1. 25%および50%MHストック溶液は、実験が設定された日に新鮮に調製してください。MHの密度(1.47 g / mL)に基づいて、滅菌15 mLチューブ内のMHの適切な量を秤量し、滅菌Mueller Hintonブロスを適量加えます。チューブを温水に入れ、必要に応じて反転させてMHを再懸濁します。
2. 10 mL の Mueller Hinton ブロスに 10 μL の細菌培養物を加えて、滅菌済みの 15 mL チューブで一晩の細菌培養物を 1:1000 希釈 (約^{10 6} CFU/mL) で調製します。
   1. 希釈した培養物を使用して、各細菌種について3つのサンプルを調製します:未処理のコントロール、MH処理サンプル(最小阻害濃度、MIC)、および抗生物質処理サンプル( 黄色ブドウ球菌 のトブラマイシンまたは 緑膿菌 のメロペネム、MICで)。
   2. 希釈した細菌培養物、MH、および適切な抗生物質を 、表1および 表2に示されている容量のサンプルに加えます。
3. 未処理のサンプル0.1 mLと0.5 mLを滅菌マイクロ遠心チューブに移し、生存プレートカウント(ステップ5)と生/死染色(ステップ6)をそれぞれT = 0サンプルに移します。
   1. 未処理のコントロールサンプル、MH処理サンプル、および抗生物質処理サンプル(トブラマイシンまたはメロペネム)を、好気的条件下で37°Cの振とうインキュベーター(250 rpm)で24時間インキュベートします。未処理の T= 0 サンプルに対して、生存プレート数 (ステップ 5) および生/死染色 (ステップ 6) 技術を実施します。

5. バイタブルプレートカウント法によるサンプル中の培養可能細胞の決定(3日目-5日目)

1. 4日目に、24時間サンプルインキュベーション後、各サンプルを0.1 mLおよび0.5 mLをマイクロ遠心チューブに収集し、それぞれ生肉数および生/死染色(ステップ6)を行います。これらは T = 24 h サンプルになります。
2. T = 0 および T = 24 h のサンプルを採取した日に、生存プレート数サンプルを LB ブロスで 10 倍希釈して調製し、可算細胞数 (~25-150) を得ることにより、生存プレート数を LB ブロスで実施します。
   1. 希釈した各サンプル50 μLをLB寒天プレートの1/2に広げます。LB寒天プレートを好気性条件下で37°Cで24時間インキュベートします。
3. 翌日、インキュベーターからLB寒天プレートを取り出し、~25-150コロニーを持つ希釈プレートを特定します。プレート上のコロニーの正確な数をカウントし、コロニー形成単位(CFU)式(CFU/mL= #コロニーカウント/(ボリュームメッキ、mL)(希釈使用))を使用して、mLあたりの培養可能な細胞の数を決定します。
   注:T = 0サンプルは3日目に播種され、4日目に分析されます。T = 24 h のサンプルは 4 日目に播種され、5 日目に分析されます。

6. 生/死染色と蛍光顕微鏡法を用いたサンプル中の生存細胞の決定(3日目または4日目)

1. 細胞の浸透圧環境を良好に維持するための0.85%無菌NaCl、ピペット(P20、P200、P1000)、滅菌ピペットチップ、細菌の生/死染色キット、使い捨て血球計算盤など、生死染色に必要な材料を集めます。フルオレセインイソチオシアネート(FITC)フィルターセットを備えた蛍光顕微鏡を使用して、生細胞を染色するSYTO 9色素を検出します。
2. 以下の各生/死サンプルのそれぞれ0.5 mLに0.85% NaClを0.5 mLに加えます:すべての原液T = 0サンプル、原液T = 24時間MH、および抗生物質処理サンプル、および未処理の対照サンプルの1:1000希釈。
   1. すべてのサンプルの最終的な生細胞数に 2 を掛け、希釈した T = 24 時間の未処理コントロールに 1000 を掛けてください。サンプルごとに 1.5 μL の SYTO 9 と 1.5 μL のヨウ化プロピジウムを組み合わせ、各サンプルに 3 μL の混合物を加えます。サンプルを21°Cの暗所で15分間インキュベートします。
3. 染色した穏やかに混合したサンプル6 μLを使い捨て血球計算盤に移し、FITCフィルターと40倍対物レンズを備えた蛍光顕微鏡で観察します。血球計算盤のグリッド線と生きた緑色の細胞の両方を示す写真を撮ります。
   1. サンプルごとに 6 つのフィールドの緑のセルを数え、グリッドの寸法に注意して、体積あたりの緑のセルの数を計算できるようにします。
      注:現在の実験の磁場寸法は1.05 mm x 0.6 mm x 0.1 mmで、これは0.063 mm³ または6.3 x ^10-5 mLに相当します。mLあたりの生細胞数を取得するには、カウントした生細胞数を6.3 x ^10-5 mLで割り、次に2を掛けます(または、T = 24 h未処理のコントロールの場合は2000)。

7. 生存可能だが培養できない細胞(VBNC)の数の決定

注:生菌プレート数から得られた培養可能細胞数と生/死染色から得られた生細胞数を使用して、VBNCの数を決定します。

1. mLあたりの生細胞数から培養可能細胞数/mLを差し引いて、VBNCs/mLを計算します。
2. Wilcoxon マッチドペア検定を使用して、各処理の VBNC/mL または培養可能細胞/mL を生存細胞/mL と比較します。

結果

生存可能だが培養できない(VBNC)細菌の生命体は、抗生物質治療などのストレッサーによって誘発され、抗生物質耐性のために再発性感染症を引き起こします。MHは広域スペクトルの抗菌薬であり、耐性はほとんど検出されていないため、MHは従来の抗生物質よりもVBNCの誘導が少ないという仮説が立てられました。ここで説明した方法は、2つの創傷原因細菌、 黄色ブドウ球菌 と 緑膿菌によって形成されるVBNCを定量するために使用されました。VBNCの数は、生/死染色によって決定された生細胞の数から、生菌プレート数によって決定された培養可能な細胞の数を差し引いたものに等しくなります。 表3 は、 黄色ブドウ球菌 と 緑膿菌でそれぞれ検出されたVBNCの平均数と、示された時点と治療を示しています。これらの実験で直面する課題の1つは、生存細胞数が培養可能細胞数よりも少なく、VBNCの数がマイナスになることです。すべての培養可能な細胞は、繁殖してコロニーを形成する能力に基づいて生存可能です。これは、各処理で培養可能な細胞数が生細胞数と有意に異なるかどうかを判...

ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、MHおよび従来の抗生物質の最小阻害濃度(MIC)で処理された創傷原因細菌中のVBNC細胞集団の検出を可能にする。プロトコールの重要なステップには、実験当日のMH希釈液の調製、生/死染色中のサンプル損失の防止、分析量の正確な計算が含まれていました。この研究および他の研究のために、 黄色ブドウ球菌 および 緑膿菌 のMH MICが実験的に決定された²⁷。1%〜20%MHのMHパーセンテージをテストするために、実験で使用した培地で25%または50%のストック溶液を作製しました。興味深いことに、希釈したサンプルが経年劣化するにつれて、その有効性はわずかに増加し、MICが減少しました(Carlson、未発表の観察結果)。100%MHの年齢は、その有効性に影響を与えないように見えましたが、これは慎重にテストされていませんでした。MHの有効性のばらつきを避けるため、実験当日に25%希釈液と50%希釈液を調製しました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ミューラーヒントンブロス	フィッシャーバイオ試薬	B12322
ルリアベルタニ(LB)ブロス	Fisher Bioreagents	BP142602
BD Difco 寒天	Fisher Scientific	DF0812-07-1
塩化ナトリウム	Sigma	S3014-500g
メロペネム	TargetMol	T0224
トブラマイシン	セレック ケミカルズ	S2514
黄色ブドウ球菌	ATCC	ATCC29213
緑膿菌	ATCC	ATCC9721
振盪インキュベーター	エッペンドルフ	M13520000
インキュベーター	ベンチマークサイエンティフィック	H2200-H
マヌカガード マヌカハニー	アマゾン	NA
DMIL倒立型蛍光顕微鏡	ライカマイクロシステムズ	11521265
デジタルカメラ	ライカマイクロシステムズ	12730522
15 mL ファルコンチューブ	ジェネシーサイエンティフィック	28-103
血清ピペット	ダイグノシン	DP-LB0100005、DP-LB010010
ピペットエイド ピペット	ドラモンド・サイエンティフィック・カンパニー	4-000-101
ブンゼンバー	フィッシャーサイエンティフィック	S48108
レイニンピペット	Pipette.com	L-20, L-200, L-1000
バランス	メトラー・トレド	XS603S
96ウェルプレート	ファルコン	351172
接種ループ	フィッシャーサイエンティフィ	13-104-5
イソプロパノール	フィッシャーサイエンティフィック	BP2618-1
ガラススプレッダー	自家製	NA
細菌用生死染色キット	Invitrogen	L7012
マイクロチューブ	Biologix Research Company	SKU 80-1500/P80-1500
錫箔	コストコ	NA
フィギュア作成ソフト	GraphPad	NA	GraphPad Prismは、フィギュア作成と統計分析に使用しました。