方法論記事

アテローム性動脈硬化症における大動脈組織の三次元イメージング

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DOI:

10.3791/67400

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2024年10月25日

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1Division of Vascular Surgery, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 2Institute for Cardiovascular Prevention (IPEK), Ludwig-Maximilians-University, 3Institute of Precision Medicine, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 4German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich Heart Alliance

この記事について

サマリー

ここでは、マウス大動脈を3次元(3D)で画像化するために最適化された組織透明化プロトコルを紹介します。私たちは、アテローム性動脈硬化症プラークを持つ末梢神経系の解剖学的近接性とアテローム性動脈硬化症の到来を定義することを目的として、免疫染色、光学クリアリング、およびイメージングのための最先端の手順を描写します。

要約

近年の研究により、動脈硬化症は、動脈壁の3つの層すべて(内膜プラーク、中膜、動脈の外側結合組織コートを形成する外膜)が関与する経壁性慢性炎症性疾患としての理解が進んでいます。私たちの最近の研究では、外膜は末梢神経系によってすべての組織細胞に到達するための導管として使用されていることが示唆されています。また、末梢神経系、すなわち感覚神経系と交感神経系は、アテローム性動脈硬化プラークに隣接する軸索ネットワークの新生に関与する主要なリモデリングプロセスを経ていることを発見しました。この文脈では、ニューラルネットワークの構造と、それが疾患動脈の血管成分と相互作用を理解することは、心血管疾患の病因をよりよく理解するための大きな期待を秘めています。これらの目標を達成するためには、無傷の健康な動脈と病気の動脈の細胞内構造を、それらを取り巻く血管周囲コンパートメントとともに視覚化する方法が必要です。ティッシュクリアリングにより、他の方法ではアクセスできない大きな組織コンパートメントの無傷の深部組織イメージングが可能になります。ラベリング、クリアリング、高度な顕微鏡イメージング、画像処理ツールの統合により、無傷の動脈の体積イメージングが可能になります。ここでは、水性ベースの2、2-チオジエタノール(TDE)クリアリングと、マウス全体の孤立した大動脈セグメントまたは大動脈全体のin-situをイメージングするための、水性ベースの2、2-チオジエタノール(TDE)クリアリングと溶媒ベースの免疫標識対応3次元イメージング臓器(iDISCO)クリアリングの2つの異なる、しかし補完的な受動的組織クリアリングアプローチについて説明します。

概要

組織学的手法は、組織/臓器の切片化を通じて生物学的サンプルの基本的な理解を提供します。しかし、複雑な解剖学的細胞/細胞および組織/組織の相互作用を3次元(3D)で描写することは、最近まで困難でした。このアンメットニーズは、健康な状態と病気の状態にある心血管系の文脈で特に明らかでした。無傷の組織のイメージングは、光の吸収と光散乱により、本質的に不透明であるため、これまで困難でした。組織透明化は、これらの制限を最小限に抑えることにより、無傷の生体サンプルを透明にします。近年の組織透明化技術の開発により、切片化されていない透明組織の高解像度3Dイメージングが可能になり、マイクロメートルの解像度で臓器全体の細胞および構造マイクロアーキテクチャに関するかなりの洞察が得られ、解剖学的接続ネットワークの定義が可能になりました。

アテローム性動脈硬化症は、内膜層、中膜層、および外膜膜と呼ばれる外側結合組織層を含む動脈壁の3つの層に関与します。動脈の内層にあるアテローム性動脈硬化症プラークは、何十年にもわたって従来の研究対象でした1,2。しかし、外膜層には、末梢神経系の血管、リンパ管、神経線維が含まれています。さらに、外膜は、末梢神経や血管周囲神経節などの血管周囲脂肪組織および神経組織成分に関連しています3,4。末梢神経は、外膜を遠くの標的組織、さらには細胞に到達するための導管として使用することが知られています5。近年の研究は、免疫系、神経系、循環器系などの主要な生体システムの重層的な相互作用の理解を前進させています。これらの相互作用を神経免疫-心血管-界面6,7と名付けました。アテローム発生中、動脈壁コンポーネントは堅牢な再構築とリモデリングを受けます。例えば、アテローム性動脈硬化性プラークの進行に隣接して、内膜では免疫細胞凝集体が形成され、マウス大動脈外膜ではニューロン軸索新生が起こる6,8,9。アテローム性動脈硬化症が進行すると、免疫細胞凝集体は、T細胞、B細胞、および形質細胞領域が明確な、よく構造化された動脈三次リンパ器官(ATLO)に発達します10。しかし、これらの変化を3Dで描写するためには、膜透過が不十分で、光散乱が特在するため、無傷の組織の高解像度イメージングが困難であった11。組織透明化アプローチは、屈折率(RI)を均一に調整することにより、抗体の浸透を強化して無傷の組織または臓器の深部に到達することにより、従来の組織学アプローチ11,12,13,14,15の主要な制限を克服し、ボクセルのイメージング深度が高いマイクロメートルスケールの解像度の画像をもたらしました。サンプルのRIは、グリセロール(RI 1.46)または浸漬油(RI 1.52)のいずれかに一致させることができるため、光散乱や球面収差が大幅に低減され、高分解能が可能になります。水性ベースの2,2-チオジエタノール(TDE)や免疫標識対応の溶媒除去臓器の3Dイメージング(iDISCO)など、臓器全体または全身組織透明化技術の最近の進歩は、体積イメージング技術(共焦点顕微鏡、多光子顕微鏡、ライトシート顕微鏡イメージングを含む)とともに、それらの接続性アトラスを構築することにより、血管構造の微小解剖学的構造の再構築を可能にしました11,16.これらの細胞と構造のつながりを3Dで視覚化することで、これまで答えられなかった生物学的な疑問に答えるための新たな洞察を得ることができます。

プロトコル

本研究は、地域および国の動物使用およびケア委員会のガイドラインに従って実施されました。本研究では、老化中にアテローム性動脈硬化症を自発的に発症する標準的なげっ歯類の食事で維持されたC57BL/6Jバックグラウンドの高脂血症雄Apoe-/- マウスを使用しました。

1. 孤立した大動脈のホールマウントイメージングとTDEクリアリング

  1. ティッシュの準備
    1. マウスあたり150 mg / kgのケタミンと30 mg / kgのキシラジン( 材料の表を参照)で麻酔薬を準備します。.マウスに腹腔内注射で深く麻酔をかけ、深部疼痛試験に対する反応がないことを確認した。
      注:注射の濃度と量は次のとおりです:ケタミン100 mg / mL;キシラジン20 mg / mL;注入量 50:50 ケタミンとキシラジンの 3 μL/g の混合物。
    2. マウスを外科用ペーパータオルで覆われたフォームプレートに置き、テープで腕と脚を仰臥位に固定します。75%エタノールで胸部を消毒し( 材料の表を参照)、1mLの使い捨て注射器で左心室から血液を採取して血液を取り出し、より良い灌流を実現します。
      注:開胸術による心臓採血も使用できます。
    3. 胸部に正中線を切開して心臓を露出させ、右心房に小さな切開を行って経心臓灌流を可能にします。左心室を介してマウスに5 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA; 材料表を参照)10 mLをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で5分間灌流し、続いてPBS20 mLを5〜10分間血液が洗い流されるまで灌流します。最後に、10 mLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)で20分間灌流します。
      注:すべての手順は、室温(RT)で100〜125mmHgの圧力で蠕動灌流ポンプで実行できます。灌流針は、採血と同じ穴からマウスの心臓に挿入されます。
    4. 手術器具を使用して、脾臓、肝臓、肺、胃腸および生殖器官などの内臓を切除します。心臓、大動脈、腎臓を そのままの状態に保ちます。
      注:臓器の解剖と除去に使用される手術器具は、解剖はさみ、細い虹彩はさみ、ばねはさみ、鈍い鉗子、湾曲した鉗子、および湾曲した細い鉗子です。
    5. 上行大動脈から腸骨分岐部までの大動脈全体を解剖実体顕微鏡(30〜40倍)で露出させます。大動脈を傷つけることなく、胸腺と脂肪組織を慎重に取り除きます。
      注:大動脈を切らないように注意してください。Apoe-/- マウスの場合、接続された構造のために大動脈の最小限の囲まれた血管周囲脂肪組織を維持します。
    6. 大動脈全体をPBSで満たされたペトリ皿に収穫します。大動脈を異なるセグメントに分離し、虹彩またはスプリングハサミを使用して大動脈全体を縦に分割し、 図1A に示されている順序と方向に従って内膜表面を露出させ、TDEクリアリングを行います。
    7. 図1Aに示すように、正面大動脈を平らな黒いワックスプレートにY字型に固定します。4% PFAに4°Cで一晩ポストフィックスします。
      注:次の手順で折りたたまれたりカールしたりしないように、固定する前に大動脈をワックスプレートに固定します。
    8. 大動脈のピンを外し、PBSに移します。大動脈を5分間5回よく洗います。
      注:大動脈をPBSで満たされた異なるチューブに毎回移して洗浄します。
  2. 顔面大動脈の抗体染色
    注:すべてのインキュベーションステップは、2 mLのセーフロックチューブで、RTで穏やかに回転または振とうしながら行います。
    1. 固定された大動脈をブロッキング溶液に2時間移し、ブロッキングと透過化を行います。
      注:ブロッキング溶液は、一次抗体と二次抗体によって異なります。例えば、ブロッキング溶液:0.5 mg/mL CD16/32(1:100)、10%正常ロバ血清、2% Triton X-100 in PBS( 材料の表を参照)
    2. 上記のブロッキング溶液(ステップ1.2.1)、例えばCD3e(1:100希釈)、NF200(1:200希釈)、B220(1:200希釈)で一次抗体と大動脈を24時間インキュベートします( 材料の表を参照)。大動脈をPBSで5分間5回洗浄します。
    3. 10%正常ロバ血清(1:300希釈)および4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI;1 mg/mL)中の二次抗体と大動脈をインキュベートし、一晩核染色します( 材料表を参照)。大動脈をPBSで5分間5回洗浄し、組織透明化手順まで大動脈をPBSで4°Cで保存します。
      注:大動脈をPBSで満たされた異なるチューブに毎回移して洗浄します。チューブをアルミホイルで覆い、手順1.2.3の暗闇に保ちます。
  3. TDE組織クリアリング
    注:すべてのインキュベーションステップは、室温で静かに回転する2 mLのセーフロックチューブで行い、暗所でアルミホイルで覆います。TDE( 材料表を参照)の作業溶液は透過性が高いため、ドラフト内で慎重に取り扱う必要があります。廃棄物は、地域の規制に従って収集および廃棄してください。
    1. 染色した大動脈を20%TDE作業溶液に移し、1時間インキュベートします。
    2. 大動脈を47%TDE作業溶液に移し、12時間インキュベートします。大動脈を60%TDE作業溶液に移し、サンプルが可視光でRIに一致するように透明になるまで24〜36時間インキュベートします。
    3. 大動脈を暗闇のRTで60%TDEで保存し、イメージングするまで保管します。
      注:短期間のインキュベーション(例:ample、ステップ1.3.1)の場合は30分ごとに、長期のインキュベーションの場合は4時間ごとに作業溶液を更新します(例:ample、ステップ1.3.2)。各ステップのインキュベーション時間は、組織のサイズに応じて調整でき、抗体の浸透性や透明化を向上させることができます。脂肪組織に囲まれたApoe-/- マウス大動脈の場合、インキュベーション時間を適切に延長する必要があります。
  4. 共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)を用いた大動脈除去TDEのイメージング
    1. 厚さ0.2 mmの市販の両面粘着性長方形イメージングスペーサーウェルを使用してください( 材料表を参照)。きれいなスライドガラスにウェルを貼り付け、きれいになった大動脈を移します。 顔面 大動脈外膜がカバーガラスに面していることを確認してください。
      注:角度のある鉗子を使用して、顔面大動脈の腌側を上部にして、顔面大動脈を平らに軽くたたきます。必要に応じて、組織サイズに合わせて複数のイメージングスペーサーウェルを積み重ねます。
    2. 60% TDE溶液を滴下して大動脈を取り付けます。サンプルとカバースリップの間に気泡が入らないように、カバースリップをウェルに慎重に取り付けます。
      注意: カバースリップの前に針で気泡を慎重に取り除きます。サンプルが浮遊する可能性があるため、過剰な量の実装液は使用しないでください。
    3. 20倍液浸(マルチ)対物レンズ(NA:0.75)を装備した倒立CLSM装置( 材料の表を参照)を使用します。
      注:CLSMは、大動脈外膜における神経径と神経免疫細胞相互作用の分析に必要な、より高い解像度で最大70μmの深さの体積イメージングを可能にします。
    4. 20x/0.75 immersion (oil) 対物レンズを選択します。染色された色素に基づいてハイブリッドダイオード検出器を調整します。表示設定を調整し、1024 x 1024ピクセルのXY形式を選択してイメージングします。
      注:油浸対物レンズのキャプチャは、水よりも信号が優れています。
    5. 浸漬油(グリセロールを含む)をカバーガラスの大動脈に沿って均等に滴下します。63x対物レンズをサンプルに向かって粗く動かし、液浸油/カバースリップに触れます。
    6. 63倍対物レンズを顕微鏡下で細かく動かし、関心領域を特定します。3Dイメージングのために、2〜4μmのステップサイズから最大60μmの深さで 、顔面 大動脈の外膜側からZスタックを取得します。
    7. サンプルの詳細を含むファイルに名前を付け、詳細をスキャンして、データを保存します。
  5. 多光子顕微鏡を用いたTDE除去大動脈のイメージング
    1. 手順1.4.1〜1.4.2に従って、 スライドに正面 大動脈を取り付けます。
    2. 20倍対物レンズ(水浸、NA:1.00、作動距離= 2 mm)を備えた直立多光子顕微鏡( 材料の表を参照)を使用すると、最大1.5mmの深さの体積イメージングが可能になります。
    3. 10-15 μmステップサイズから最大700 μmの深さまで、管側からZスタックを取得します。ファイルに名前を付け、手順 1.4.7 のようにデータを保存します。

2. 全身免疫染色とiDISCO組織透明化

  1. ティッシュの準備
    1. 上記の手順1.1.1〜1.1.3に従って、麻酔、マウスの固定、および灌流を行います。
    2. 手術器具を使用して、脾臓、肝臓、肺、胃腸および生殖器官などの皮膚と内臓を切除します。心臓、大動脈、腎臓を そのままの状態に保ちます。
    3. 横隔膜レベルより上の体部分を解剖し、下半身を4%PFAで4°Cで1〜2日間固定します。
      注:50mLチューブでの固定、洗浄、およびインキュベーションを、穏やかに回転するシェーカーで行います。新しいチューブで溶液を2〜3回リフレッシュします。
    4. サンプルをRTで10分間3回十分に洗浄します。
      注:大動脈を毎回PBSで満たされた異なるチューブに移します。
    5. サンプルを20%透明で遮るもののない脳/体イメージングカクテルおよび計算分析(CUBIC)溶液で48時間インキュベートして脱色します。
      注:20%CUBIC溶液の場合、25 gの尿素を15 mLのTriton X-100と28 mLのQuadrolに溶解し、PBSを最終容量の100 mLに加えます。.材料が刺激的であるため、フードで準備します( 材料の表を参照)。
    6. サンプルをRTのPBSで1時間5回十分に洗浄します。
  2. 抗体染色
    注:すべてのインキュベーションステップは、50 mLのセーフロックチューブで、4°Cで穏やかに回転または振とうして行います。
    1. サンプルをPBS-ゼラチン-Triton X-100-serum(PGST)溶液で一晩インキュベートし、透過処理とブロッキングを行います。
      注:ブロッキング溶液は抗体によって異なります。例えば、ブロッキング溶液:PBS-ゼラチン-Triton X-100-血清(PGST、 材料の表を参照)溶液:0.2%ブタ皮ゼラチン、0.5%Triton X-100、およびPBS中の5%ヤギ血清。
    2. サンプルを一次抗体とPGST溶液、例えばNF200(1:200希釈、 材料表を参照)で4°Cでインキュベートし、10〜12日間静かに振とうします。次に、サンプルをPGSTでRTで1時間5回完全に洗浄します。
    3. サンプルを二次抗体溶液(希釈率1:300)およびDAPI(1 mg/mL)とPGSTで4°C、7日間インキュベートします。
    4. サンプルをPGSTで1時間5回RTで十分に洗浄し、サンプルをPBSに移し、大動脈をPBSで4°Cで保存します。
      注意: チューブをアルミホイルで覆い、手順2.2.3〜2.2.4の間、チューブを暗く保ちます。
  3. 改変 iDISCO 組織透明化
    注意: クリアリング中は、直接の自然光/人工光への曝露による信号の漂白/消光を避けるために、チューブをアルミホイルで覆う必要があります。ディスコの清算に使用されるすべての有機試薬は有害であり、すべての清算手順はドラフト内で行う必要があります。試薬を取り扱うときは、吸入や皮膚や目との接触を避けるために、白衣、手袋、マスクを着用してください。クリアリング廃棄物を収集し、フード内の適切な廃棄物容器に捨てます。
    1. ステップ2.2.4で染色したサンプルを、脱水用のテトラヒドロフラン(THF、 材料表参照)の一連の高濃度の作業溶液、つまり50%、70%、90%、および100%(100%の2倍)に移します。濃度あたり12時間インキュベートします。
      注:THF試薬(99%-100%)を蒸留水で希釈して、フード内のさまざまな濃度の作業溶液にします。作業中のソリューションを6時間ごとに更新します。
    2. サンプルを絶対ジクロロメタン(DCM、 材料表を参照)溶液に3時間移し、脂質を除去します。
    3. サンプルをRI適合ベンジル-アルコール-ベンジル-安息香酸(BABB)ワーキング溶液に移します( 材料の表を参照)。組織が半透明になり、可視光線でほとんど透明になるまで、3〜6時間インキュベートします。
      注:BABBワーキングソリューションを調製するには、ガラス瓶にベンジルアルコール1部と安息香酸ベンジル2部(1:2)を混合します。フードの中で5分間静かに振ってください。
  4. ライトシート顕微鏡によるiDISCO透明組織のイメージング
    注:最適な透明度が達成されたらすぐに、クリアされたサンプルを画像化します。イメージングには、Ultramicroscope-II( 材料表参照)などのライトシート顕微鏡を使用します。イメージングリザーバーに最終的なクリアリング溶液であるBABB溶液を充填します。機器の損傷を防ぐため、BABBを機器にこぼさないように注意してください。
    1. サンプル全体の幅全体をカバーする低倍率の画像には、1倍のエア対物レンズを使用します。透明化溶液からサンプルを紙布にそっと移し、まもなく乾かします。
      注:鈍い鉗子を使用して、サンプルを圧迫しないようにします。
    2. サンプル/組織のサイズに基づいて適切なサイズのサンプルホルダーを選択し、サンプルの裏側を瞬間接着剤でサンプルホルダーに取り付けます。
      注:サンプルがサンプルホルダーにしっかりと取り付けられるまで1〜2分待ちます。
    3. ライトシート顕微鏡のイメージングリザーバーにBABB溶液を充填し、サンプルをそっと入れます。サンプルホルダーを調整して、サンプルがライトシートに対して垂直になり、適切に照らされていることを確認します。
    4. 対物レンズを下げてサンプルに焦点を合わせ、フォーカスを合わせながら表示設定を調整します view適切に viewファイル。顕微鏡ソフトウェアで適切なライトシートを選択し、視野全体を均一に照らすように幅を調整します。
      注:両面レーザー照明を備えた超顕微鏡システムでは、レーザーを片側に位置合わせして焦点を合わせることから始めます。両面を設定したら、両面レーザーをアクティブにして、両方の照明からの合成スキャン画像を観察します。
    5. NF200で染色されたニューロン構造をイメージングするには遠赤チャネル(680 nm)を、未染色の大動脈および結合組織をイメージングするには自家蛍光チャネル(488 nm)を選択します。蛍光シグナルの強度に応じてレーザー出力を調整し、最適なS/N比、露光時間、およびライトシートの幅を確保します。
    6. x-y-z スキャン モードを選択します。zスタックスキャンを2〜8μmのzステップで設定し、サンプルの腹側と背側の表面をカバーするタイルスキャン(16ビット)の縦方向のy軸に沿って25%〜60%のオーバーラップを選択して、サンプルボリューム全体(深さ6〜8mmまで)をイメージングします。
    7. スキャンの日付、サンプル名、使用した抗体、対物レンズ、ズーム係数、zステップ、使用したレーザーなどの詳細情報をスキャンに名前を付けます。データを保存します。
    8. ズームイン機能で高倍率(2倍または4倍)に変更し、特定の身体領域を撮影します。
    9. 上記の2.4.4-2.4.7の手順でイメージングを行い、データを保存します。

3. 画像処理・解析

メモ: 処理には、高出力の処理ワークステーションが必要です。大量のイメージング(イメージあたり5〜100 GB)のため、処理後すぐにデータのバックアップを確保してください。

  1. CLSM画像と多光子画像の画像処理
    1. CLSMおよび多光子顕微鏡からのZスタックタイル画像を、Las X、Imaris(画像解析ソフトウェア)、またはFijiソフトウェアを備えた画像処理ワークステーションにロードして、3Dおよび2次元(2D)の視覚化、セグメンテーション、および定量化を行います。
    2. セルまたは構造のボリューム深度を色分けするには、画像復元ソフトウェア( 「材料の表」を参照)を使用して生の画像をデコンボリューションし、Las XまたはFijiで時間カラーコーディングを使用してデコンボリューションされたデータの最大強度投影を生成します。
  2. ライトシート画像の画像処理
    1. ZスタックタイルTIFF画像シリーズをフィジーソフトウェアにロードします。フィジーのステッチプラグインで画像をステッチし、ステッチされた画像をTIFF形式で保存します。
      注意: 必要に応じて、ステッチされた画像をLZW形式で圧縮して、さまざまなソフトウェアで高速に処理できるようにします。
    2. ステッチされた画像を3D視覚化ソフトウェア( 材料の表を参照)にロードして、画像をセグメンテーションします。x-y-z軸のニューロン構造と血管構造を手動でトレースします。小さな神経線維を手動でトレースするには、大動脈と神経節の間の神経線維の全経路に沿って、すべてのz平面でNF200+ 信号をピクセルごとに手動で選択します。
    3. 前処理された画像を画像解析ソフトウェア( 資料表を参照)にロードして、画像の生成、画像の2Dおよび3D視覚化を行います。
    4. 自家蛍光を使用して、画像解析ソフトウェアで大動脈と結合組織(リンパ節や筋肉を含む)をセグメント化します。画像解析ソフトウェアで別々の疑似色を適用して、大動脈壁やプラークなどの明確な大動脈セグメントを視覚化します。
    5. フィジーソフトウェアのコントラスト制限適応ヒストグラム均等化(CLAHE)機能を使用して、処理された画像の背景上のローカルコントラストを強化します。

結果

無傷の健康な大動脈と罹患した大動脈の微小解剖学的構造を実証し、アテローム性動脈硬化症のマウスモデルにおける免疫系、神経系、心血管系の間の物理的結合を明らかにするために、単離された大動脈のTDE除去とマウス全体のiDISCO除去という2つの補完的な組織透明化アプローチを使用しました(図1)。ホールマウント免疫染色後、 enface aortaを一連のTDEワーキングソリューションでクリアしました。RIは、最終ステップのTDE濃度に応じて1.4〜1.5に一致し、大動脈組織の体積を変えることなく大動脈組織の最適な透明性を実現します(図1A)。TDEクリアリングとは異なり、iDISCOのクリアリングプロトコルには、ホールマウント免疫染色前の脱色および透過化ステップが含まれ、その後、異なる化学溶媒を使用した脱脂および脱水、および1.56でのRIマッチングが含まれます(図1B)。iDISCOのクリアリングは、組織の縮小により、大きなサイズの組織やマウスの全身まで可視化することができます。

TDEクリアされた顔 面 大動脈全体の共焦点および多光子3Dイメージングは、内膜プラーク、外膜細胞性、外膜神経突起などの構造を可視化することができ、iDISCOクリアマウスのライトシートイメージングは、動脈樹、血管周囲脂肪組織、腎リンパ節、神経や神経節などの関連神経成分の可視化と再構築を可能にします(図1C)。)。例えば、TDEでクリアされたアテローム性動脈硬化性大動脈の共焦点イメージングでは、プラーク中の複数のCD3e染色T細胞が検出され、ATLOではNF200染色された直径の異なる神経線維の広範な新生が検出されましたが、TDEの多光子イメージングでは、老化したApoe-/- マウスのホールマウント病変腹部大動脈がクリアされ、ATLO内のB220陰性T細胞領域にNF200発現軸索の発芽の縄張り性が示されました(図2A)。).一方、マウス腹部全体を透明化したiDISCOのライトシートイメージングでは、大動脈と隣接する交感神経節との空間的関係が可視化されました。神経節から大動脈表面までの個々の軸索の3D画像セグメンテーションと追跡により、アテローム性動脈硬化症プラークに隣接する大動脈外膜に新たに形成されたNF200染色軸索を含む、強力なニューロン再構築が明らかになりました(図2B)。

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図1:試験のワークフロー。 (A) enに面した 大動脈の水性ベースのTDEクリアリング。(B)マウス全体の溶媒ベースのiDISCOクリア。(C)光学的にクリアされた孤立した大動脈またはマウス全体のサンプルの体積イメージングおよび画像処理. 3D。 この図は、Sun et al.17の許可を得て変更されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:TDEとiDISCOがクリアした組織の3D画像の例(A)顔面大動脈でTDEがクリアされた3D画像。上パネル:共焦点画像は、内膜プラークのCD3e + T細胞(赤、矢印)とアテローム性動脈硬化性大動脈外膜(ATLO)のNF200 +神経軸索(緑)を示しました。下段:78週齢の雄Apoe-/-マウスのATLOにおいて、NF200+神経軸索(緑、矢印)、B220+ B細胞(赤、白)、コラーゲン由来の第2高調波発生(SHG、白)が多光子画像で示されました。Sytox(青)とDAPI(青)は核を示しました。(B)iDISCOの3D再構成およびセグメント化された画像は、マウスの腹部全体を透明にしました。NF200+神経と軸索(矢印、緑)のライトシート3D再構成、セグメンテーション、トレース、および無傷の腹部大動脈の交感神経節(矢印)との空間的関係。白三角形は、アテローム性動脈硬化症のプラークに隣接して新たに形成された軸索を示しました。自家蛍光(自動)を使用して、大動脈とプラーク(シアン)や腎リンパ節(RLN、青)などの結合組織を画像化しました。CG、腹腔神経節、SycG、交感神経鎖神経節。この図は、Mohanta et al.6 および Sun et al.17 の許可を得て修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

アテローム性動脈硬化症は、動脈壁の3つの層すべてが関与する動脈の経壁性炎症性疾患と見なすことができます。さらに、動脈は血管周囲脂肪組織と神経組織に囲まれています。アテローム性動脈硬化症の進行中、これらの各組織は細胞的および構造的に大きな変化を受け、健康な動脈と病気の動脈を取り巻く無傷の組織への細胞内光学的アクセスを獲得する方法が必要です。これらの方法は、細胞間および細胞-組織の相互作用をよりよく理解し、心血管疾患の病因の理解を深めるためにここで提供されます。組織の透明化とそれに続く3D顕微鏡イメージングにより、これまでアクセスできなかった無傷の組織コンパートメントを大規模にイメージングし、動脈の詳細な再構築を明らかにすることができます。ここでは、TDEおよびiDISCO組織透明化技術のプロトコルを紹介し、ほぼ完全な組織透過性、共焦点/多光子顕微鏡またはライトシート顕微鏡による効率的なイメージング、および同時に構造的完全性の維持を実現する効果と簡便さを強調します。

TDEクリアリングは、水溶性試薬を用いてRIを調整することで組織の透明性を実現し、組織内の蛍光シグナルを効果的に保存します。これは、組織の収縮なしにマイクロメートルからミリメートルサイズの組織体積である、より小さなサイズの血管のための効率的な組織透明化方法を表しています。ただし、より大きな組織、つまりミリメートルからセンチメートルサイズの組織ボリュームの場合は、処理時間が長くなります。重要なことは、試薬の濃度とインキュベーション時間を調整することにより、この手順をユーザーのニーズに適合させることができることです。一方、iDISCOは一連の有機溶剤を使用して脂質と水分を除去するため、より大きな組織、臓器全体、またはマウス全体またはより大きなヒト組織の組織の透明性が向上します。処理時間が短く、大量の組織に適しているという独自の利点があります。しかし、それは透明化されたサンプルの収縮、蛍光シグナルの消光、脂質の除去につながるため、脂質が豊富なアテローム性動脈硬化組織の大きな制限となります。さらに、ライトシート顕微鏡は、共焦点顕微鏡や多光子顕微鏡とは異なり、マイクロメートルレベルで細胞内の詳細を視覚化したり、単一の軸索や他の血管細胞との接続などの小径のニューロンの投影を視覚化したりすることはできません。

血管神経支配は、アテローム性動脈硬化症の発症に重要な役割を果たします6,7,18。動脈樹に沿った末梢神経の分布とその変化を調査することは、疾患の進行を理解するのに役立ちます。その効率的な処理能力により、iDISCOはラットおよびマウス12,19,20,21のアテローム性動脈硬化症モデルにおける全血管ネットワークイメージングに一般的に使用され、高解像度の3次元画像を提供します。一方、TDEは、特定の神経マーカーの観察など、蛍光標識の保存を必要とする研究に適しており、それによって血管神経支配の微細構造と変化を正確に明らかにします6。TDEのクリアリングは収縮を伴わず、脂質をイメージングできるため、両方の組織クリアリングプロトコルが必要ですが、iDISCOは脱水と脱脂による組織の縮小につながります。さらに、修正されたiDISCOプロトコルは、ヒト心血管組織22,23の組織清澄化に使用することができる。どちらのクリアリング技術も、アテローム性動脈硬化症の動脈リモデリングを研究するための補完的な利点を提供します。両方の方法の長所を組み合わせることにより、アテローム性動脈硬化症の病理学的メカニズムについてより包括的で深い理解が達成される可能性があります。

開示事項

SKM、CJY、AJRHは、Easemedcontrol R &D GmbH and Co. KGの共同設立者です。

謝辞

この研究は、ドイツ研究財団(DFG)SFB1123/Z1、ドイツ心臓血管研究センター(DZHK)DZHK 81X2600282、およびSKMへのコロナ財団助成金(S199/10087/2022)によって資金提供されました。ERA-CVD(PLAQUEFIGHT)01KL1808およびEasemedcontrol R &D GmbH and Co. KGのAJRHへの政府助成金。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2,2'-チオジエタノール(TDE)Sigma 166782Clearing試薬
AmiraThermo Fisher Scientific3D可視化ソフトウェア。3D画像の手動セグメンテーションとトレースに使用される画像処理ソフトウェア
ベンジルアルコールシグマ W213713クリアリング試薬
安息香酸ベンジルΣB6630クリアリング試薬
CD16/32eBioscience14-0161-82ブロッキングソリューション
共焦点レーザー走査型顕微鏡 ライカマイクロシステムズTCS- SP8 3Xイメージングデバイスは、細胞内分解能で高い特異性を持つ無傷の生体組織または切片を多次元高解像度でイメージングします。
DAPIインビトロジェンD3571核マーカー
ジクロロメタン(DCM)Sigma 270997透明化試薬
パンブラックワックスの解剖 サーモサイエンティフィック S17432大動脈解剖と固定 
解剖実体顕微鏡ライカマイクロシステムズ Stemi 2000マウス臓器解剖
エタノール シグマE7023離脱 
エチレンジアミン四酢酸(EDTA)Roth 8040.1灌流バッファ 
フィジー (ImageJ, NIH)2Dおよび3D画像用のオープンソース画像処理ソフトウェア
Goat anti-Hamster IgG, Cy3Dianova 127-165-099二次抗体
ヤギ抗ウサギIgG, Alexa Fluor 680Thermo Fisher Scientific / InvitrogenA-21109二次抗体 
ヤギ抗ラットIgG、Cy5アノバ712-175-150二次抗体
ハムスター抗CD3e BDバイオサイエンス145-2C11 Pan-T細胞マーカー
Huygens ProfessionalScientific Volume Imaging、オランダバージョン19.10画像復元ソフトウェア。主に2Dおよび3D画像のデコンボリューションに使用される画像処理ソフトウェア
画像処理ワークステーションMIFCOM MIFCOM X5LeicaアプリケーションスイートX、フィジー、イマリスを含むすべての画像処理ソフトウェアを搭載した画像処理ワークステーションで、共焦点顕微鏡、多光子顕微鏡、ライトシート顕微鏡で取得した画像の後処理が
イマリスビットプレーンバージョン8.4画像解析ソフトウェア。3D画像の自動セグメンテーションに使用される画像処理ソフトウェア
インキュベーターとローテーター マーシャル・サイエンティフィック Innova 4230組織
クリアリング中のインキュベーションおよび回転装置 
iSpacerSunjin LabIS4020Rectangular well as the sample holder
KetamineLivistoAnesthetic
Leica Application Suite X (LAS-X) ライカマイクロシステムズバージョン3.5ライカ顕微鏡で取得した画像用画像処理ソフトウェア
光顕微鏡ライカマイクロシステムズDM LB明るいフィールドイメージング用イメージングデバイス
ライトシート  顕微鏡LaVision BioTechUltramicroscope II薄い光学切片の画像を迅速に取得することにより、光の少ない露出で大きな生体試料やマウス全体を高速かつ高解像度でイメージングするためのイメージング技術。
多光子顕微鏡ライカマイクロシステムズTCS-SP5II MP 傷で生存可能な生体組織を細胞内および分子レベルで長期間にわたって、サンプルの深部で最小限の浸潤で多次元かつ高解像度にイメージングするためのイメージングモダリティ。
通常のヤギ血清 SigmaG9023ブロッキング溶液
パラホルムアルデヒド(PFA) シグマ P-6148 固定 
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)Sigma P4417-100タブ 洗浄バッファー
豚皮ゼラチンSigma G1890インキュベーションバッファー
QuadrolSigma122262CUBICクリア試薬
ウサギ抗NF200ΣN4142汎神経マーカー
ラット抗B220 BDバイオサイエンスRA3-6B2Pan-B細胞マーカー
ショ糖シグマ 90M003524V 脱水症状 
SytoxThermo Fisher ScientificS11380核マーカー
トラヒドロフランシグマ 401757清算試薬 
トリトンX-100ロス 3051.1浸透
尿素シグマ U5128CUBICクリア試薬
キシレン フィッシャーケミカル x/0250/17 麻酔 
のダイ可能 無テ

参考文献

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アテローム性動脈硬化症における大動脈組織の三次元イメージング
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